高 瀟,王 冰,姚 佳,朱玉貞,王 靜
青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系,山東 青島 266000
Src羧基末端激酶結(jié)合蛋白(Csk-binding protein,CBP)也被稱為富含鞘磷脂的脂膜微區(qū)結(jié)合酪氨酸磷酸化蛋白(phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains,PAG),是新近發(fā)現(xiàn)的通過(guò)棕櫚?;揎棸邢蛑さ囊种菩钥缒そ宇^蛋白。CBP在細(xì)胞質(zhì)上的脂質(zhì)修飾是棕櫚?;?]。這種棕櫚?;揎棇BP錨定在脂筏上,位于脂筏上的CBP通過(guò)促進(jìn)Src的失活發(fā)揮Src介導(dǎo)的抑制腫瘤進(jìn)展的功能。CBP的表達(dá)在Src轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和各種人癌細(xì)胞中下調(diào),表明CBP作為腫瘤抑制劑的潛在作用。有研究表明CBP與許多細(xì)胞過(guò)程和惡性條件相關(guān)聯(lián)[2-5],棕櫚?;稽c(diǎn)突變后的CBP將不能定位到脂筏上。因而作為Src家族激酶(Src-family kinases,SFK)重要調(diào)節(jié)因子的CBP在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出的不同的調(diào)節(jié)機(jī)制,其前提可能是棕櫚?;揎椇笫笴BP錨定脂筏上。雖然CBP在腫瘤中的作用已經(jīng)引起了很多關(guān)注,然而,皮膚鱗狀細(xì)胞癌中CBP棕櫚?;稽c(diǎn)突變對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌的生物學(xué)效應(yīng)仍然未知。本實(shí)驗(yàn)擬將CBP棕櫚?;稽c(diǎn)突變,探究棕櫚?;稽c(diǎn)突變對(duì)CBP在A431細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的影響,為腫瘤靶向治療提供新的靶點(diǎn)。
人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心,WT CBP-EGFP、Mutant CBP-EGFP以及陰性對(duì)照的慢病毒融合蛋白表達(dá)載體由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建。DMED培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司,血清、青霉素/鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,transwell小室(8.0 μm孔徑PC膜)購(gòu)自美國(guó)Corning公司,Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司,CCK-8試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,CBP、Fyn、Csk兔抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司,熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司,顯影儀購(gòu)自德國(guó)LI-COR Biosciences Odyssey CLx公司。
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
A431細(xì)胞系培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基內(nèi)(含10%胎牛血清、100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素),置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%及飽和濕度的細(xì)胞溫育箱中培養(yǎng)。
1.2.2 病毒轉(zhuǎn)染、檢測(cè)及穩(wěn)定株建立
將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A431細(xì)胞接種至6孔板,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到60%~70%,根據(jù)慢病毒使用說(shuō)明書(shū)推薦的病毒感染細(xì)胞所用培養(yǎng)基體積和病毒量,將陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組病毒液分別加入無(wú)雙抗的培養(yǎng)基稀釋,再分別加入終濃度為8 μg/mL 聚凝胺(polybrene),使6孔板終體積為2.5 mL,混勻后在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng);轉(zhuǎn)染10~12 h后觀察細(xì)胞狀態(tài),同時(shí)采集同視野3組細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡下的熒光情況,并更換完全培養(yǎng)基培養(yǎng),用分選流式細(xì)胞儀檢測(cè)72 h后慢病毒轉(zhuǎn)染A431后熒光的表達(dá)情況,并做分選。篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染僅含EGFP陰性對(duì)照病毒的A431細(xì)胞記為陰性對(duì)照組(Control組),將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CBP的A431細(xì)胞記為陽(yáng)性(過(guò)表達(dá))對(duì)照組(WTCBP組),將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染棕櫚?;稽c(diǎn)突變的CBPEGFP病毒的A431細(xì)胞記為實(shí)驗(yàn)組(Mutant-CBP組)??瞻讓?duì)照組為未進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的A431細(xì)胞(Parental組)。
1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中CBP的mRNA表達(dá)
