鐘巧芳，李定琴，李維蛟，陳 越，柯 學(xué)，陳 玲，肖素勤，王 波，楊 久，程在全*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室/農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，云南 昆明 650223；2.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；3.云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；4.云南金瑞種業(yè)有限公司，云南 昆明 650214)

【研究意義】水稻(OryzasativaL.)是重要的糧食作物之一，是全球1/2以上人口的主食。稻瘟病是水稻上危害最嚴(yán)重的真菌病害，嚴(yán)重威脅著水稻的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)[1]。尤其云南省等西南粳稻生產(chǎn)區(qū)，每年稻瘟病發(fā)生面積都在133.3萬hm2以上，所造成的產(chǎn)量損失非常慘重[2]。使用化學(xué)農(nóng)藥雖然在一定程度上可控制該病害，但增加了農(nóng)民的生產(chǎn)成本，而且?guī)砹藝?yán)重的環(huán)境污染和生態(tài)失衡等問題。轉(zhuǎn)基因技術(shù)能突破生物種間障礙，實現(xiàn)物種間基因的轉(zhuǎn)移，為水稻的抗病育種帶來了新契機。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗稻瘟病基因?qū)朐耘嗟?，培育高抗性品種，是目前防控該病害最經(jīng)濟、有效和安全的途徑。【前人研究進展】水稻轉(zhuǎn)基因抗病育種成功與否，很大程度上依賴于有效的遺傳轉(zhuǎn)化方法的開發(fā)和應(yīng)用。目前水稻的轉(zhuǎn)基因方法以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法為主，利用該方法已成功獲得了一些優(yōu)良的抗病蟲轉(zhuǎn)基因水稻材料[3-8]。然而該轉(zhuǎn)化法主要依賴受體細胞的脫分化和再分化過程獲得轉(zhuǎn)基因植株，明顯地存在操作繁瑣且周期長、易發(fā)生體細胞變異、轉(zhuǎn)化植株常出現(xiàn)基因沉默、轉(zhuǎn)化效率低等缺陷[9-12]，這無疑是通過基因轉(zhuǎn)化進行水稻品種改良和功能基因組研究的極大障礙。真空滲透法(Vacuum infiltration)是一種無需經(jīng)過組織培養(yǎng)，只需對開花早期的活體植株抽真空處理即可直接獲得轉(zhuǎn)化種子的原位轉(zhuǎn)基因方法。與傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法相比，該方法具有簡便、快速、可靠、高效等優(yōu)點，為水稻等植物的基因轉(zhuǎn)化開辟了新途徑[11-13]。自1993年Bechtold等首次利用該法在擬南芥中成功轉(zhuǎn)化以來，隨后該方法在矮牽牛、豆科植物、棉花、白菜、芥菜、蘿卜、煙草、油菜、獼猴桃等多種植物上也實現(xiàn)了成功轉(zhuǎn)化[14-27]。此外，水稻的抗稻瘟病育種還面臨稻瘟病菌變異快、現(xiàn)有栽培稻抗源面窄和優(yōu)良抗源少等難題，從稻屬以外的生物中發(fā)掘新的抗稻瘟病基因具有重要意義。【本研究切入點】課題組前期從苦參塊根中分離克隆到一種對水稻稻瘟病菌(PiriculariaoryzaeCav.)具有明顯抑制作用的凝集素蛋白(Sophora flavescens Lectin，SFL)基因[28]，該基因的表達可以提高水稻對稻瘟病的抵御能力，可作為一個新的抗稻瘟病基因源進行發(fā)掘和利用。真空滲透法無需組培過程，具有簡便、快速、高效等優(yōu)點，但目前該法在水稻遺傳轉(zhuǎn)化上的應(yīng)用研究未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】首次應(yīng)用真空滲透法，將苦參凝集素蛋白基因SFL轉(zhuǎn)入云南粳稻品種‘云資粳41號’，獲得抗稻瘟病能力提高轉(zhuǎn)SFL基因水稻材料，建立水稻的農(nóng)桿菌-真空滲透轉(zhuǎn)化體系，為水稻等作物的基因轉(zhuǎn)化提供了一條快速、有效的新途徑，同時也為今后SFL基因的功能研究及抗稻瘟病水稻新品種的培育奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 受體材料

