李彥杰,劉仁華,周大祥,楊俊年,蔣夢(mèng)蕓,吳 巍,郭世浩,高 鑫

1 重慶三峽學(xué)院教師教育學(xué)院,萬(wàn)州 404100 2 重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,萬(wàn)州 404100

自三峽大壩175 m蓄水以來(lái),從大壩到其上游重慶江津地區(qū)的長(zhǎng)江兩岸形成了與天然河流漲落季節(jié)相反的干濕交替區(qū)域—三峽庫(kù)區(qū)消落帶[1-2]。環(huán)境的改變破壞了三峽庫(kù)區(qū)消落帶原有陸生植被生態(tài)系統(tǒng)多樣性,并隨之帶了如水土流失和農(nóng)業(yè)面源污染加重等諸多問(wèn)題[3-4]。三峽庫(kù)區(qū)消落帶生態(tài)環(huán)境治理的關(guān)鍵是恢復(fù)或重建消落帶植被生態(tài)系統(tǒng)。國(guó)內(nèi)學(xué)者從消落帶植被調(diào)查和適生植物篩選入手,發(fā)現(xiàn)消落帶野生香根草(VetiveriazizanioidesL.)、空心蓮子草(AlternantheraPhiloxeroides(Mart.)Griseb.)和狗牙根(Cynodondactylon(Linn.)Pers.)等植物在三峽庫(kù)區(qū)消落帶反復(fù)地出露與淹沒(méi)交替過(guò)程中能保持較高存活率,并指出上述適生植物可通過(guò)形態(tài)學(xué)發(fā)育及生理、生化指標(biāo)等變化以響應(yīng)水淹信號(hào),并在一定程度上對(duì)水淹環(huán)境表現(xiàn)出適生性[5- 9]。

狗牙根是三峽庫(kù)區(qū)消落帶原生植物,具有發(fā)達(dá)的根莖和匍匐枝,可固土護(hù)坡以防治水土流失。已有研究表明,狗牙根具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性,可在水淹等非生物脅迫中維持較長(zhǎng)存活時(shí)間,其主要適生性機(jī)制可能與其在脅迫環(huán)境中的氣生組織發(fā)育、提升細(xì)胞還原力及解毒能力等有關(guān)[10- 12]。水淹結(jié)束后,狗牙根也可耐受高氧環(huán)境而迅速恢復(fù)生長(zhǎng),因此在三峽庫(kù)區(qū)消落帶治理實(shí)踐中應(yīng)用廣泛[13-14]。目前關(guān)于狗牙根對(duì)水淹生境的適生性研究多集中在生理、生化水平,而對(duì)其通過(guò)哪些信號(hào)通路響應(yīng)水淹脅迫,并進(jìn)一步對(duì)哪些基因的表達(dá)做出調(diào)整以適應(yīng)水淹脅迫等研究未見報(bào)導(dǎo)。本研究以三峽庫(kù)區(qū)消落帶野生狗牙根為材料做水淹處理,通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,研究狗牙根在水淹生境下的轉(zhuǎn)錄水平變化及差異表達(dá)基因,以期加深對(duì)狗牙根在水淹生境下適生性的理解,并為植物的耐淹研究和三峽庫(kù)區(qū)消落帶治理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用野生狗牙根來(lái)自重慶市萬(wàn)州區(qū)譚紹村的三峽庫(kù)區(qū)自然消落帶。選取長(zhǎng)勢(shì)良好、均勻一致的當(dāng)年生分蘗苗隨機(jī)分為未水淹對(duì)照組(A1)和30 cm沉水處理組(A2)。準(zhǔn)備內(nèi)徑為42 cm,高度為22 cm的塑料桶,桶底打孔,墊塑料紗窗后以譚紹村自然消落帶濕潤(rùn)沙土裝填土層厚度至15 cm,分別將兩組樣品移栽至桶內(nèi)。處理組于2017年5月在譚紹村自然消落帶江邊(107°87′ E,30°35′ N)作30 cm沉水處理。處理組水淹15 d后可觀察到狗牙根的形態(tài)學(xué)變化,同時(shí)取兩組狗牙根幼嫩莖,沖洗后用液氮冷凍,并立即轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室作后續(xù)處理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 測(cè)序樣品的制備及測(cè)序

