王建華，王玉玲，柴銘駿，張俊哲，趙 丹，王乃福，陳本龍

（天津海關(guān)，天津 300456）

袋鼠（Kangaroo）是分布于澳大利亞和巴布亞新幾內(nèi)亞部分地區(qū)的有袋類動(dòng)物，主要包括紅袋鼠、大赤袋鼠、東部灰大袋鼠和麝香袋鼠等品種，在我國一些動(dòng)物園內(nèi)也有少量人工繁養(yǎng)。近年來，袋鼠作為一種觀賞動(dòng)物日益獲得人們的喜愛，進(jìn)口的袋鼠數(shù)量在逐年增多。皰疹病毒（Herpevirus）是引發(fā)多種動(dòng)物疫病的重要病原體[1]。20世紀(jì)70年代，澳大利亞研究人員從發(fā)生致死性呼吸道感染和多系統(tǒng)衰竭的袋鼠腎組織中分離出皰疹病毒，定名為袋鼠皰疹病毒1型（Macropodid herpesvirus 1，MaHV-1）[2]。目前已知這種病毒主要引起袋鼠以鼻炎、結(jié)膜炎、肺炎、肝壞死和泄殖腔潰瘍?yōu)樘卣鞯亩嘞到y(tǒng)疾病，對袋鼠健康及種群發(fā)展構(gòu)成一定威脅[3-5]。Paola等[6]首先報(bào)道了MaHV-1的全基因組序列，發(fā)現(xiàn)該病毒基因組長約140 kb，與人的皰疹病毒1型具有67%的核酸同源性，含有66個(gè)與其他皰疹病毒同源的開放閱讀框（ORF），其中的gB基因序列長2 664 bp，編碼由887氨基酸組成的與皰疹病毒同源的gB糖蛋白。為保護(hù)國內(nèi)動(dòng)物園袋鼠種群的生命健康，按照雙邊動(dòng)物貿(mào)易協(xié)定要求，我國口岸動(dòng)物檢疫機(jī)構(gòu)需對進(jìn)境袋鼠實(shí)施MaHV-1檢疫。對袋鼠皰疹病毒的檢測，目前僅有澳大利亞建立了病毒分離鑒定試驗(yàn)、血清中和試驗(yàn)和常規(guī)PCR試驗(yàn)這3種檢測方法[5]。事實(shí)上，國內(nèi)由于缺乏MaHV-1及血清中和抗體，無法進(jìn)行病毒分離鑒定和血清中和試驗(yàn)。為滿足我國對進(jìn)境袋鼠皰疹病毒的檢疫要求，本研究以MaHV-1 gB基因?yàn)閿U(kuò)增靶序列，設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，建立了MaHV-1實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法。該方法具有特異、敏感和快速的優(yōu)點(diǎn)，為進(jìn)境袋鼠皰疹病毒檢疫提供了一種有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 病毒核酸和主要試劑

禽傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、偽狂犬病毒（PRV）和牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）核酸材料：由天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測中心反芻動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室保存。TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0、Premix Ex Taq?（Probe qPCR）：購自寶生物工程（北京）有限公司。其他試劑均為國內(nèi)或進(jìn)口分析純試劑。

1.2 引物和探針設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank發(fā)表的MaHV-1基因序列（AF061754），應(yīng)用Beacon Designer 7.0軟件輔助設(shè)計(jì)多對特異引物和TaqMan探針，探針5'端用VIC標(biāo)記，3'端用BHQ1標(biāo)記，由Sangon Biotech公司合成。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定的引物及探針序列見表1，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為105 bp。

表1 引物與探針序列

1.3 陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒制備

根據(jù)GenBank發(fā)表的MaHV-1 gB基因序列（AF061754），選取一段包含上、下游引物和探針序列在內(nèi)的擴(kuò)增靶序列，長度為150 bp，送上海捷瑞生物工程有限公司合成并插入至pCR2.1克隆載體中，經(jīng)測序確證后作為陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒對照，命名為pCR2.1- MaHV-1-gB，用核酸蛋白分析儀測得該陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒對照的濃度為8.3×109copies/μL。

1.4 引物對和探針組合篩選及反應(yīng)條件優(yōu)化

用滅菌水將引物和探針分別稀釋至2.0～10.0 pmol/μL和1.0～4.0 pmol/μL的 工 作濃度范圍，以8.3×104copies/μL的pCR2.1- MaHV-1-gB為擴(kuò)增模板，按照Premix Ex Taq?（Probe qPCR）試劑盒說明書，在Light Cycler? 480熒光PCR儀（Rochi公司）儀上，采用方陣試驗(yàn)篩選最適引物對和探針組合及工作濃度，然后再篩選最適退火延伸溫度及反應(yīng)時(shí)間。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

對pCR2.1-MaHV-1-gB（8.3×109copies/μL）進(jìn)行10 倍系列稀釋，選擇8.3×100～8.3×108copies/μL濃度范圍的稀釋質(zhì)粒作為模板，按照優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，以Ct值為橫坐標(biāo)，pCR2.1-MaHV-1-gB模板起始拷貝數(shù)濃度的對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 敏感性、重復(fù)性和特異性試驗(yàn)