TRIzol提取細(xì)胞總RNA。SYBR Green標(biāo)記產(chǎn)物,按照RTFQ-PCR檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明,建立反應(yīng)體系。CBP基因上游引物為5’-TCAGCCTGAGAGGAGGAAAT-3’,下游引物為5’-GCTCCTGCTACTTGGG AGTC-3’;GAPDH基因上游引物為5’-GATGA CCTTGCCCACAGCCT-3’,下游引物為5’-ATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-3’。反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、 72 ℃ 10 s,40個(gè)循環(huán)。各樣品目的基因和管家基因進(jìn)行RTFQ-PCR反應(yīng),分別獲得Ct值,通過(guò)2-△△Ct方法分析各樣品相對(duì)CBP表達(dá)水平差異,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。各組實(shí)驗(yàn)以Parental組的表達(dá)量設(shè)定為1,計(jì)算出其他組的相對(duì)表達(dá)量,以相對(duì)倍數(shù)進(jìn)行作圖。
1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中CBP蛋白水平
收取上述處理后細(xì)胞提取和純化細(xì)胞總蛋白,用蛋白質(zhì)定量(bicinchoninic acid,BCA法)測(cè)定蛋白濃度,計(jì)算上樣。取20 mL蛋白行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,濕轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜后,5%脫脂奶粉封閉1 h,加入一抗 4 ℃溫育過(guò)夜,洗膜緩沖液(TRIS-buffered saline tween,TBST)漂洗3次,每次5 min,加入相應(yīng)濃度的二抗稀釋液,室溫2 h,采用TBST緩沖液漂洗5次,每次5 min,暗室下顯影。
1.2.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞增殖
將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4組細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/孔,分別接種于96孔板,以上各組均設(shè)立1個(gè)調(diào)零孔和4個(gè)平行復(fù)孔。在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別在0、24、48、72、96和120 h(即第1、2、3、4、5和6天)6個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,每孔加入10 μL CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)2 h,在多功能酶標(biāo)儀上檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(D值)。以D值為縱坐標(biāo),時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。上述操作重復(fù)3次。
1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)(f low cytometry,F(xiàn)CM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡
加入不含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)的0.25%胰蛋白酶消化收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4種細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液,冷磷酸鹽緩沖溶液(phosphate-buffered saline,PBS)、1×結(jié)合緩沖液各洗滌細(xì)胞1次,再用 100 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL。取1 mL細(xì)胞懸液加入5 μL Annexin Ⅴ-APC室溫避光反應(yīng)15 min,2 300×g離心30 s,棄上清液,用500 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,再加5 μL碘化丙啶(propidium iodide,PI)用400目的篩網(wǎng)過(guò)濾后,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.7 劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)
分別收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4組細(xì)胞,以1×106個(gè)/孔接種于6孔板,每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度約為95%,用200 μL無(wú)菌微量移液頭在6孔板內(nèi)垂直孔板在單層細(xì)胞上劃痕,盡量保持每孔劃出的細(xì)胞“傷口”寬度相同。加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),分別在0、24 h觀察劃痕愈合的情況并拍照,計(jì)算傷口愈合率(觀察點(diǎn)劃痕寬度/起始點(diǎn)劃痕寬度),以反映各組細(xì)胞遷移能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.8 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)