以Trizol法(RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue,TaKaRa)提取樣品的總RNA, Nanodrop分光光度計(jì)檢測(cè)樣品總RNA OD260/280在1.8—2.2之間,電泳檢測(cè)樣品總RNA無(wú)明顯降解且28 S條帶亮度高于18 S條帶1.5倍以上。用Oligo(dT)磁珠富集mRNA,加入打斷試劑在Thermomixer中將mRNA打斷成短片段,將打斷的mRNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA,末端修復(fù)后加A及測(cè)序接頭,然后進(jìn)行片段大小選擇,構(gòu)建文庫(kù),基于Illumina HiSeq 4000平臺(tái)測(cè)序。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

測(cè)序所得原始讀序(Raw Reads)經(jīng)過(guò)濾后得到純凈讀序(Clean Reads),使用Trinity軟件通過(guò)序列重疊得到重疊群(Contigs),并進(jìn)一步組裝成轉(zhuǎn)錄本(Transcripts),再使用Tgicl軟件進(jìn)行聚類去冗余得到Unigene。

使用 Blast分別對(duì)Unigene作核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)(nucleotide sequence database, Nt)、非冗余蛋白庫(kù)(non-redundant protein sequence database, Nr)、蛋白質(zhì)直系同源簇(cluster of orthologous groups of proteins, COG)、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)和瑞士蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(Swiss protein sequence database, Swiss-Prot)注釋,使用Blast2GO軟件及Nr注釋結(jié)果作GO(gene ontology)注釋,使用InterProScan5軟件作InterPro注釋。按照Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG數(shù)據(jù)庫(kù)優(yōu)先順序,選擇Unigene的最佳比對(duì)片段作為該Unigene的編碼序列(coding sequence, CDS),未能注釋的Unigene使用ESTScan工具作進(jìn)一步預(yù)測(cè)。使用 Bowtie2軟件將clean reads比對(duì)到Unigene,然后基于期望最大算法(RNA-Seq expression estimation by Expectation-Maximization, RSEM)計(jì)算各個(gè)樣品的基因表達(dá)水平?；诓此煞植挤?PossionDis)作差異表達(dá)基因分析,篩選標(biāo)準(zhǔn)為對(duì)比組樣品間表達(dá)倍數(shù)(fold change)≥2和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discover rate, FDR)<0.001；對(duì)差異表達(dá)基因作GO和Pathway功能分類及富集分析,功能和通路顯著富集篩選標(biāo)準(zhǔn)均為FDR≤0.01。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

隨機(jī)挑選4個(gè)差異表達(dá)基因,通過(guò)PrimerQuest Tool在線程序設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,并設(shè)置擴(kuò)增長(zhǎng)度為80—250 bp(表1)。以GAPDH基因作內(nèi)參,按照Ultra SYBR Mix Kit(康為世紀(jì)公司)提供的操作流程作實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qRT-PCR)擴(kuò)增。擴(kuò)增平臺(tái)為CFX connect Q-PCR儀(Bio-Rad,美國(guó)),擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃保持10 min；95 ℃保持15 s,60℃保持1 min,設(shè)置40次循環(huán)。

表1 實(shí)時(shí)定量 PCR 選用基因及其引物

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果的評(píng)估及組裝

A1和A2組的Total Raw Reads分別為90.69 Mb和89.06 Mb,過(guò)濾后A1和A2 的Clean Reads分別為73.89 Mb和73.55 Mb。A1和A2的Clean Reads經(jīng)Trinity組裝分別產(chǎn)生200570和124076條轉(zhuǎn)錄本。A1和A2的轉(zhuǎn)錄本經(jīng)Tgicl聚類去冗余分別得到128031和83363條Unigene,總Unigene數(shù)目為147256。

2.2 Unigene的功能注釋

分別基于Nr、Nt、Swiss-prot、KEGG、COG、Interpro和GO數(shù)據(jù)庫(kù)作總Unigene注釋,結(jié)果如表2。7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)可解釋的Unigene數(shù)目為107263,占總Unigene數(shù)目的72.84%。Unigene可注釋到不同物種的數(shù)量由高到底依次為小米(Setariaitalica)、高粱(Sorghumbicolor)、玉米(Zeamays)和疫霉菌(Phytophthoranicotianae)。

按照Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG的優(yōu)先次序,得到94879條Unigene的CDS。未注釋的Unigene經(jīng)ESTScan預(yù)測(cè)得到8135條Unigene參考注釋。

