張 志，張麗麗，2，張 峰，劉 爽，董雅琴，張 慧，崔 進(jìn)，吳發(fā)興，李曉成

（1. 中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266019）

塞尼卡病毒（Senecavirus A，SVA）曾用名塞尼卡谷病毒（Seneca Vally virus，SVV），是最近新發(fā)現(xiàn)的可以感染豬的一種單股RNA病毒，屬于小核糖RNA病毒科[1]。SVA最初從轉(zhuǎn)化的胎兒成視網(wǎng)膜細(xì)胞PER.C6的細(xì)胞培養(yǎng)基中被發(fā)現(xiàn)和分離到，并用于人溶瘤病毒治療[2]。后來發(fā)現(xiàn)豬也可以感染SVA，并且發(fā)現(xiàn)發(fā)病豬的鼻吻部、蹄部冠狀帶等部位可以出現(xiàn)水泡樣病變[3]。這種病變?cè)谂R床上與口蹄疫、豬水泡性口炎、豬水皰病、豬水泡性疹等疾病十分相似，僅靠臨床診斷很難鑒別[4]。近年來，SVA在豬群的感染范圍呈現(xiàn)逐年擴(kuò)大趨勢，美國、加拿大、巴西、中國、泰國、哥倫比亞等養(yǎng)豬業(yè)較發(fā)達(dá)國家先后從出現(xiàn)水泡病的豬病料中檢測到SVA[4-8]。2015年夏天，我國廣東省某豬場發(fā)生了水泡樣疾病，在排除口蹄疫、豬水皰病、豬水泡性口炎等疫病后，證實(shí)感染病原為SVA，且分離到SVA毒株CH-01-2015。該毒株與參考毒株SVV-001的同源性為94.4%～97.1%，這是我國首次報(bào)道豬場感染SVA[6]。隨后，我國學(xué)者又分別從湖北、黑龍江、福建、河南等省份出現(xiàn)水泡病的豬病料中先后檢測到SVA[9-12]。這些研究提示，我國豬群SVA的感染狀況較為嚴(yán)重。但上述研究分離檢測到SVA的樣品均為發(fā)病的水泡樣品，并沒有針對(duì)SVA開展系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測。一些流行病學(xué)信息，特別是未表現(xiàn)癥狀的外觀健康豬群是否攜帶SVA更是亟待摸清。為此，針對(duì)2016—2018年從部分省市屠宰場和表現(xiàn)非水泡狀豬群采集的樣品，開展了SVA回顧性監(jiān)測，以了解SVA在我國豬群的感染程度和分布規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 樣品與來源

458份組織混合樣品和95份血清樣品：2018年采集自廣西、云南、新疆、遼寧、福建、湖南、湖北等7省份的屠宰場；病料樣品164份：2016—2018年采自遼寧、河北、湖北、湖南、江西、四川、山東、上海、貴州、吉林、陜西、云南等12省份，其中2018年84份、2017年32份、2016年48份。采集樣品時(shí)，每頭豬采集適量的扁桃體、脾臟、腎臟、淋巴結(jié)、肺臟等混在一起，作為一個(gè)樣品進(jìn)行處理和檢測。

1.2 主要試劑

Premix RT-PCR探針法一步法擴(kuò)增試劑盒、pMD-18T vector和DH5α感受態(tài)細(xì)胞：寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；病毒RNA提取試劑盒（TRIzol）：Life公司產(chǎn)品。

1.3 樣品處理與RNA提取

將樣品稱重后加入4倍體積的PBS（0.01 mol/L，pH7.2）進(jìn)行研磨，待全部乳化后，以8 000 r/min離心5 min，取上清液提取RNA。同時(shí)用本室分離和鑒定的SVA病毒GXT91作為陽性對(duì)照，用PBS作為陰性對(duì)照，同步提取RNA。RNA提取按照TRIzol試劑盒操作說明書進(jìn)行，簡述為：取0.25 mL樣品上清液，加入0.75 mL TRIzol混勻，再加入0.2氯仿混勻；室溫靜置5 min，12 000 r/min離心5 min；取上清液加入等體積異丙醇，12 000 r/min離心5 min，保留沉淀；加入1 mL 70%乙醇洗滌1次，然后加入適量H2O溶解，置-70 ℃?zhèn)溆谩?duì)陽性樣品接種的細(xì)胞上清液，也按照此法提取RNA。

1.4 樣品檢測

本研究使用熒光RT-PCR方法，對(duì)樣品中的SVA核酸成分進(jìn)行檢測，根據(jù)GenBank公開的我國SVA毒株序列（KY419132）為靶基因序列設(shè)計(jì)引物。上游引物為SVA-F：ctgcgctgggaccgtatctca；下游引物為：SVA-R：cgccgcgccacctcatt；熒光引物 為SVA-P：5'-FAM-tgccgccaagtttcaatcccatcctgg-3'-BHQ1。反應(yīng)體系為：2×Premix 12.5 μL，SVA- F引物（10 μmol/L）1 μL，SVA- R引物（10 μmol/L）1 μL，SVA- P引物（5 μmol/L）1 μL，樣品RNA模板或陽性標(biāo)準(zhǔn)品2 μL，加水至25 μL。RT-PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?2 ℃ 5 min，95 ℃預(yù)變性3 min，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（95 ℃ 8 s、60 ℃ 16 s），60 ℃讀取熒光。SVA的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：Ct＜35為陽性，35≤Ct＜37為可疑，Ct≥37為陰性；可疑者重復(fù)檢測1次，如果仍可疑或陰性，則判為陰性，如果為陽性，則判為陽性。