收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4組細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL,transwell小室上室分別加入各組細(xì)胞的單細(xì)胞懸液200 μL,小室內(nèi)的細(xì)胞是重懸在無(wú)血清的培養(yǎng)基中,將小室置于24孔板,并在下室加入650 μL含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液,置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。取出小室,吸出小室中培養(yǎng)基,小心擦去上層細(xì)胞,PBS洗2次,倒置晾干,用甲醇于4 ℃固定30 min,再用0.1%結(jié)晶紫染色 20 min,染色后用1×PBS沖洗,并用棉簽輕輕擦去微孔膜上層的細(xì)胞。在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察共計(jì)數(shù)中央和四周各5個(gè)視野(×400),取平均值。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。
1.2.9 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)
將Matrigel基質(zhì)膠4 ℃過(guò)夜融化,transwell小室及所用的微量移液頭均置于4 ℃預(yù)冷。用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液將其1∶8稀釋混勻。100 μL包被transwell小室聚碳酸脂膜上室面,37 ℃過(guò)夜溫育凝固備用。整個(gè)操作過(guò)程在冰上及無(wú)菌條件下進(jìn)行。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL,加入小室后繼續(xù)溫育24 h,其他實(shí)驗(yàn)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。
1.2.10 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)蛋白水平 變化
收取上述處理后細(xì)胞提取和純化細(xì)胞總蛋白,重復(fù)上述1.2.4的操作。此時(shí)一抗用Csk(1∶1 000)、Fyn(1∶1 000)蛋白特異性單克隆抗體。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。
圖 1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞的熒光率Fig. 1 Transfection efficiency detected by f low cytometry
根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染慢病毒96 h后,在熒光顯微鏡下觀察熒光情況,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染率及光鏡下細(xì)胞的狀態(tài),確定感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為100時(shí)為慢病毒轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞最佳濃度滴度。MOI=100轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞96h后,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄病毒感染A431細(xì)胞效率(圖1),Control組、WT-CBP組以及Mutant-CBP組流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染率分別為86.2%、88.1%及87.8%,轉(zhuǎn)染后RTFQ-PCR檢測(cè)WT-CBP組和Mutant-CBP組中CBP基因mRNA的表達(dá)量分別約為Parental組的1.65和1.68倍(圖2)。Western blot進(jìn)一步證明WT-CBP組和Mutant-CBP組轉(zhuǎn)染后CBP蛋白的表達(dá)量(0.89±0.03, 0.92±0.02)相比Parental組(0.41±0.04)和Control組(0.41±0.03)明顯增加,證明轉(zhuǎn)染成功,WT-CBP組和Mutant-CBP組中的CBP穩(wěn)定過(guò)表達(dá)(圖3)。
圖 2 RTFQ-PCR分析轉(zhuǎn)染后CBP mRNA的表達(dá)Fig. 2 Expression level of CBP assayed by RTFQ-PCR after transfection
圖 3 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CBP蛋白的水平Fig. 3 Expression of CBP protein after transfection measured by Western blot
CCK-8實(shí)驗(yàn)對(duì)4組細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,WT-CBP組與Parental組和Control組相比,野生型CBP的過(guò)表達(dá)明顯抑制細(xì)胞的增殖(P<0.05),而過(guò)表達(dá)棕櫚?;稽c(diǎn)突變的Mutant-CBP組與WT-CBP組相比,過(guò)表達(dá)棕櫚?;稽c(diǎn)突變的CBP失去了抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的能力,在2~6 d組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4)。這提示CBP過(guò)表達(dá)明顯抑制A431細(xì)胞的生長(zhǎng)效率,而CBP棕櫚?;稽c(diǎn)突變使其對(duì)細(xì)胞增殖抑制的作用明顯減弱,甚至喪失。
圖 4 CBP棕櫚?;稽c(diǎn)突變對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響Fig. 4 The effect of mutant-CBP on proliferation ability of human cSCC cell line A431