2.3 差異表達(dá)基因分析

如表3所示,與未水淹對(duì)照組(A1)相比,水淹處理組(A2)共發(fā)現(xiàn)有28844條差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEG),其中11858條DEG上調(diào)表達(dá),16986條DEG下調(diào)表達(dá),上調(diào)表達(dá)變化倍數(shù)為1.18—14.03,下調(diào)表達(dá)變化倍數(shù)為1.45—11.52。DEG在Nr、Nt、Swiss-prot、KEGG、COG、Interpro和GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋數(shù)目分別為22160、25901、21413、22478、16063、18188和16439。

表2 Unigene功能注釋

Nr：非冗余蛋白庫(kù) non-redundant protein sequence database；Nt：核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù) nucleotide sequence database；Swiss-Prot：瑞士蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù) Swiss protein sequence database；KEGG：京都基因與基因組百科全書 Kyoto encyclopedia of genes and genomes；COG：蛋白質(zhì)直系同源簇 cluster of orthologous groups of proteins；InterPro：蛋白質(zhì)家族、結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù) integrated documentation resource for protein families, domains and functional sites；GO：基因本體數(shù)據(jù)庫(kù) gene ontology database

表3 狗牙根響應(yīng)水淹生境差異表達(dá)基因的數(shù)量及差異范圍

2.4 差異表達(dá)基因GO功能分析

GO分析可將DEGs分為生物過(guò)程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)三大功能類。由圖1可知,生物過(guò)程中的細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程、單生物過(guò)程、生物調(diào)節(jié)、刺激反應(yīng)和定位等是水淹生境下DEGs富集較多的種類；細(xì)胞組分中的細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞器、生物膜、細(xì)胞器組分和高分子配合物等是DEGs富集最多的種類；分子功能中的催化活性、結(jié)合劑活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、結(jié)構(gòu)分子活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、電子傳遞體活性和抗氧化活性等是DEGs富集最多的種類。通過(guò)GO分析可知,水淹生境下,狗牙根的代謝過(guò)程、調(diào)節(jié)過(guò)程、細(xì)胞及組分和抗氧化等途徑中的DEGs可能共同參與狗牙根對(duì)水淹脅迫的適生性響應(yīng)。

2.5 差異表達(dá)基因Pathway 功能分析

KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)將DEGs分為細(xì)胞過(guò)程(cellular processes)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)、遺傳信息處理(genetic information processing)、代謝(metabolism)和生物體系統(tǒng)(organismal systems)。這些通路中的轉(zhuǎn)錄、翻譯、碳水化合物的代謝和環(huán)境適應(yīng)等可能在狗牙根對(duì)水淹生境的適生性過(guò)程中發(fā)揮重要作用(圖2)。

KEGG通路富集共檢出103個(gè)信號(hào)通路參與狗牙根對(duì)水淹脅迫的響應(yīng)。按照富集程度從大到小,前10個(gè)顯著富集的信號(hào)通路如表4,其中Q值表示富集程度,它是統(tǒng)計(jì)推斷所得P值經(jīng)過(guò)FDR校正后的值,其值越小表示富集越顯著。富集結(jié)果顯示,狗牙根對(duì)水淹生境的響應(yīng)及適生性由眾多信號(hào)路通共同參與,其作用方式可能包括活化抗病因子、調(diào)整物質(zhì)代謝、上調(diào)光合效率、提升獲氧能力和提高還原力等。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

為了評(píng)估轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性,隨機(jī)挑選Unigene76585、Unigene78381、CL10569.Contig1和CL1401.Contig1等4個(gè)DEGs作qRT-PCR擴(kuò)增?；蛳鄬?duì)表達(dá)量F=2-△△Ct,其中△△Ct=(待測(cè)樣品的目的基因的Ct值-待測(cè)樣本的看家基因的Ct值)-(對(duì)照樣品的目的基因的Ct值-對(duì)照樣本的管家基因的Ct值),管家基因?yàn)镚APDH。以log2-ratio表示基于轉(zhuǎn)錄組和qRT-PCR檢測(cè)的基因表達(dá)量變化,其中l(wèi)og2-ratio=log2[處理組表達(dá)量/對(duì)照組表達(dá)量],設(shè)置3次重復(fù)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,兩種檢測(cè)方法的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.8490,P<0.01,表明基于轉(zhuǎn)錄組分析DEGs的表達(dá)結(jié)果較為可靠(圖3)。