對pCR2.1-MaHV-1-gB進(jìn)行10倍系列稀釋，按照優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光RT-PCR擴(kuò)增，以確定該方法的最低檢出限。選取8.3×103、8.3×104和8.3×105copies/μL的pCR2.1-MaHV-1-gB，按照優(yōu)化的熒光PCR方法進(jìn)行組內(nèi)與組間試驗(yàn)，每個(gè)濃度的模板做3個(gè)平行檢測，以確定本方法的重復(fù)性。以pCR2.1-MaHV-1-gB以及ILTV、PRV和IBRV Bartha Nu/67株的核酸材料為模板，按照優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光RT-PCR擴(kuò)增，以確定該方法的特異性。

2 結(jié)果

2.1 引物對和探針組合篩選及反應(yīng)條件優(yōu)化

以濃度為8.3×104copies/μL的pCR2.1-MaHV-1-gB為模板，使用Premix Ex Taq?（Probe qPCR）試劑，對多個(gè)引物對和探針組合進(jìn)行熒光PCR篩選試驗(yàn)，以出現(xiàn)最典型S型擴(kuò)增曲線和最小Ct值為選取標(biāo)準(zhǔn)，最終確定的引物對和探針組合見表1。通過優(yōu)化上、下游引物和探針的濃度及反應(yīng)參數(shù)，確定實(shí)時(shí)熒光PCR的最適反應(yīng)體系為： 2×Premix Ex Taq? 12.5 μL，上、下游引物（5 pmol/μL）各1.0 μL，探針（2 pmol/μL）1.0 μL，模板1 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增曲線見圖1。

圖1 pCR2.1- MaHV-1-gB（8.3×104 copies/μL）熒光PCR動(dòng)力學(xué)曲線

2.2 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低檢出限

以8.3×100～8.3×108copies/μL濃 度 范 圍的標(biāo)準(zhǔn)陽性對照質(zhì)粒為擴(kuò)增模板，按優(yōu)化反應(yīng)條件進(jìn)行熒光PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增曲線見圖2。在8.3×101～8.3×108copies/μL濃度范圍，以起始模板濃度的對數(shù)為X軸，Ct 值為Y軸繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。Ct 值與pCR2.1-MaHV-1-gB拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系表達(dá)式為：Y= -3.276 3X+37.545，相關(guān)系數(shù)（R2）為0. 998 9，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3 最低檢出試驗(yàn)

對10倍系列稀釋的pCR2.1-MaHV-1-gB（8.3×100～8.3×108copies/μL），各取1 μL為模板，按優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光RT-PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增曲線見圖2。由圖2和圖3可知，該方法最低可檢出8個(gè)拷貝的PCR2.1-MaHV-1-gB。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，3個(gè)濃度的PCR2.1-MaHV-1-gB組內(nèi)與組間試驗(yàn)的Ct值變異系數(shù)介于0.17%～0.96%，表明本試驗(yàn)所建立的熒光PCR檢測體系穩(wěn)定，具有良好的重復(fù)性。

2.5 特異性試驗(yàn)

圖2 pCR2.1-MaHV-1-gB（8.3×100～8.3×108 copies/μL）的熒光PCR擴(kuò)增曲線

圖3 pCR2.1-MaHV-1-gB（8.3×100～8.3×108 copies/μL）的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 熒光PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

用所建立的方法同時(shí)對ILTV、PRV和IBRV的核酸材料以及PCR2.1-MaHV-1-gB進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)僅有陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒對照呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，而ILTV、PRV和IBRV等核酸材料均無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)（圖4），表明本研究建立的熒光PCR方法具有良好的特異性。

3 討論與結(jié)論

圖4 熒光PCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果

澳大利亞早期流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，約有23 %的野生袋鼠血清中存在MaHV-1中和抗體[7]，表明MaHV-1感染在野生袋鼠中并非罕見。為保護(hù)國內(nèi)動(dòng)物園袋鼠的種群健康，防止MaHV-1隨進(jìn)境袋鼠傳入，特別是在國內(nèi)缺乏袋鼠皰疹病毒血清學(xué)診斷試劑的情況下，開展袋鼠皰疹病原檢測方法的研究具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。熒光PCR方法具有快速、敏感和特異的優(yōu)點(diǎn)，已逐步取代常規(guī)PCR方法，被廣泛用于各種動(dòng)物的病原體檢測，但用于袋鼠MaHV-1檢測的實(shí)時(shí)熒光PCR方法還未見報(bào)道。為此，本研究基于GeneBank 公布的MaHV-1 gB基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，建立了一種檢測MaHV-1的實(shí)時(shí)熒光PCR方法。試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法對MaHV-1 gB基因呈現(xiàn)特異性擴(kuò)增反應(yīng)，不與ILTV、PRV和IBRV等皰疹病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，最低檢出限達(dá)8個(gè)拷貝數(shù)的pCR2.1-MaHV1-gB，具有良好的特異性和敏感性。近3年來，采用本研究建立的熒光PCR方法，對346份袋鼠鼻拭子樣品進(jìn)行MaHV-1核酸檢測，并未發(fā)現(xiàn)陽性，與對照結(jié)果相符，表明該方法可用于進(jìn)境袋鼠臨床樣品MaHV-1的病原學(xué)檢測。本方法的建立為進(jìn)境袋鼠皰疹病毒檢疫提供了一種有效的技術(shù)支撐。