王香雨，陳百靈，李紅杰，賈慶忠*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，河北 石家莊 050017；2.定州市中醫(yī)院，河北 定州市 073000)

柴貝胃炎康是一個(gè)由柴胡、芍藥、枳實(shí)等多味藥材組成的臨床經(jīng)驗(yàn)方處方由傳統(tǒng)方劑“四逆散”和“左金丸”加減裁化而成。四逆散源于《傷寒論》可用于肝胃不和引起的胃痛、腹痛。有研究表明四逆散加減方可治療急慢性應(yīng)激性胃潰瘍[1]。左金丸是《丹溪心法》中的名方主治肝火犯胃證、脅肋疼痛、嘈雜吞酸?，F(xiàn)代研究表明左金丸具有抑制基礎(chǔ)泌酸和抗?jié)兊乃幚碜饔肹2]。柴貝胃炎康以柴胡為君藥配伍枳實(shí)、白芍、黃連等治療急慢性胃潰瘍。有臨床研究表明四逆散合左金丸合方可治療膽汁反流性胃炎、功能性消化不良[3-4]。但尚未有實(shí)驗(yàn)研究該合方對(duì)應(yīng)激性胃潰瘍及慢性胃潰瘍的治療作用。應(yīng)激性胃潰瘍及慢性胃潰瘍臨床發(fā)病率高但其發(fā)生的確切機(jī)制尚不明確因此防治效果不理想。因此尋找對(duì)應(yīng)激性胃潰瘍及慢性胃潰瘍的藥物意義重大。本實(shí)驗(yàn)所用四逆散合左金丸加減方以生藥微粉方式經(jīng)口給藥提高了吸收度，方中以柴胡為君藥，具有疏肝利膽、理氣解郁以祛發(fā)病之源；枳實(shí)疏散行氣，有驅(qū)肝郁氣滯之功效；白芍益肝扶脾；黃連清瀉肝火，可治肝火犯胃之癥。配以海螵蛸等名貴藥材，可治療胃潰瘍等多種胃部疾病。采用急性水浸應(yīng)激模型和乙酸灼燒慢性潰瘍實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型觀察該方對(duì)胃組織形態(tài)、胃潰瘍面和胃酸分泌、胃蛋白酶含量等指標(biāo)的影響評(píng)價(jià)其主要藥效作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

柴貝胃炎康膠囊由北京祥和康健科技發(fā)展有限公司生產(chǎn),產(chǎn)品批號(hào)：20150907。

奧美拉唑浙江華立南湖制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格20 mg/片批號(hào)：151003。

1.2 動(dòng)物清潔級(jí)

KM小鼠雌雄各半，體質(zhì)量18～20 g,由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供合格證號(hào)：1601187。SPF級(jí)SD大鼠雌雄各半，體質(zhì)量180～250 g,由中國食品藥品檢定研究院提供合格證號(hào)：11400500012734。

1.3 試劑

冰醋酸購于天津市永大化學(xué)試劑有限公司批號(hào)20130824。

1.4 儀器

電子天平,梅特勒—托利多(上海)有限公司生產(chǎn),型號(hào):AL204。解剖顯微鏡,OLYMPUS公司生產(chǎn),型號(hào):SZX12。顯微鏡,Olympus公司生產(chǎn),型號(hào):CH型。微量注射器,上海醫(yī)用激光儀器廠生產(chǎn),型號(hào):0.25 ML。切片機(jī),德國Leica公司生產(chǎn),型號(hào):RM2135。攤片機(jī),中國天津航利達(dá)公司生產(chǎn),型號(hào):TP-1。烘片機(jī),中國天津航利達(dá)公司生產(chǎn),型號(hào):HP-1。病理工作站,德國Leica公司生產(chǎn),型號(hào):DM2500。

1.5 方法

1.5.1 應(yīng)激性胃潰瘍實(shí)驗(yàn)分組、給藥和取材

KM小鼠60只體質(zhì)量18～20 g,按性別、體質(zhì)量隨機(jī)分為5組,每組12只。設(shè)模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組(奧美拉唑8 mg/kg)、供試品三個(gè)劑量組,0.6 g、1.2 g、2.4 g/kg相當(dāng)于臨床推薦劑量的6、12、24倍。藥物組采用等容積不等濃度灌胃,每日1次，給藥容積為0.1 mL/10 g體質(zhì)量。模型組給予等量0.5%的CMC-Na,每日1次。連續(xù)5 d,第4天開始禁食不禁水。第5天給藥后30 min,將小鼠仰臥固定于鐵絲網(wǎng)板，浸于(20±1)℃水槽內(nèi),水面齊劍突[5]。16 h后頸椎移位處死動(dòng)物、剖腹、結(jié)扎幽門和賁門,向胃內(nèi)注入1%福爾馬林1.5 mL固定30 min。沿胃大彎將胃壁剪開，將其平鋪透光玻璃板上,讀取潰瘍點(diǎn)數(shù)目或潰瘍指數(shù),并計(jì)算潰瘍抑制率。