圖1 DEGs的GO功能分類Fig.1 GO functional classification of DEGs1：生物粘附 Biological adhesion；2：生物相 Biological phase；3：生物調(diào)控 Biological regulation；4：細(xì)胞殺傷 Cell killing;5：細(xì)胞組分的組織和生物合成 Cellular component organization or biogenesis;6：細(xì)胞過(guò)程 Cellular process;7：發(fā)育過(guò)程Developmental process;8：發(fā)育 Growth;9：免疫系統(tǒng)過(guò)程過(guò)程 Immune system process;10：定位 Localization;11：移動(dòng) Locomotion;12：代謝過(guò)程 Metabolic process;13：多機(jī)體過(guò)程 Multi-organism process;14：多細(xì)胞組織過(guò)程 Multicellular organismal process;15：生物過(guò)程的負(fù)調(diào)控 Negative regulation of biological process;16：生物過(guò)程的正調(diào)控 Positive regulation of biological process;17：生物過(guò)程調(diào)控 Regulation of biological process;18：再生 Reproduction;19：再生過(guò)程 Reproductive process;20：刺激應(yīng)答 Response to stimulus;21：節(jié)律過(guò)程 Rhythmic process;22：信號(hào) Signaling;23：?jiǎn)我坏纳镞^(guò)程 Single-organism process;24：細(xì)胞 Cell;25：細(xì)胞連接 Cell junction;26：細(xì)胞部件 Cell part;27：細(xì)胞外外液 Extracellular matrix;28：細(xì)胞外外液組分 Extracellular matrix part;29：細(xì)胞間區(qū)域 Extracellular region;30：細(xì)胞間區(qū)域組分 Extracellular region part;31：高分子配合物 Macromolecular complex;32：膜 Membrane;33：膜組分 Membrane part;34：膜結(jié)合腔體 Membrane-enclosed lumen;35：核狀體 Nucleoid;36：細(xì)胞器 Organelle;37：細(xì)胞器組分 Organelle part;38：共質(zhì)體 Symplast;39：病毒體 Virion;40：病毒體組分 Virion part;41：抗氧化活性 Antioxidant activity;42：結(jié)合劑活性 Binding;43：催化活性 Catalytic activity;44：通道調(diào)節(jié)因子活性 Channel regulator activity;45：電荷載體活性 Electron carrier activity;46：酶調(diào)節(jié)活性 Enzyme regulator activity;47：鳥嘌呤核苷酸交換因子活性 Guanyl-nucleotide exchange factor activity;48：金屬伴侶活性 Metallochaperone activity;49：分子感應(yīng)器活性 Molecular transducer activity;50：核苷酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性 Nucleic acid binding transcription factor activity;51：營(yíng)養(yǎng)受體活性 Nutrient reservoir activity;52：蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性 Protein binding transcription factor activity;53：蛋白標(biāo)簽 Protein tag;54：受體活性 Receptor activity;55：結(jié)構(gòu)分子活性 Structural molecule activity;56：轉(zhuǎn)運(yùn)因子活性 Transporter activity

圖2 DEGs的KEGG功能分類Fig.2 KEGG functional classification of DEGs1：轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝 Transport and catabolism；2：膜轉(zhuǎn)運(yùn) Membrane transport；3：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) Signal transduction；4：折疊、分選和降解 Folding, sorting and degradation；5：復(fù)制和修復(fù) Replication and repair；6：轉(zhuǎn)錄 Transcription；7：翻譯 Translation；8：氨基酸代謝 Amino acid metabolism；9：其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成 Biosynthesis of other secondary metabolites；10：碳水化合物代謝 Carbohydrate metabolism；11：能量代謝 Energy metabolism；12：多聚糖生物合成與代謝 Glycan biosynthesis and metabolism；13：脂質(zhì)代謝 Lipid metabolism；14：輔助因子和維生素代謝 Metabolism of cofactors and vitamins；15：其他氨基酸代謝 Metabolism of other amino acids；16：萜類和酮類化合物的代謝 Metabolism of terpenoids and polyketides；17：核苷酸代謝 Nucleotide metabolism；18：環(huán)境適應(yīng) Environmental adaptation

