高 瀟，王 冰，姚 佳，朱玉貞，王 靜

青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，山東 青島 266000

Src羧基末端激酶結(jié)合蛋白（Csk-binding protein，CBP）也被稱為富含鞘磷脂的脂膜微區(qū)結(jié)合酪氨酸磷酸化蛋白（phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains，PAG），是新近發(fā)現(xiàn)的通過(guò)棕櫚?；揎棸邢蛑さ囊种菩钥缒そ宇^蛋白。CBP在細(xì)胞質(zhì)上的脂質(zhì)修飾是棕櫚?；?］。這種棕櫚?；揎棇BP錨定在脂筏上，位于脂筏上的CBP通過(guò)促進(jìn)Src的失活發(fā)揮Src介導(dǎo)的抑制腫瘤進(jìn)展的功能。CBP的表達(dá)在Src轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和各種人癌細(xì)胞中下調(diào)，表明CBP作為腫瘤抑制劑的潛在作用。有研究表明CBP與許多細(xì)胞過(guò)程和惡性條件相關(guān)聯(lián)［2-5］，棕櫚?；稽c(diǎn)突變后的CBP將不能定位到脂筏上。因而作為Src家族激酶（Src-family kinases，SFK）重要調(diào)節(jié)因子的CBP在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出的不同的調(diào)節(jié)機(jī)制，其前提可能是棕櫚?；揎椇笫笴BP錨定脂筏上。雖然CBP在腫瘤中的作用已經(jīng)引起了很多關(guān)注，然而，皮膚鱗狀細(xì)胞癌中CBP棕櫚?；稽c(diǎn)突變對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌的生物學(xué)效應(yīng)仍然未知。本實(shí)驗(yàn)擬將CBP棕櫚?；稽c(diǎn)突變，探究棕櫚?；稽c(diǎn)突變對(duì)CBP在A431細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的影響，為腫瘤靶向治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，WT CBP-EGFP、Mutant CBP-EGFP以及陰性對(duì)照的慢病毒融合蛋白表達(dá)載體由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建。DMED培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，血清、青霉素/鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，transwell小室（8.0 μm孔徑PC膜）購(gòu)自美國(guó)Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司，CCK-8試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，CBP、Fyn、Csk兔抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，顯影儀購(gòu)自德國(guó)LI-COR Biosciences Odyssey CLx公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

A431細(xì)胞系培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基內(nèi)（含10%胎牛血清、100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素），置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%及飽和濕度的細(xì)胞溫育箱中培養(yǎng)。

1.2.2 病毒轉(zhuǎn)染、檢測(cè)及穩(wěn)定株建立

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A431細(xì)胞接種至6孔板，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到60%～70%，根據(jù)慢病毒使用說(shuō)明書(shū)推薦的病毒感染細(xì)胞所用培養(yǎng)基體積和病毒量，將陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組病毒液分別加入無(wú)雙抗的培養(yǎng)基稀釋，再分別加入終濃度為8 μg/mL 聚凝胺（polybrene），使6孔板終體積為2.5 mL，混勻后在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染10～12 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)采集同視野3組細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡下的熒光情況，并更換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，用分選流式細(xì)胞儀檢測(cè)72 h后慢病毒轉(zhuǎn)染A431后熒光的表達(dá)情況，并做分選。篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染僅含EGFP陰性對(duì)照病毒的A431細(xì)胞記為陰性對(duì)照組（Control組），將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CBP的A431細(xì)胞記為陽(yáng)性（過(guò)表達(dá)）對(duì)照組（WTCBP組），將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染棕櫚?；稽c(diǎn)突變的CBPEGFP病毒的A431細(xì)胞記為實(shí)驗(yàn)組（Mutant-CBP組）?？瞻讓?duì)照組為未進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的A431細(xì)胞（Parental組）。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中CBP的mRNA表達(dá)