1.5.2 乙酸灼燒形成的胃潰瘍實(shí)驗(yàn)分組、給藥和取材

SD大鼠60只,體質(zhì)量180～200 g，按性別、體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，每組12只,雌雄各半。大鼠胃體與幽門交界處注入10% 醋酸50 μL，形成丘疹，制備酸刺激慢性潰瘍模型，按性別、體質(zhì)量隨機(jī)分為模型對(duì)照組(0.5% CMC-Na),陽性對(duì)照組(給予奧美拉唑8 mg/kg),供試品低、中、高三個(gè)組(給藥劑量分別為0.4 g、0.8 g、1.6 g/kg，此劑量分別相當(dāng)于臨床推薦劑量4、8、16 倍)。以上各組動(dòng)物均灌胃給藥每日1次，連續(xù)灌胃14 d。術(shù)前禁食不禁水，末次給藥后3h 在幽門與十二指腸結(jié)合部位結(jié)扎，術(shù)后6h 測(cè)量取胃內(nèi)容物，用于測(cè)量胃蛋白酶活性、胃液總量及游離酸含量。沿胃大彎剪開,將胃壁展開，觀察胃壁損傷情況并照相,用ImageJ軟件分析胃壁損傷面積和愈合百分率。每組取6只胃組織置于10%福爾馬林固定常規(guī)石蠟包埋切片蘇木素-伊紅染色(HE染色)作常規(guī)組織病理學(xué)觀察。應(yīng)用定量分析系統(tǒng)光鏡下測(cè)定胃潰瘍深度及炎癥反應(yīng)程度,按文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[6]并加以改進(jìn)，用半定量法判定胃壁病變程度。見表1。

表1 組織病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)

1.5.3 指標(biāo)觀察與檢測(cè)方法

1.5.3.1 潰瘍指數(shù)

用潰瘍長度總和(毫米數(shù))作為潰瘍指數(shù)，潰瘍抑制率(%)=(對(duì)照組潰瘍長度總和-給藥組潰瘍長度總和)/模型對(duì)照組潰瘍長度總和×100%[6]。

1.5.3.2 胃酸測(cè)定

收集全部胃液于離心管中3 000 r/min 離心15 min吸取上清為胃液量。 胃液游離酸量：取胃液1 mL置于燒杯中用pH計(jì)監(jiān)測(cè)pH，用20 mmol/L NaOH液滴定至pH=7時(shí)為游離酸滴定終點(diǎn),記錄消耗NaOH體積。消耗NaOH液毫升數(shù)×20×總胃液量為游離酸量(mmol)[7]。胃液總酸度： 取胃液1 mL置于燒杯中加入酚酞指示劑2滴,用0．02 mol/LNaOH液滴定至微紅色、作為總酸度滴定終點(diǎn)。兩次滴定消耗的NaOH液毫升數(shù)×20為總酸度(mmol/L)?？偹崃?總酸度×胃液量(mmol)。單位時(shí)間酸排出量(mmol/h) =總酸度×總胃液量÷6[7]。

1.5.3.3 胃蛋白酶活性采用Mett毛細(xì)玻管法

胃蛋白酶活性計(jì)算公式(U/ML)=平均值×16[8]。

1.5.3.4 胃內(nèi)壁損傷面的測(cè)量

將損傷部位照相，圖片導(dǎo)入電腦用ImageJ軟件測(cè)量損傷面積，并計(jì)算。損傷面積比率=損傷面大小/整個(gè)胃內(nèi)表大小×100%。

1.5.3.5 大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍組織病理學(xué)程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

取材：5組動(dòng)物中每組取6只(雌雄各3只)：沿小彎打開胃，從前胃至腺胃縱切取3～5條組織，固定，脫水，制作蠟塊。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

2 結(jié)果

2.1 柴貝胃炎康膠囊對(duì)應(yīng)激性小鼠胃潰瘍模型的影響

與模型組比較，奧美拉唑組小鼠潰瘍點(diǎn)數(shù)和潰瘍面長度均顯著減輕并且有統(tǒng)計(jì)差異(P<0.05)，柴貝胃炎康0.6 g/kg、1.2 g/kg、2.4 g/kg三個(gè)劑量組也有明顯減輕趨勢(shì)，并且0.6 g/kg和2.4 g/kg組有顯著性差異(P<0.01)。高劑量組潰瘍制率達(dá)67%，比奧美拉唑組49%還高，但無統(tǒng)計(jì)差異，詳見表2。結(jié)果提示柴貝胃炎康對(duì)小鼠水浸應(yīng)激性胃潰瘍的有明顯的保護(hù)作用。

表2 柴貝胃炎康對(duì)應(yīng)激性胃潰瘍模型小鼠的影響

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 柴貝胃炎康對(duì)乙酸灼燒形成的胃潰瘍大鼠模型的影響