通路Pathway差異表達(dá)基因數(shù)目(占比/%)Number of DEGs (percentage/%)Q值Q-value通路編號(hào)Pathway ID植物-病原物互作Plant-pathogen interaction2272 (9.85)7.433673E-96ko04626RNA運(yùn)輸RNA transport3067 (13.3)6.049174E-59ko03013mRNA監(jiān)視mRNA surveillance pathway2601 (11.28)1.197697E-53ko03015光合作用Photosynthesis106 (0.46)1.081199E-09ko00195光合天線蛋白Photosynthesis-antenna proteins44 (0.19)1.158267E-09ko00196植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)Plant hormone signal transduction721 (3.13)7.461203E-09ko04075卟啉和葉綠素代謝Porphyrin and chlorophyll metabolism170 (0.74)2.952624E-08ko00860光合作用碳固定Carbon fixation in photosynthetic organisms336 (1.46)1.914865E-07ko00710核糖體Ribosome993 (4.31)1.623489E-06ko03010花青素生物合成Anthocyanin biosynthesis40 (0.17)6.075180E-06ko00942

圖3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證Fig.3 Verification of RNA-seq by Real-time qRT-PCR

3 結(jié)論與討論

在水淹、干旱和鹽堿等非生物脅迫生境下,植物可通過(guò)調(diào)整轉(zhuǎn)錄和翻譯水平而在一定程度上表現(xiàn)出對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。光線不足、缺氧或厭氧是深水淹脅迫中影響植物生長(zhǎng)的兩種主要因素。光線不足使得植物的光合作用受阻,從而限制了植物生長(zhǎng)所需能量和物質(zhì)的累積。氧氣不足使得植物由有氧呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)氧呼吸,除了抑制呼吸鏈而降低能量產(chǎn)生外,其也可產(chǎn)生乙醇等不完全氧化產(chǎn)物從而誘發(fā)細(xì)胞毒性[15- 17]。植物對(duì)水淹的響應(yīng)較為復(fù)雜,通常涉及多個(gè)信號(hào)通路—既包括對(duì)光合作用、物質(zhì)代謝和抗氧化等過(guò)程的適生性調(diào)整,也包括不定根及其他通氣組織等形態(tài)的適生性發(fā)育[18- 21]。

本研究以篩選的三峽庫(kù)區(qū)消落帶適生狗牙根作水淹處理,通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)狗牙根在水淹環(huán)境下共有28844條差異表達(dá)基因(DEGs),其中11858條上調(diào)表達(dá),16986條下調(diào)表達(dá)。GO功能分析顯示,水淹脅迫下狗牙根DEGs主要富集在生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞成分組織或組分合成、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性等方面,這些DEGs共同參與了植物對(duì)水淹的響應(yīng)和適生性發(fā)育,從而維持植物個(gè)體存活。進(jìn)一步KEGG富集分析顯示,狗牙根對(duì)水淹生境響應(yīng)的DEGs來(lái)自103個(gè)信號(hào)通路,其中參與眾多信號(hào)通路的乙烯、氧氣和脫落酸(abscisic acid, ABA)等分子可能通過(guò)對(duì)碳水化合物代謝和適生性發(fā)育等過(guò)程中多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的調(diào)整而實(shí)現(xiàn)植物對(duì)水淹生境的快速響應(yīng)[22-23]。 RNA的成熟和從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)是蛋白質(zhì)翻譯的基礎(chǔ),KEGG富集顯示,RNA轉(zhuǎn)運(yùn)(RNA transport)通路中外顯子拼接復(fù)合體(exon junction complex, EJC)和核轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物(nuclear export complex, NEC)等途徑多個(gè)組分下調(diào),即水淹生境降低了RNA的成熟及向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。RNA監(jiān)視通路(RNA surveillance pathway)是檢測(cè)和降解異常mRNA的控制途徑,KEGG富集顯示,該通路中多個(gè)參與mRNA降解的組分水平上調(diào)。核糖體(Ribosome)信號(hào)通路涉及翻譯的起始識(shí)別、延伸和終止等過(guò)程,富集顯示,該通路中的延伸因子ET-Tu等組分水平下調(diào)倍數(shù)較大。由上述3種信號(hào)富集結(jié)果可知,狗牙根對(duì)水淹的響應(yīng)和適生性總體表現(xiàn)為通過(guò)調(diào)整細(xì)胞核RNA轉(zhuǎn)錄、mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞質(zhì)mRNA降解和翻譯等途徑中多個(gè)因子的水平從而下調(diào)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成,這與干旱、水淹等非生物脅迫中多種植物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平調(diào)節(jié)類似[24- 27]。