TRIzol提取細(xì)胞總RNA。SYBR Green標(biāo)記產(chǎn)物，按照RTFQ-PCR檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明，建立反應(yīng)體系。CBP基因上游引物為5’-TCAGCCTGAGAGGAGGAAAT-3’，下游引物為5’-GCTCCTGCTACTTGGG AGTC-3’；GAPDH基因上游引物為5’-GATGA CCTTGCCCACAGCCT-3’，下游引物為5’-ATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-3’。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、 72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。各樣品目的基因和管家基因進(jìn)行RTFQ-PCR反應(yīng)，分別獲得Ct值，通過(guò)2-△△Ct方法分析各樣品相對(duì)CBP表達(dá)水平差異，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。各組實(shí)驗(yàn)以Parental組的表達(dá)量設(shè)定為1，計(jì)算出其他組的相對(duì)表達(dá)量，以相對(duì)倍數(shù)進(jìn)行作圖。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中CBP蛋白水平

收取上述處理后細(xì)胞提取和純化細(xì)胞總蛋白，用蛋白質(zhì)定量（bicinchoninic acid，BCA法）測(cè)定蛋白濃度，計(jì)算上樣。取20 mL蛋白行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，濕轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜后，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗 4 ℃溫育過(guò)夜，洗膜緩沖液（TRIS-buffered saline tween，TBST）漂洗3次，每次5 min，加入相應(yīng)濃度的二抗稀釋液，室溫2 h，采用TBST緩沖液漂洗5次，每次5 min，暗室下顯影。

1.2.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）檢測(cè)細(xì)胞增殖

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/孔，分別接種于96孔板，以上各組均設(shè)立1個(gè)調(diào)零孔和4個(gè)平行復(fù)孔。在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別在0、24、48、72、96和120 h（即第1、2、3、4、5和6天）6個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在多功能酶標(biāo)儀上檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度（D值）。以D值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。上述操作重復(fù)3次。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)（f low cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)細(xì)胞凋亡

加入不含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的0.25%胰蛋白酶消化收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4種細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，冷磷酸鹽緩沖溶液（phosphate-buffered saline，PBS）、1×結(jié)合緩沖液各洗滌細(xì)胞1次，再用 100 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL。取1 mL細(xì)胞懸液加入5 μL Annexin Ⅴ-APC室溫避光反應(yīng)15 min，2 300×g離心30 s，棄上清液，用500 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再加5 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）用400目的篩網(wǎng)過(guò)濾后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)

分別收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4組細(xì)胞，以1×106個(gè)/孔接種于6孔板，每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度約為95%，用200 μL無(wú)菌微量移液頭在6孔板內(nèi)垂直孔板在單層細(xì)胞上劃痕，盡量保持每孔劃出的細(xì)胞“傷口”寬度相同。加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在0、24 h觀察劃痕愈合的情況并拍照，計(jì)算傷口愈合率（觀察點(diǎn)劃痕寬度/起始點(diǎn)劃痕寬度），以反映各組細(xì)胞遷移能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，transwell小室上室分別加入各組細(xì)胞的單細(xì)胞懸液200 μL，小室內(nèi)的細(xì)胞是重懸在無(wú)血清的培養(yǎng)基中，將小室置于24孔板，并在下室加入650 μL含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。取出小室，吸出小室中培養(yǎng)基，小心擦去上層細(xì)胞，PBS洗2次，倒置晾干，用甲醇于4 ℃固定30 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色 20 min，染色后用1×PBS沖洗，并用棉簽輕輕擦去微孔膜上層的細(xì)胞。在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察共計(jì)數(shù)中央和四周各5個(gè)視野（×400），取平均值。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.9 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

將Matrigel基質(zhì)膠4 ℃過(guò)夜融化，transwell小室及所用的微量移液頭均置于4 ℃預(yù)冷。用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液將其1∶8稀釋混勻。100 μL包被transwell小室聚碳酸脂膜上室面，37 ℃過(guò)夜溫育凝固備用。整個(gè)操作過(guò)程在冰上及無(wú)菌條件下進(jìn)行。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，加入小室后繼續(xù)溫育24 h，其他實(shí)驗(yàn)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.10 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)蛋白水平 變化

