胡兵，安紅梅，閆霞，鄭佳露，黃曉偉，李淼

(1.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院 中醫(yī)腫瘤研究所 腫瘤科，上海 200032；2.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院 科技處，上海 200032)

龍葵是茄科茄屬植物龍葵SolanumnigrumL.的全草，性寒味苦，有小毒，具有清熱解毒、利水消腫功效，可以用于感冒、牙痛、慢性支氣管炎、泌尿系感染等炎性疾病的治療，現(xiàn)廣泛用于各種腫瘤的治療。龍葵可以抑制腫瘤細胞增殖，阻滯細胞周期，誘導細胞凋亡和自噬，增強化療作用，抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生成，并可改善免疫功能[1-2]。龍葵含有糖苷生物堿、糖蛋白、多糖以及多酚等成分，澳洲茄邊堿是其中的糖苷生物堿之一[3]。本研究觀察了澳洲茄邊堿對大腸癌HCT116細胞的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株與試劑

人大腸癌細胞株HCT116購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。DMEM培養(yǎng)基購自美國Corning公司。胎牛血清購自澳大利亞Ausbian公司。澳洲茄邊堿購自美國APExBIO公司。CCK-8(Cell Counting Kit-8)為美國Sigma公司產(chǎn)品。細胞凋亡檢測試劑盒為美國eBioscience公司產(chǎn)品。Casapse-3活性檢測試劑盒為美國Promega公司產(chǎn)品。

1.2 細胞增殖檢測

5×103對數(shù)生長期HCT116細胞接種于96孔板，接種后第2天加入不同濃度澳洲茄邊堿或等體積DMSO，每組3個復孔；藥物作用24 h、48 h和72 h后加入10 μL CCK-8，37 ℃反應4 h，酶標儀450 nm波長檢測各孔OD值，按公式計算細胞存活率：細胞存活率=實驗組OD值/對照組OD值。

1.3 克隆形成實驗

1×103對數(shù)生長期HCT116細胞接種于6孔板，接種后第2天加入不同澳洲茄邊堿或等體積DMSO，每組3個復孔，每3天換液1次；9 d后4%多聚甲醛固定細胞，Giemsa染色，計數(shù)克隆數(shù)，計算克隆形成抑制率：克隆形成抑制率=[(對照組克隆數(shù)-實驗組克隆數(shù))/對照組克隆數(shù)]×100%。

1.4 細胞凋亡檢測

5×105對數(shù)生長期HCT116細胞接種于6孔板，接種后第2天加入不同澳洲茄邊堿或等體積DMSO，每組3個復孔；藥物作用48 h后收集細胞，按試劑盒說明書Annexin V-APC/PI標記細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.5 Caspase-3活性檢測

1×104對數(shù)生長期HCT116細胞接種96孔板，接種后第2天加入不同澳洲茄邊堿或等體積DMSO，每組3個復孔；藥物作用48 h后，參考試劑盒說明書檢測Caspase-3活性，結(jié)果以對照組倍數(shù)表示。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 澳洲茄邊堿對HCT116細胞增殖作用

采用CCK-8法檢測澳洲茄邊堿對HCT116細胞增殖的作用，結(jié)果顯示，4～32 μmol/L澳洲茄邊堿作用48 h可以抑制HCT116細胞增殖(表1)。研究進一步選取3個劑量，觀察了澳洲茄邊堿不同作用時間對HCT116細胞增殖的影響，結(jié)果顯示，6～10 μmol/L澳洲茄邊堿可以抑制HCT116細胞增殖，呈劑量與時間依賴性(見圖1)(P<0.01)。

表1 澳洲茄邊堿對HCT116細胞增殖作用

注：與對照組比較，**P<0.01

圖1 澳洲茄邊堿不同作用時間對HCT116細胞增殖影響

2.2 澳洲茄邊堿對HCT116細胞克隆形成作用

采用平板法檢測HCT116細胞克隆形成，結(jié)果顯示，澳洲茄邊堿可以抑制HCT116細胞克隆形成，與對照組比較差異顯著(表2)(P<0.01)。

表2 澳洲茄邊堿對HCT116細胞克隆形成作用

注：與對照組比較，**P<0.01

2.3 澳洲茄邊堿對HCT116細胞凋亡作用

采用Annexin V-APC/PI雙色熒光標記，流式細胞儀檢測細胞凋亡，結(jié)果顯示澳洲茄邊堿可以促HCT116細胞凋亡，與對照組比較差異顯著(表3)(P<0.01)。