提高從環(huán)境中獲取氧氣的能力,也是水淹生境下植物的適生性機(jī)制之一。KEGG富集顯示,植物細(xì)胞對(duì)水淹生境的適生性與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(plant hormone signal transduction)通路有關(guān),該通路中的脅迫響應(yīng)信號(hào)、通氣組織形成與關(guān)閉和組織發(fā)育等途徑中多個(gè)組分上調(diào)。水淹生境下,通氣組織的形成有利于提高植物從環(huán)境的獲氧能力而維持存活,但同時(shí)也使得細(xì)胞間結(jié)構(gòu)變得松散而可能導(dǎo)致個(gè)體死亡[28-29]。富集顯示,植物-病原互作(plant-pathogen interaction)信號(hào)通路中活性氧類(reactive oxygen species, ROS)和一氧化氮(nitric oxide, NO)的分子水平變化可能均與細(xì)胞壁的加固有關(guān),這是因?yàn)橹参镌谒偷确巧锩{迫下產(chǎn)生的ROS通過(guò)氧化交聯(lián)作用加固細(xì)胞壁,或通過(guò)下調(diào)NO信號(hào)途徑中NO水平而誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉以加固細(xì)胞壁[30- 33]。此外,植物在水淹生境可能發(fā)生生長(zhǎng)性損傷,富集結(jié)果也顯示,植物-病原物互作途徑中多個(gè)抗病信號(hào)分子水平上調(diào),推測(cè)這可能與狗牙根在水淹生境下受水體及水下土壤的微生物侵染而誘發(fā)對(duì)病原體的防御反應(yīng)有關(guān)。

完全水淹生境下,光線不足使得光合作用受限,同時(shí)某些代謝氧化產(chǎn)物的累積也可能對(duì)光合器官產(chǎn)生毒性。富集發(fā)現(xiàn),水淹生境下狗牙根通過(guò)上調(diào)光合作用(photosynthesis)、光合作用-天線蛋白(photosynthesis-antenna proteins)、卟啉與葉綠素代謝(porphyrin and chlorophyll metabolism)等3個(gè)信號(hào)通路中的抗氧化組分而保護(hù)光合器官。同時(shí),水淹生境下狗牙根也上調(diào)了參與上述信號(hào)通路中的光合作用進(jìn)程、光呼吸調(diào)控以及與天線蛋白、葉綠素合成有關(guān)的酶水平,這可能與提高光合效率及加速碳水化合物的累積有關(guān)[34- 36]。核酮糖- 1,5-二磷酸羧化酶(ribulose- 1,5-bisphosphate carboxylase, RuBisCO)在葉綠體中固定CO2而生成糖類,植物在水淹等非生物脅迫后通常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)RuBisCO活性下降而引起脅迫傷害[37]。本實(shí)驗(yàn)富集結(jié)果顯示,較淺水淹生境下狗牙根通過(guò)上調(diào)光合生物碳固定(carbon fixation in photosynthetic organisms)信號(hào)通路中RuBisCO水平而提高物質(zhì)累積。植物細(xì)胞中的酶和非酶抗氧化組分也參與對(duì)非生物脅迫的氧化應(yīng)激適應(yīng)性,其中非酶抗氧化組分如花青素、黃酮和類黃酮類等次生代謝產(chǎn)物可參與多種非生物脅迫環(huán)境中細(xì)胞氧化產(chǎn)物的清除[38-39]。富集結(jié)果顯示,水淹生境下,狗牙根細(xì)胞花青素的合成(Anthocyanin biosynthesis)信號(hào)通路中多個(gè)合成酶的表達(dá)水平上調(diào),提高了細(xì)胞內(nèi)的天竺葵素類、矢車菊素類、芍藥花苷配基類花青素和丙二?；咸K寧花色苷等水平,從而增加了狗牙根在水淹生境的氧化耐受性。

植物對(duì)水淹的響應(yīng)和適生性是一個(gè)包含多個(gè)信號(hào)通路中的眾多基因共同參與、相互協(xié)調(diào)的復(fù)雜過(guò)程。本研究對(duì)前期篩選的三峽庫(kù)區(qū)消落帶野生狗牙根在水淹生境下的轉(zhuǎn)錄組信息作了挖掘分析,為后續(xù)篩選狗牙根耐水淹關(guān)鍵調(diào)控基因和功能基因提供參考。此外,轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中還存在大量的未注釋序列,對(duì)其進(jìn)一步的分析挖掘?qū)⒂兄诩由钪参飳?duì)水淹響應(yīng)和適生性的理解。