收取上述處理后細(xì)胞提取和純化細(xì)胞總蛋白，重復(fù)上述1.2.4的操作。此時(shí)一抗用Csk（1∶1 000）、Fyn（1∶1 000）蛋白特異性單克隆抗體。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定表達(dá)EGFP細(xì)胞株的鑒定

圖 1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞的熒光率Fig. 1 Transfection efficiency detected by f low cytometry

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染慢病毒96 h后，在熒光顯微鏡下觀察熒光情況，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染率及光鏡下細(xì)胞的狀態(tài)，確定感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為100時(shí)為慢病毒轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞最佳濃度滴度。MOI=100轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞96h后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄病毒感染A431細(xì)胞效率（圖1），Control組、WT-CBP組以及Mutant-CBP組流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染率分別為86.2%、88.1%及87.8%，轉(zhuǎn)染后RTFQ-PCR檢測(cè)WT-CBP組和Mutant-CBP組中CBP基因mRNA的表達(dá)量分別約為Parental組的1.65和1.68倍（圖2）。Western blot進(jìn)一步證明WT-CBP組和Mutant-CBP組轉(zhuǎn)染后CBP蛋白的表達(dá)量（0.89±0.03， 0.92±0.02）相比Parental組（0.41±0.04）和Control組（0.41±0.03）明顯增加，證明轉(zhuǎn)染成功，WT-CBP組和Mutant-CBP組中的CBP穩(wěn)定過(guò)表達(dá)（圖3）。

圖 2 RTFQ-PCR分析轉(zhuǎn)染后CBP mRNA的表達(dá)Fig. 2 Expression level of CBP assayed by RTFQ-PCR after transfection

圖 3 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CBP蛋白的水平Fig. 3 Expression of CBP protein after transfection measured by Western blot

2.2 棕櫚酰化位點(diǎn)突變的CBP失去了CBP對(duì)A431細(xì)胞增殖的抑制能力

CCK-8實(shí)驗(yàn)對(duì)4組細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，WT-CBP組與Parental組和Control組相比，野生型CBP的過(guò)表達(dá)明顯抑制細(xì)胞的增殖（P＜0.05），而過(guò)表達(dá)棕櫚?；稽c(diǎn)突變的Mutant-CBP組與WT-CBP組相比，過(guò)表達(dá)棕櫚?；稽c(diǎn)突變的CBP失去了抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，在2～6 d組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。這提示CBP過(guò)表達(dá)明顯抑制A431細(xì)胞的生長(zhǎng)效率，而CBP棕櫚?；稽c(diǎn)突變使其對(duì)細(xì)胞增殖抑制的作用明顯減弱，甚至喪失。

圖 4 CBP棕櫚?；稽c(diǎn)突變對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響Fig. 4 The effect of mutant-CBP on proliferation ability of human cSCC cell line A431

2.3 棕櫚酰化位點(diǎn)突變的CBP喪失誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的生物學(xué)功能

采用Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行APC 染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的散點(diǎn)圖分析結(jié)果顯示，Control組和Parental組分別為（14.40±0.96）% 和（14.60±0.40）%；WT-CBP組細(xì)胞發(fā)生中晚期凋亡壞死的細(xì)胞為（31.40±1.45）%，分別與Control組和Parental組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.001，圖5）。Mutant-CBP組細(xì)胞發(fā)生中晚期凋亡壞死的細(xì)胞為（16.50±0.74）%，與WT-CBP組比較凋亡率減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），說(shuō)明CBP過(guò)表達(dá)可以誘導(dǎo)A431細(xì)胞發(fā)生凋亡，而棕櫚酰化位點(diǎn)突變的CBP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力明顯減弱，也就是說(shuō)棕櫚?；稽c(diǎn)突變的CBP喪失了發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的生物學(xué) 功能。

2.4 棕櫚?；稽c(diǎn)突變的CBP喪失了CBP對(duì)傷口愈合的抑制能力

劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：劃痕24 h后，各組細(xì)胞均有一定程度的愈合，其中WT-CBP組（70.36±4.61）與Control組（173.74±5.26）和Parental組（197.81±6.51）相比，劃痕愈合率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；Mutant-CBP組（157.34±3.26）與WT-CBP組相比，劃痕愈合率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖6）。