表3 澳洲茄邊堿對HCT116細胞凋亡作用

注：與對照組比較，**P<0.01

2.4 澳洲茄邊堿對HCT116細胞Caspase-3活性影響

采用試劑盒檢測澳洲茄邊堿對HCT116細胞Caspase-3活性影響，結(jié)果顯示澳洲茄邊堿可以顯著增強HCT116細胞Caspase-3活性(見表4)(P<0.01)。

表4 澳洲茄邊堿對HCT116細胞Caspase-3活性影響

注：與對照組比較，**P<0.01

3 討論

大腸癌是全球最常見惡性腫瘤之一，在全球男性腫瘤發(fā)病率居第三位，在全球女性中居第二位；在我國，大腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢，在男性和女性腫瘤發(fā)病中居第五和第四位[4-5]。中醫(yī)藥在大腸癌的治療中發(fā)揮了重要的作用[6-7]；龍葵是大腸癌臨床最常用的抗癌中藥之一，在大腸癌細胞中具有廣泛的抗癌作用；澳洲茄邊堿(Solamargine)是龍葵的主要成分之一[1-3]。

腫瘤細胞用于基因表達或功能的異常，呈現(xiàn)失控增殖，增殖異常是腫瘤細胞的基本特征之一；抑制細胞增殖和或阻滯細胞增殖周期是藥物治療腫瘤的重要策略。本研究首先觀察了澳洲茄邊堿對HCT116細胞增殖的作用，結(jié)果顯示，澳洲茄邊堿可以抑制HCT116細胞增殖，呈劑量與時間依賴性；澳洲茄邊堿長時間作用可抑制HCT116細胞克隆形成；提示澳洲茄邊堿對HCT116細胞有較好的抗癌作用。

細胞凋亡是相關(guān)信號作用下，細胞在內(nèi)在蛋白調(diào)控下的自主性細胞死亡，可以呈現(xiàn)凋亡小體、DNA斷裂等特征變化[8]。Annexin V/PI標記是細胞凋亡的經(jīng)典檢測方法。在正常細胞中，磷酯酰絲氨酸位于細胞膜內(nèi)側(cè)；在凋亡細胞中，磷酯酰絲氨酸外翻到細胞表面；Annexin V是一種Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，可與凋亡細胞表面的磷酯酰絲氨酸結(jié)合，通過Annexin V偶聯(lián)的熒光素可檢測早期細胞凋亡。中晚期凋亡細胞的細胞膜完整性破壞，PI可以進入細胞與DNA結(jié)合呈現(xiàn)紅色熒光，從而可檢測中晚期凋亡。本研究采用，Annexin V/PI標記流式細胞儀檢測顯示，澳洲茄邊堿可激發(fā)HCT116細胞凋亡。

細胞凋亡受多個蛋白的調(diào)控，目前研究顯示細胞凋亡主要有外源通路(死亡受體通路)、內(nèi)源通路(線粒體通路)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路；腫瘤治療研究較多的是外源通路和內(nèi)源通路。在外源通路中，死亡配體如TNFα、FasL與對應受體結(jié)合，相繼激活Caspase-8和3，啟動細胞凋亡；在內(nèi)源通路中，凋亡相關(guān)信號促使線粒體釋放細胞色素C，繼而活化Caspase-9和3，激發(fā)細胞凋亡；Caspase-3是細胞凋亡過程中的關(guān)鍵蛋白酶[9-10]。本研究結(jié)果顯示，澳洲茄邊堿作用后，HCT116細胞Caspase-3活性增強，提示Caspase-3參與澳洲茄邊堿對HCT116細胞凋亡的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示澳洲茄邊堿可以抑制HCT116細胞增殖和克隆形成，促HCT116細胞凋亡，其作用機制可能與活化Capase-3相關(guān)，值得進一步研究。