水稻受體品種為云南粳稻品種‘云資粳41號’，該品種是元江普通野生稻與栽培稻‘合系35’的雜交后代，具有大穗、著粒密度高、粒寬、株型好等特性，但是抗稻瘟病能力較差。根據(jù)預(yù)定的轉(zhuǎn)化時間，提前在溫室進行生長狀態(tài)較佳、健壯的待轉(zhuǎn)化水稻受體材料的分批培養(yǎng)。將‘云資粳41號’種子浸種5 h后，直接播種于裝有水稻土的培養(yǎng)桶內(nèi)，出苗后進行壯苗30～40 d，再分栽于裝有適量水稻土的培養(yǎng)桶內(nèi)培養(yǎng)50～60 d，待長至抽穗期便可直接取用進行轉(zhuǎn)化。

1.2 質(zhì)粒、菌株及真空裝置

含目的基因的表達載體質(zhì)粒pCAMBIA1300-SFL(bar)為本實驗室構(gòu)建和保存，選擇標(biāo)記基因為bar基因。農(nóng)桿菌LBA4404為本實驗室保存。云南稻瘟病菌生理小種16t由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)李成云教授惠贈。

真空滲透裝置為自主研制的水稻真空滲透轉(zhuǎn)化裝置(詳見國家發(fā)明專利 “一種水稻遺傳轉(zhuǎn)化真空滲透轉(zhuǎn)化裝置”專利號：ZL201410467839.6)以及津騰GM-0.33B隔膜真空泵等。

1.3 真空滲透轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選

1.3.1 農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化液的制備 將保存的農(nóng)桿菌菌液劃線接種于含相應(yīng)抗生素的YEP 平板上，28 ℃培養(yǎng)24～48 h。挑取長出的單菌落接種于含相應(yīng)抗生素的10 mL YEP 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，然后將菌液轉(zhuǎn)入 2 L 不含抗生素的 YEP 培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至 OD600為1.0左右，室溫下4000 r/min離心5 min，收集菌體，菌體用滲透培養(yǎng)液(1/2MS液體培養(yǎng)基+ As 19.6 mg/L+ Silwet L-77200 μl/L +蔗糖50 g/L，pH 5.8)重懸調(diào)節(jié)OD600為0.8，作為含目的基因的農(nóng)桿菌滲透轉(zhuǎn)化液備用。

1.3.2 真空滲透轉(zhuǎn)化及栽培管理 提前將待轉(zhuǎn)化水稻植株培養(yǎng)桶內(nèi)的水瀝干，用袋子把植株和土進行包裹，以防土滲漏。留下適宜轉(zhuǎn)化期的水稻分蘗枝，其余分蘗全部剪除；裝置的固定、連接和密封具體參照國家發(fā)明專利 “一種水稻遺傳轉(zhuǎn)化真空滲透轉(zhuǎn)化裝置”(專利號：ZL201410467839.6)中的相關(guān)描述；將水稻連同培養(yǎng)桶整個倒置在容器的環(huán)狀承接臺上，使植株稻穗自然下垂；將轉(zhuǎn)化液置于真空滲透裝置中；調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化液盛放器的高度使植株的花序部分完全浸于含菌體的滲透培養(yǎng)液中；蓋上容器頂蓋，關(guān)閉排氣閥，將真空泵上的真空管和進氣閥連接，打開真空泵開關(guān)，抽真空。0.05 MPa，維持10 min，轉(zhuǎn)化完成，立即關(guān)閉真空泵開關(guān)，緩慢打開閥門，待容器恢復(fù)常壓，打開蓋板，取出植株。