采用Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行APC 染色,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的散點(diǎn)圖分析結(jié)果顯示,Control組和Parental組分別為(14.40±0.96)% 和(14.60±0.40)%;WT-CBP組細(xì)胞發(fā)生中晚期凋亡壞死的細(xì)胞為(31.40±1.45)%,分別與Control組和Parental組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.001,圖5)。Mutant-CBP組細(xì)胞發(fā)生中晚期凋亡壞死的細(xì)胞為(16.50±0.74)%,與WT-CBP組比較凋亡率減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05),說(shuō)明CBP過(guò)表達(dá)可以誘導(dǎo)A431細(xì)胞發(fā)生凋亡,而棕櫚酰化位點(diǎn)突變的CBP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力明顯減弱,也就是說(shuō)棕櫚?;稽c(diǎn)突變的CBP喪失了發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的生物學(xué) 功能。
劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:劃痕24 h后,各組細(xì)胞均有一定程度的愈合,其中WT-CBP組(70.36±4.61)與Control組(173.74±5.26)和Parental組(197.81±6.51)相比,劃痕愈合率明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);Mutant-CBP組(157.34±3.26)與WT-CBP組相比,劃痕愈合率明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖6)。
Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Mutant-CBP組穿孔細(xì)胞數(shù)量為164.00±2.46,WT-CBP組細(xì)胞穿孔細(xì)胞數(shù)目為56.00±2.09,Control組細(xì)胞穿孔細(xì)胞數(shù)目為176.00±2.23,Parental組穿孔細(xì)胞數(shù)目為180.00±2.34,與劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致, WTCBP組與Control組和Parental組相比,細(xì)胞遷移數(shù)量明顯減少(P<0.001),而Mutant-CBP組細(xì)胞遷移數(shù)量與WT-CBP組相比明顯增多(圖7)。這表明CBP的過(guò)表達(dá)明顯抑制了A431細(xì)胞的遷移能力,但棕櫚酰化位點(diǎn)突變的CBP對(duì)A431細(xì)胞遷移能力的影響明顯減弱甚至喪失。
圖 5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CBP棕櫚?;稽c(diǎn)突變對(duì)細(xì)胞凋亡能力的影響Fig. 5 The effect of mutant-CBP on apoptosis ability of human cSCC cell line A431 by f low cytometry
圖 6 劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)棕櫚?;稽c(diǎn)突變的CBP對(duì)A431細(xì)胞遷移能力的影響Fig. 6 Effect of mutant-CBP on migration ability of cSCC cell line A431 detected by wound-healing assay
圖 7 Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)棕櫚?;稽c(diǎn)突變的CBP對(duì)A431細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Fig. 7 Effect of mutant-CBP on migration and invasion ability of A431 detected by transwell assay
Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,WT-CBP組細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)穿孔細(xì)胞數(shù)目(7.07±0.72)與Control組和Parental組(13.85±0.48,13.42±1.19)相比減少(P<0.001),Mutant-CBP組細(xì)胞侵襲穿孔數(shù)目(12.89±0.48)與WTCBP組相比明顯增多,而與Control組和Parental組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖7)。這表明CBP的過(guò)表達(dá)明顯抑制了A431細(xì)胞的侵襲能力,但棕櫚?;稽c(diǎn)突變的CBP對(duì)A431細(xì)胞侵襲的抑制能力減弱,甚至喪失。
Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Csk和Fyn蛋白表達(dá)水平(圖8)。有研究表明CBP通過(guò)調(diào)節(jié)上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的蛋白酪氨酸激酶Csk、Fyn來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖活性[6]。本研究結(jié)果顯示,與Parental組(1.31±0.06, 1.13±0.07)和Control組(0.95±0.04, 1.39±0.07)相比,WT-CBP組Csk和Fyn蛋白相對(duì)表達(dá)水平(2.37±0.08, 2.37±0.06)明顯增多(P<0.001),而Mutant-CBP組Csk和Fyn相對(duì)表達(dá)水平(1.48±0.07, 1.09±0.05)與WT-CBP組相比明顯減少(P <0.05)。上述結(jié)果表明伴隨外源性野生型CBP的過(guò)表達(dá),A431細(xì)胞可以活化更多的Csk招募CBP到脂筏上,參與調(diào)節(jié)Fyn的活化來(lái)調(diào)控細(xì)胞的活性,與之前的報(bào)道一致。而在高表達(dá)棕櫚酰化位點(diǎn)突變的CBP的A431細(xì)胞中,棕櫚?;稽c(diǎn)突變的CBP不會(huì)影響Src相關(guān)蛋白Csk和Fyn的表達(dá) 水平。