1.5 結(jié)果分析

根據(jù)監(jiān)測結(jié)果，使用Excel、ArcGIS等軟件進(jìn)行分析，摸清SVA的三間分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 屠宰場樣品檢測情況

本研究對(duì)7個(gè)省份的35個(gè)屠宰場進(jìn)行了回顧性調(diào)查，對(duì)458份組織混合樣品和95份血清樣品進(jìn)行回顧性檢測。在混合組織樣品中，檢出SVA陽性55份，陽性率為12.0%；在血清樣品中，檢出陽性7份，陽性率為7.4%。在35個(gè)屠宰場中，有17個(gè)檢出SVA陽性樣品，場陽性率為48.6%。雖然7個(gè)省份均有屠宰場檢出SVA陽性，但陽性率并不相同，最高的是福建，5個(gè)屠宰場均檢測到陽性，場陽性率為100%，其次是湖北和新疆，場陽性率分別為66.7%和60.0%，最低的是湖南和云南，場陽性率均為20.0%。7個(gè)省份的SVA樣品陽性率在2.7%～25.0%之間，其中在遼寧的60個(gè)樣品中，檢測到15份陽性，陽性率高達(dá)25.0%（但這些樣品均來自同一個(gè)屠宰場），最低的是湖南和云南，樣品陽性率均為2.7%（表1）。

2.2 病料SVA檢測情況

在2016年10個(gè)省份采集的48份病料樣品中，檢出SVA陽性7份，占比為14.6%；2017年5個(gè)省份采集的32份病料樣品中，檢出SVA陽性7份，占比為21.9%。2018年3個(gè)省份采集的84份病料中，檢出SVA陽性19份，占比為22.6%。其中：1—6月份，共檢測病料樣品36份，檢測到SVA陽性5份，占比為13.9%；7—10月份，共檢測病料樣品48份，檢測到SVA陽性14份，占比為29.2%；山東、四川、遼寧等3省份送檢的病料中，均檢測到SVA陽性樣品（表2）。

2.3 陽性樣品Ct值分布

從屠宰場62份陽性樣品的SVA熒光RT-PCR擴(kuò)增Ct值分布可以看出（圖1），不同陽性樣品的檢測結(jié)果差異較大。其中：Ct≤20的3個(gè)（占4.8%），20＜Ct≤25的1個(gè)（占1.6%），25＜Ct≤30的10個(gè)（占16.1%），30＜Ct≤35的40個(gè)（占64.5%），35＜Ct≤37的8個(gè)（占12.9%）。這一結(jié)果表明，除少數(shù)陽性樣品以外，大部分陽性樣品中含有的SVA病毒數(shù)量并不多。

圖1 屠宰場樣品中SVA熒光RT-PCR擴(kuò)增Ct值的分布

從病料樣品SVA熒光RT-PCR擴(kuò)增Ct值分布可以看出，25＜Ct≤30的1個(gè)（占2.9%），30＜Ct≤35的31個(gè)（占91.2%），35＜Ct≤37的2個(gè)（占5.9%），說明未表現(xiàn)水泡樣病變的樣品與屠宰場樣品中含有的SVA病毒數(shù)量分布基本一致（圖2）。

2.4 時(shí)間分布情況

2016—2018年的病料樣品SVA監(jiān)測結(jié)果顯示：2016年3個(gè)省份檢出陽性，占比為14.6%，2017年5個(gè)省份檢出陽性，占比為21.9%，2018年3個(gè)省份檢出陽性，占比為22.6%，呈現(xiàn)逐年增加的趨勢，也表明SVA早在2016年就已在我國多個(gè)省份的豬群中流行。