將轉(zhuǎn)化后的水稻植株置于溫室，覆膜保濕2～3 d后，按常規(guī)栽培方法繼續(xù)培育植株至成熟(約30～40 d)，收獲T0代轉(zhuǎn)化種子，干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 抗性轉(zhuǎn)化株的篩選 進行不同濃度的受體材料Basta噴施實驗，確定轉(zhuǎn)化子的最佳篩選濃度。3次噴灑確定濃度的除草劑 Basta(phosphinotricin，原液濃度為10 %)水溶液以篩選抗性株：將收獲的T0代種子，播種在盆缽中，每盆約播種100 粒。出苗后，常規(guī)管理，待幼苗生長到子葉完全展開時開始第1次噴灑，5～7 d后第2次噴灑，再過5～7 d后第3次噴灑，最后存活的植株定為抗性株。統(tǒng)計抗性株數(shù)，按公式(1)計算轉(zhuǎn)化率：

轉(zhuǎn)化率(%)=抗性株數(shù)/T0代種子數(shù)×100

(1)

1.4 抗性株的檢測以及抗性鑒定

1.4.1 抗性株的氯酚紅檢測 以未做轉(zhuǎn)化的‘云資粳41號’植株為對照，從利用 Basta 鑒定篩選出的抗性株中，隨機挑出部分轉(zhuǎn)化株，剪取葉片放置于氯酚紅反應(yīng)液(MS + 15 μmol/L 6-BA + 0.5 μmol/L NAA + 50 mg/L CR + 5.0 mg/L PPT，pH值 6.0)中，28 ℃暗培養(yǎng)3～5 d后觀察顏色變化。

1.4.2 抗性株的PCR檢測 采用 CTAB 法提取部分抗性株幼嫩葉片的基因組 DNA，以ddH2O為空白對照，非轉(zhuǎn)化植株為陰性對照，以pCAMBIA-SFL(bar)質(zhì)粒為陽性對照，進行外源基因(SFL)和標(biāo)記基因(bar)的PCR擴增鑒定，PCR檢測目的基因的整合情況。SFL基因上游引物SFL-1(5’-AACCCAA AGTCATAGTTGCAT-3’)和下游引物SFL-2(5’-GCTCTACACCATGGATAACT-3’)；Bar基因引物上游引物Bar-1(5’-CCGCTCGAGGATCTACCATGAGCCCAGAAC-3’)和下游引物Bar-2(5’-CCGCTCGAGCGGGTCATCAGATCTCGGTGA -3’)。PCR擴增體系為25 μl：ddH2O 15.75 μl，DNA 1 μl，10 mmoL/L引物各1 μl，10×PCR buffer 2.5 μl，dNTP (2.5 mmol/L) 2 μl，MgCl2(25 mmol/L)1.5 μl，rTaqDNA聚合酶(5 U/μl)0.25 μl。PCR 擴增程序為:95 ℃ 預(yù)變性 5 min； 94 ℃ 變性 45 s，48 ℃(SFL)或53 ℃(Bar)退火 45 s，72 ℃延伸1.5 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.3 轉(zhuǎn)基因植株的抗稻瘟病鑒定 稻瘟病菌產(chǎn)孢：先將活化的稻瘟病菌絲接種于PDA液體培養(yǎng)基中(土豆200 g/L+葡萄糖40 g/L，pH 5.8)， 25～28 ℃培養(yǎng)4～5 d后，吸取適量菌液均勻地涂布接種于番茄燕麥培養(yǎng)基上(燕麥片40 g/L+番茄汁200 mL/L+CaCO30.6 g/L+瓊脂18 g/L，pH 5.8)，25～28 ℃，弱光下進行產(chǎn)孢培養(yǎng)7～10 d。