2.2.1 對(duì)大鼠胃酸、胃液及胃蛋白酶分泌的影響

胃酸分泌情況可通過胃液中游離酸量、總酸量、總酸度和單位時(shí)間排酸量進(jìn)行考察。與模型組比較，奧美拉唑無論是從泌酸總量還是從單位時(shí)間分泌量，減少程度均有非常明顯差異 (P<0.01)，柴貝胃炎康低、中、高三個(gè)劑量組胃酸分泌減少，均有顯著性差異(P<0.05)，結(jié)果詳見表3。幽門結(jié)扎6 h后測(cè)量產(chǎn)生的胃液總量和胃蛋白酶活性，與模型組比較奧美拉唑?qū)ξ敢毫考拔傅鞍酌富钚跃鶡o顯著影響(P>0.05)，柴貝胃炎康膠囊各劑量組對(duì)胃蛋白酶活性影響不明顯，但是0.8 g/kg、1.6 g/kg 組胃液量顯著減少(P<0.05)，胃蛋白酶活總量有增多趨勢(shì)但無顯著性差異(P>0.05)，詳見表4。

表3 柴貝胃炎康對(duì)乙酸灼燒致大鼠胃酸分泌的影響

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01

表4 對(duì)大鼠潰瘍胃蛋白酶活性影響

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2.2 對(duì)胃壁灼燒創(chuàng)面的愈合效果觀察

通過ImageJ軟件對(duì)胃壁損傷面積進(jìn)行測(cè)量，以分析創(chuàng)面愈合效果，評(píng)價(jià)藥物的治療作用。與模型組比較，奧美拉唑明顯減少損傷面積絕對(duì)值，同時(shí)降低損傷面積比例(P<0.01)。柴貝胃炎康低、中、高三個(gè)劑量組損傷面積比例也顯著降低(P<0.01)，各劑量組與奧美拉唑組比較均無顯著性，結(jié)果見表5。

表5 柴貝胃炎康對(duì)胃壁損傷面積比例的影響

注：與模型組比較，*P<0．05，**P<0．01

2.2.3 對(duì)胃潰瘍組織病理學(xué)的影響

每組取6只動(dòng)物，將損傷部位胃組織取材后固定，HE染色觀察(見圖1)。模型組6只動(dòng)物中4只均出現(xiàn)黏膜至肌層新鮮出血、黏膜下層淤血以及膜局部壞死和局部肌肉壞死。另外兩只動(dòng)物出現(xiàn)輕度黏膜下層水腫及局部黏膜增厚。奧美拉唑組可見1例黏膜層黏膜下層和肌層的新鮮出血，其它5只動(dòng)物胃組織出現(xiàn)輕度黏膜下層水腫及局部黏膜增厚。柴貝胃炎康高劑量組可見一例雄性動(dòng)物胃漿膜層區(qū)域性炎細(xì)胞浸潤；中劑量組可見1例黏膜下層區(qū)域性新鮮出血，漿膜外異物肉芽腫；低劑量組可見輕度黏膜下層水腫及局部黏膜增厚。將每只動(dòng)物病理觀察結(jié)果進(jìn)行半定量評(píng)分(見表6)，結(jié)果提示柴貝胃炎康可促進(jìn)乙酸灼燒引發(fā)的潰瘍面愈合。

表6 柴貝胃炎康對(duì)乙酸灼燒胃組織病變程度的評(píng)分影響

3 討論

實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍模型造模方法很多，包括水浸應(yīng)激、幽門結(jié)扎、乙醇灌胃、非甾體抗炎藥及利血平等藥物誘導(dǎo)、乙酸或磷酸刺激等方法[9]。其中水浸應(yīng)激致胃潰瘍的動(dòng)物模型，主要是由于消化系統(tǒng)易受環(huán)境和情緒的影響，利用小鼠懼水習(xí)性造成一定程度的心理應(yīng)激，由此導(dǎo)致中樞下丘腦—垂體—腎上腺軸(Hypothalamic-pituitary- adrenal axis，HPA)被激活，從而使大腦皮層調(diào)控失衡，釋放大量?jī)翰璺影奉惿窠?jīng)激素，收縮胃壁血管及毛細(xì)血管，使胃黏膜微循環(huán)血流量減少、黏膜缺血，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣減少表皮細(xì)胞損傷后無法修復(fù)再生；繼發(fā)性的氧自由基增加使得血管通透性增加以及黏膜水腫。由于胃黏膜微循環(huán)血流量是重要的胃黏膜保護(hù)屏障，胃黏膜缺血而形成應(yīng)激損傷均出現(xiàn)不同程度潰瘍甚至糜爛[10]。本方中君藥柴胡、枳實(shí)為君藥可疏肝解郁、行氣散結(jié)從中醫(yī)理論來說肝主疏泄促氣血于全身可促進(jìn)胃部微循環(huán)合理再分布。從而達(dá)到治療潰瘍的作用,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示合方對(duì)于抑制潰瘍有效果。

總之，通過對(duì)“四逆散”和“左金丸”等經(jīng)典名方加減裁化而成的柴貝胃炎康膠囊，無論是對(duì)水浸應(yīng)激導(dǎo)致的急性胃潰瘍，還是對(duì)乙酸刺激形成的慢性胃潰瘍均表現(xiàn)出較好的治療作用，提示在其擬定的臨床使用劑量下可用于急慢性胃潰瘍的治療。