圖 8 Western blot檢測(cè)棕櫚?;稽c(diǎn)突變的CBP在A431細(xì)胞中過(guò)表達(dá)對(duì)蛋白酪氨酸激酶Csk和Fyn表達(dá)水平的影響Fig. 8 The inf luence of mutant-CBP on the activation of Fyn and Csk detected by Western blot
脂筏(1ipid raft)是細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)域,在細(xì)胞膜上呈島狀分布,如漂浮的木筏,因此被稱為脂筏。脂筏可動(dòng)態(tài)性和選擇性地聚集多種蛋白質(zhì),使膜蛋白區(qū)域化進(jìn)而使膜功能區(qū)域化。定位于脂筏上的接頭蛋白,它們共同含有一個(gè)將其定位于脂筏上的模體[C-X-X-C,C=半胱氨酸(Cys),X=任意氨基酸]。Cys被棕櫚?;螅宇^分子被錨定于脂筏上。CBP在細(xì)胞質(zhì)上的脂質(zhì)修飾是棕櫚?;?,7-8],這種棕櫚?;揎椩诩?xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中都起著重要的作用[9]。且有研究表明棕櫚?;稽c(diǎn)突變后的CBP將不能定位到脂筏上[10]。
CBP是短胞外域和一個(gè)較長(zhǎng)的胞質(zhì)域構(gòu)成的參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)的跨膜銜接蛋白[11]。CBP的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有棕櫚酰化位點(diǎn),使 CBP定位于富含膽固醇的膜微域,是參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)的接頭蛋白。位于脂筏上的CBP被SFK磷酸化后,CBP通過(guò)特定位點(diǎn)(人類中的Tyr-317)與C末端Src激酶(一種SFK的負(fù)調(diào)節(jié)劑)相關(guān)聯(lián)并使其與膜相關(guān)的SFK接近。然后Csk磷酸化SFK的C端負(fù)調(diào)節(jié)酪氨酸殘基,抑制它們的活化。SFKs是與膜相關(guān)的非受體蛋白酪氨酸激酶,在調(diào)節(jié)包括增殖、分化、黏附、遷移和存活在內(nèi)的各種細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此,Csk具有腫瘤抑制活性,并且研究表明其表達(dá)減少可以促進(jìn)由c-Src促進(jìn)的惡性細(xì)胞行為[12]。Csk是細(xì)胞質(zhì)蛋白[13],需要適當(dāng)?shù)哪ゃ暯拥鞍滓允蛊浣Y(jié)合錨定在膜上的c-Src。有研究已經(jīng)表明,發(fā)揮這種作用的蛋白質(zhì)為CBP,也稱為PAG[7],作為Csk的特定膜適配器[11]。CBP通過(guò)棕櫚酰化修飾定位于脂筏中,并通過(guò)將Csk募集到SFK積累的脂筏中參與調(diào)節(jié)Src家族激酶(SFK)的活性[14-15]。同時(shí)Fyn和Csk是與CBP相互作用蛋白中表現(xiàn)最好的兩種 蛋白[16]。
為了探討CBP棕櫚?;稽c(diǎn)突變對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌正常生物學(xué)行為的影響,本實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建有CBP棕櫚?;稽c(diǎn)中的半胱氨酸突變?yōu)楸彼幔–-X-X-C變?yōu)锳-X-X-A)的載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入A431細(xì)胞中,并用穩(wěn)定過(guò)表達(dá)棕櫚酰化位點(diǎn)正常(C-X-X-C)的野生型CBP的A431細(xì)胞作為對(duì)照,結(jié)果提示CBP的棕櫚?;稽c(diǎn)對(duì)CBP在控制皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞系惡性潛能方面的重要作用。但CBP膜近側(cè)的Cys被Ala替換后,棕櫚酰化位點(diǎn)突變,過(guò)表達(dá)棕櫚酰化位點(diǎn)突變的CBP并不呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)CBP的生物功能,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示棕櫚酰化位點(diǎn)突變的CBP影響了CBP在A431中發(fā)揮正常的細(xì)胞生物學(xué)功能,同時(shí)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示棕櫚酰化位點(diǎn)突變的CBP對(duì)Src家族激酶活性也沒(méi)有出現(xiàn)明顯的影響。說(shuō)明棕櫚?;稽c(diǎn)突變的CBP喪失了CBP通過(guò)促進(jìn)Src的失活發(fā)揮Src介導(dǎo)的抑制腫瘤進(jìn)展的生物學(xué)功能。
本研究表明,CBP通過(guò)Src信號(hào)通路抑制A431細(xì)胞的增殖,并誘導(dǎo)凋亡,抑制細(xì)胞的遷移和侵襲。而CBP棕櫚?;稽c(diǎn)突變后,突變的CBP不再通過(guò)調(diào)節(jié)Src信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平的變化,而發(fā)揮抑癌的生物學(xué)效應(yīng)。最近,一些研究陸續(xù)表明CBP在惡性腫瘤中發(fā)揮不同的生物學(xué)作用,CBP根據(jù)不同的癌癥類型具有不同的功能。棕櫚?;稽c(diǎn)的突變也可能因?yàn)镃BP在不同細(xì)胞中生物學(xué)功能的不同,而發(fā)揮不同的生物學(xué)作用。為了闡明CBP的不同功能的分子基礎(chǔ),以及棕櫚?;稽c(diǎn)對(duì)不同細(xì)胞CBP生物學(xué)功能的影響,需要在每種情況下對(duì)棕櫚酰化位點(diǎn)突變的CBP功能進(jìn)行更廣泛的分析。尋找CBP參與癌細(xì)胞功能的信號(hào)途徑作用位點(diǎn),為癌癥的診斷與治療提供新的研究方向,并積極尋找抗癌藥物的新靶點(diǎn),以提高腫瘤患者的生存質(zhì)量,延長(zhǎng)生 存期。