稻瘟病菌苗期噴霧接種：將所有鑒定材料浸種、催芽后播于裝有水稻土的育苗盤中，每個材料2 次重復(fù)。當(dāng)苗齡達3 葉1心期時，制備濃度為2×105個/mL的孢子懸浮液，加1滴吐溫20作展布劑，進行噴霧接種。接種后置于25～28 ℃，保濕以利于發(fā)病，7～10 d 后調(diào)查發(fā)病情況。以非轉(zhuǎn)基因水稻和易感蒙古稻作為對照，病情鑒定的方法按國際水稻所公布的抗性分級標(biāo)準(zhǔn)進行。

稻瘟病菌大田人工誘發(fā)鑒定：在隔離基地田間種植苗期抗病的T2代材料，用當(dāng)?shù)氐疚敛「甙l(fā)田塊中采集的感病株進行稻瘟病誘發(fā)鑒定，四周種植感病品種蒙古稻，7～10 d左右調(diào)查發(fā)病情況，病情鑒定的方法按國際水稻所公布的抗性分級標(biāo)準(zhǔn)進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻的真空滲透轉(zhuǎn)化

本研究應(yīng)用自主研制的水稻真空容器，以含SFL基因的pCAMBIA-SFL(bar) 表達載體作為外源片段，取用生長健壯的抽穗期‘云資粳41號’活體水稻植株作為受體，0.05 Mpa條件下抽真空10 min即實現(xiàn)了外源SFL基因向受體水稻植株的原位轉(zhuǎn)化(圖1)。共計處理水稻受體10株，每株平均3個分蘗枝，收獲T0代種子12 650粒。

圖1 正在進行真空滲透轉(zhuǎn)化的水稻受體植株Fig.1 The recipient rice plant in situ undergoing vacuum infiltration transformation

圖2 部分轉(zhuǎn)化株的除草劑抗性篩選結(jié)果Fig.2 The screening results of herbicide resistance of the partial transformed plants

2.2 抗性轉(zhuǎn)化株的篩選

根據(jù)受體材料對不同濃度的除草劑Basta的噴施反應(yīng)(圖2上)，確定轉(zhuǎn)化子的篩選濃度為20 mg/L，部分轉(zhuǎn)化株的除草劑噴施實驗結(jié)果如圖2下所示，非抗性株在噴藥后 2～3 d，葉片便開始枯萎，后來整個植株枯死?？剐灾暧捎谟衎ar基因的表達產(chǎn)物，能夠分解 PPT 而除去毒性，生長照常不受影響。通過除草劑噴施實驗共篩選獲得135株抗性苗，平均抗性苗為13～14苗/株。

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的檢測以及抗性鑒定

2.3.1 抗性株的氯酚紅檢測 對除草劑抗性株進行氯酚紅檢測，通過顏色的反應(yīng)可初步判定是否為陽性轉(zhuǎn)基因植株。部分轉(zhuǎn)化株的氯酚紅鑒定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因抗性植株因為有bar基因的表達，能夠分解 PPT，沒有影響離子的代謝，因呼吸作用產(chǎn)生二氧化碳，導(dǎo)致 pH 值下降，顏色由紅變?yōu)辄S色或者橙黃色；非轉(zhuǎn)化株則不同，由于不能分解 PPT 而代謝出氨,導(dǎo)致 pH 值升高，顏色不變或者由紅色變?yōu)樽霞t色(圖3)。經(jīng)統(tǒng)計，135株除草劑抗性苗中，氯酚紅陽性株為116株。氯酚紅檢測法操作快速簡便，觀測結(jié)果直觀，可在早期對轉(zhuǎn)基因植株進行初篩，大大節(jié)約篩選成本并且提高效率。