表1 屠宰場樣品SVA檢測情況

表2 我國部分省份豬病料中的SVA檢出結(jié)果 單位：份

圖2 屠宰場樣品和發(fā)病樣品中SVA陽性樣品的比例分布

3 討論

本監(jiān)測研究了SVA 時(shí)間、空間分布等流行病學(xué)規(guī)律，通過對(duì)保存的病料進(jìn)行檢測，證實(shí)SVA在我國豬群的流行至少可以追溯到2016年，與Wu等[6]報(bào)道的時(shí)間基本一致。通過對(duì)不同時(shí)間樣品進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，2016年SVA存在于遼寧、四川和山東等3個(gè)省份，2017年存在于遼寧、四川、山東、上海、貴州等5個(gè)省份，2018年存在于遼寧、上海和山東等3個(gè)省份。2018年對(duì)7個(gè)省份的36個(gè)屠宰場進(jìn)行監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，調(diào)查的湖南、云南、新疆、遼寧、福建、湖北、廣西等7省份均有不同程度的SVA感染，個(gè)體樣品陽性率為11.2%（2.7%～25.0%），場陽性率為48.6%（20.0%～100%）。因調(diào)查的屠宰場位于不同的縣，所以屠宰場陽性率更能反映出SVA的污染面?？紤]到福建、湖北等省份已有檢測到SVA的報(bào)道[9，12]，且本次監(jiān)測的福建（100%）和湖北（80.0%）屠宰場陽性率均較高，由此認(rèn)為福建和湖北兩省SVA的污染面較廣。另外，有學(xué)者報(bào)道，我國的黑龍江、河南、福建、湖北、廣東等5省均檢測到SVA感染[9-12]。從以上結(jié)果可以看出，我國感染SVA的省份至少已有14個(gè)（圖3）。

另外，本次監(jiān)測雖然在部分省份采集的樣品較少，如上海、貴州等地僅3個(gè)樣品，但也能檢測到SVA陽性，還有很多省份沒有采樣監(jiān)測，因此推測我國的SVA實(shí)際感染情況應(yīng)該比上述監(jiān)測結(jié)果更嚴(yán)重。當(dāng)然我國實(shí)際的SVA感染情況和流行面，還需要在后續(xù)工作中進(jìn)一步深入研究。

根據(jù)Joshi等[13]的試驗(yàn)，將SVA毒株SD15-26接種豬以后，第4～5天就可呈現(xiàn)水泡病變，接種后第3天病毒血癥最高，病毒拷貝數(shù)可達(dá)106.5個(gè)/mL，隨后病毒含量逐漸下降，到接種后第10天，血液中已檢測不出病毒RNA，但組織中的RNA直到接種后第28天才檢測不出。另外，不同器官的SVA檢出率也不同，扁桃體中檢測到的病毒含量最高。本實(shí)驗(yàn)室已證明，本次檢測使用的熒光RT-PCR方法的敏感性較高病毒拷貝數(shù)可達(dá)17.4個(gè)/μL。在用該方法對(duì)屠宰場樣品和發(fā)病樣品進(jìn)行檢測時(shí)，病毒拷貝數(shù)大于106.5個(gè)/mL的只有來自屠宰場的3個(gè)樣品，而病毒拷貝數(shù)為174～1 740個(gè)/mL的樣品有58份，占陽性樣品總數(shù)的61.1%，病毒拷貝數(shù)為10～174個(gè)/mL的樣品有20份，占陽性樣品總數(shù)的21.1%，二者共計(jì)82.2%。從這一結(jié)果可以看出，病毒含量較低的樣品，在陽性樣品中占主要比例，這可能與病毒的代謝周期較快有關(guān)。

圖3 我國SVA感染的空間分布

本調(diào)查是在我國豬群中首次開展的SVA流行病學(xué)監(jiān)測，盡管樣品的數(shù)量分布不十分規(guī)范和平衡，如有的省份收集的發(fā)病樣品只有幾份甚至1份，影響了結(jié)果的可信性，但這些初步的檢測結(jié)果已充分證明，在外觀健康的豬群中仍然可以檢測到SVA陽性，且陽性率高達(dá)11.2%。這一結(jié)果說明我國豬群中SVA感染已比較常見，同時(shí)本監(jiān)測也證實(shí)了許多生豬存在帶毒不發(fā)病的隱性帶毒現(xiàn)象，這種現(xiàn)象更有利于SVA的傳播和擴(kuò)散。進(jìn)一步比較發(fā)病樣品和外觀健康豬樣品中的SVA檢測情況，發(fā)現(xiàn)發(fā)病豬樣品中的SVA陽性占比為20.7%，明顯高于外觀健康豬群。究其原因，可能與發(fā)病豬免疫力下降有利于SVA的感染和增殖有關(guān)?？傊?，即使對(duì)于未表現(xiàn)出典型水泡樣病變的生豬，仍存在攜帶和傳播SVA的風(fēng)險(xiǎn)。另外，Joshi等[14]發(fā)現(xiàn)，在感染SVA豬舍的蒼蠅、老鼠糞便、老鼠小腸、環(huán)境樣品中均能檢測到SVA，并從老鼠的糞便和小腸中分離到SVA[14]，這意味著在豬群生產(chǎn)和管理中必須格外重視對(duì)外觀健康豬群的監(jiān)視和監(jiān)測。

4 結(jié)論

本監(jiān)測對(duì)2016—2018年從我國遼寧等12個(gè)省份采集的豬群病料和2018年從我國福建等7個(gè)省份35個(gè)屠宰場采集的組織混合樣品和血清樣品，用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法進(jìn)行SVA回顧性檢測，在所有檢測省份每年的病料樣品或屠宰場樣品中均檢出SAV陽性，表明SVA在我國豬群的流行至少可以追溯到2016年，且流行面較廣，存在隱性感染狀況，今后須需重視對(duì)豬群SVA的監(jiān)視和監(jiān)測。