2.3.2 抗性株的PCR鑒定 對經(jīng)氯酚紅檢測的抗性株進行PCR檢測以確認(rèn)目的基因是否轉(zhuǎn)入受體植株。部分抗性株的PCR擴增檢測結(jié)果表明，抗性轉(zhuǎn)化株中可擴增出與pCAMBIA-SFL(bar)質(zhì)粒相同大小的1000 bp左右的SFL基因片段和560 bp左右的bar基因片段，而未轉(zhuǎn)化陰性對照則無擴增條帶(圖4和5)，表明外源DNA已整合到轉(zhuǎn)化植株基因組中。經(jīng)氯酚紅檢測的116株陽性苗中，經(jīng)PCR檢測，還是存在一定數(shù)量比例的假陽性苗(圖4上)。說明氯酚紅檢測法存在一定的局限性，只適于早期對轉(zhuǎn)基因苗進行初步鑒定。相比之下，PCR檢測結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。本研究收獲的12 650粒T0代種子中，最終經(jīng)PCR檢測確定的轉(zhuǎn)基因陽性苗為98株，轉(zhuǎn)化率為0.77 %。

1:氯酚紅反應(yīng)液；2～3:非轉(zhuǎn)基因植株葉片；4～9:轉(zhuǎn)SFL基因植株的葉片1: Chlorophenol red reaction solution; 2-3: Non-transgenic plant leaves; 4-9:Transgenic leaves of SFL gene plants圖3 部分轉(zhuǎn)基因植株葉片的氯酚紅顯色鑒定Fig.3 Identification of chlorophenol red in leaves of some transgenic plants

上-M: DL2000; 1: 陽性對照; 2:H2O空白對照；3:陰性對照；4～17:轉(zhuǎn)基因植株; 下-M: DL2000; 1:H2O空白對照；2:陽性對照；3:陰性對照；4～17:轉(zhuǎn)基因植株Above-M:DL2000; 1:Positive control; 2:H2O blank control; 3: Negative control; 4-17:Transgenic plants; Below-M:DL2000; 1: H2O blank control; 2:Positive control; 3:Negative control; 4-17: Transgenic plants圖4 部分轉(zhuǎn)基因植株SFL基因PCR檢測電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of SFL gene in some transgenic plan

M:DL2000; 1:H2O空白對照；2:陽性對照；3:陰性對照；4～17:轉(zhuǎn)基因植株M:DL2000; 1:H2O blank control; 2:Positive control; 3:Negative control; 4-17:Transgenic plants圖5 部分轉(zhuǎn)基因植株bar基因PCR檢測電泳圖Fig.5 Electrophoretogram of bar gene in some transgenic plants by PCR detection

2.3.3 轉(zhuǎn)基因植株的抗稻瘟病鑒定 以非轉(zhuǎn)基因水稻植株和易感品種蒙古稻植株作為對照，在溫室對經(jīng)PCR檢測的98株陽性T1代轉(zhuǎn)基因水稻植株進行苗期稻瘟病菌噴霧接種鑒定。部分植株的抗稻瘟病鑒定結(jié)果如圖6所示，易感對照蒙古稻發(fā)病情況比較嚴(yán)重，逐漸萎蔫枯死。與非轉(zhuǎn)基因植株對照相比，轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)病斑的時間較晚，病斑的擴展速度很慢，病斑比較小，能保持正常生長，說明轉(zhuǎn)SFL基因的植株抗稻瘟病能力較非轉(zhuǎn)基因植株明顯提高。經(jīng)苗期噴霧鑒定，最終篩選出稻瘟病抗性較強的轉(zhuǎn)基因材料25份。

用當(dāng)?shù)氐疚敛「甙l(fā)田塊中采集的感病株對種植于隔離基地大田間的T2代材料進行稻瘟病誘發(fā)鑒定，結(jié)果如表1所示，根據(jù)抗感情況最終篩選出具有較穩(wěn)定抗稻瘟病能力的轉(zhuǎn)SFL基因水稻新材料12份。

CK1：感病蒙古稻；CK2：非轉(zhuǎn)基因?qū)φ铡瀑Y粳41號’；1～5：轉(zhuǎn)基因植株CK1: Susceptible Mongolian rice; CK2: Non-transgenic control ‘Yunzijing 41’; 1-5: Transgenic plants圖6 部分轉(zhuǎn)基因植株的抗稻瘟病鑒定Fig.6 Identification of resistance to rice blast in some transgenic plants

材料編號Material number發(fā)病級別Incidence level抗性評價Resistance evaluation材料編號Material number發(fā)病級別Incidence level抗性評價Resistance evaluationST11R ST141RST23MR ST151RST33MR ST161RST41R ST173MRST51R ST183MRST64MS ST194MSST71R ST201RST81R ST213MRST93MR ST221R ST104MS ST233MR ST114MS ST241R ST125S ST253MR ST131R云資粳41(受體對照)7S蒙古稻(感病對照)8HS

3 討 論

真空滲透法是一種在植株原位真空滲入條件下所進行的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法。目前該方法在擬南芥、油菜、芥菜、煙草、蘿卜、獼猴桃、豆類、棉花等多種植物上已成功應(yīng)用。在目前的真空滲透法有關(guān)研究報道中，應(yīng)用多為擬南芥、芥菜、白菜等小型植物，且轉(zhuǎn)化率普遍偏低，真正獲得的有應(yīng)用價值的轉(zhuǎn)基因植物較少。這可能與現(xiàn)有真空容器容量較小以及真空滲透轉(zhuǎn)化過程時因現(xiàn)有容器容量空間有限，多采用將受體植株挖出，將其直接倒放于容器中進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化完成后又移栽定植的轉(zhuǎn)化操作方法有關(guān)[16-17,20-21,24-26]，這種操作方式一方面并不是真正的原位轉(zhuǎn)化，另一方面明顯對轉(zhuǎn)化后植株的生長狀態(tài)、健壯程度和結(jié)實率有影響。此外，因真空容器中無固定部件很容易出現(xiàn)花序脫落或側(cè)枝被壓斷，進而造成部分種子丟失，最終收獲的轉(zhuǎn)化子少。盡管根據(jù)該方法的原理和技術(shù)特點，該方法更傾向適用于個體較小、基因型依賴嚴(yán)重、組培困難的作物，但其具有操作簡便快速、無遺傳變異、轉(zhuǎn)基因后代遺傳一致性好、轉(zhuǎn)化效率較高等獨特優(yōu)勢是其它轉(zhuǎn)基因方法所不可比擬的，即便對組培較容易的水稻等個體較大作物也值得嘗試和探索。

本研究應(yīng)用自主研制的水稻真空滲透轉(zhuǎn)化裝置，快速實現(xiàn)了外源SFL基因向受體水稻的原位轉(zhuǎn)化。收獲的T0代轉(zhuǎn)化種子，經(jīng)抗性篩選、檢測以及鑒定后成功獲得了一批具有抗稻瘟病能力的轉(zhuǎn)基因植株。真空滲透法是在水稻上的初步嘗試，但證實了該方法的可行性和實用性。真空時間、真空強度、滲透培養(yǎng)基、菌液濃度、轉(zhuǎn)化時期等各種轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化及轉(zhuǎn)基因后代材料的遺傳穩(wěn)定性等方面還有待進一步研究，以期真正建立起穩(wěn)定高效的水稻真空滲透轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，為水稻及其它作物的基因轉(zhuǎn)化提供技術(shù)參考。

4 結(jié) 論

真空滲透法應(yīng)用于水稻的轉(zhuǎn)化研究尚屬首次應(yīng)用，直接對開花前的活體水稻進行短暫抽真空處理，快速將苦參凝集素蛋白基因(SFL)成功轉(zhuǎn)入水稻，并獲得具有抗稻瘟病能力的轉(zhuǎn)基因植株。這為水稻及其它作物的基因轉(zhuǎn)化提供了另一重要途徑，為品種的遺傳改良和基因功能研究提供了強有力的技術(shù)保障。