2.5 棕櫚?；稽c(diǎn)突變的CBP喪失了CBP對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的抑制能力

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Mutant-CBP組穿孔細(xì)胞數(shù)量為164.00±2.46，WT-CBP組細(xì)胞穿孔細(xì)胞數(shù)目為56.00±2.09，Control組細(xì)胞穿孔細(xì)胞數(shù)目為176.00±2.23，Parental組穿孔細(xì)胞數(shù)目為180.00±2.34，與劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致， WTCBP組與Control組和Parental組相比，細(xì)胞遷移數(shù)量明顯減少（P＜0.001），而Mutant-CBP組細(xì)胞遷移數(shù)量與WT-CBP組相比明顯增多（圖7）。這表明CBP的過(guò)表達(dá)明顯抑制了A431細(xì)胞的遷移能力，但棕櫚酰化位點(diǎn)突變的CBP對(duì)A431細(xì)胞遷移能力的影響明顯減弱甚至喪失。

圖 5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CBP棕櫚?；稽c(diǎn)突變對(duì)細(xì)胞凋亡能力的影響Fig. 5 The effect of mutant-CBP on apoptosis ability of human cSCC cell line A431 by f low cytometry

圖 6 劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)棕櫚?；稽c(diǎn)突變的CBP對(duì)A431細(xì)胞遷移能力的影響Fig. 6 Effect of mutant-CBP on migration ability of cSCC cell line A431 detected by wound-healing assay

圖 7 Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)棕櫚?；稽c(diǎn)突變的CBP對(duì)A431細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Fig. 7 Effect of mutant-CBP on migration and invasion ability of A431 detected by transwell assay

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，WT-CBP組細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)穿孔細(xì)胞數(shù)目（7.07±0.72）與Control組和Parental組（13.85±0.48，13.42±1.19）相比減少（P＜0.001），Mutant-CBP組細(xì)胞侵襲穿孔數(shù)目（12.89±0.48）與WTCBP組相比明顯增多，而與Control組和Parental組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖7）。這表明CBP的過(guò)表達(dá)明顯抑制了A431細(xì)胞的侵襲能力，但棕櫚?；稽c(diǎn)突變的CBP對(duì)A431細(xì)胞侵襲的抑制能力減弱，甚至喪失。

2.6 棕櫚酰化位點(diǎn)突變的CBP細(xì)胞中CBP不再通過(guò)Csk、Fyn調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖

Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Csk和Fyn蛋白表達(dá)水平（圖8）。有研究表明CBP通過(guò)調(diào)節(jié)上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的蛋白酪氨酸激酶Csk、Fyn來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖活性［6］。本研究結(jié)果顯示，與Parental組（1.31±0.06， 1.13±0.07）和Control組（0.95±0.04， 1.39±0.07）相比，WT-CBP組Csk和Fyn蛋白相對(duì)表達(dá)水平（2.37±0.08， 2.37±0.06）明顯增多（P＜0.001），而Mutant-CBP組Csk和Fyn相對(duì)表達(dá)水平（1.48±0.07， 1.09±0.05）與WT-CBP組相比明顯減少（P ＜0.05）。上述結(jié)果表明伴隨外源性野生型CBP的過(guò)表達(dá)，A431細(xì)胞可以活化更多的Csk招募CBP到脂筏上，參與調(diào)節(jié)Fyn的活化來(lái)調(diào)控細(xì)胞的活性，與之前的報(bào)道一致。而在高表達(dá)棕櫚酰化位點(diǎn)突變的CBP的A431細(xì)胞中，棕櫚?；稽c(diǎn)突變的CBP不會(huì)影響Src相關(guān)蛋白Csk和Fyn的表達(dá) 水平。

圖 8 Western blot檢測(cè)棕櫚?；稽c(diǎn)突變的CBP在A431細(xì)胞中過(guò)表達(dá)對(duì)蛋白酪氨酸激酶Csk和Fyn表達(dá)水平的影響Fig. 8 The inf luence of mutant-CBP on the activation of Fyn and Csk detected by Western blot

3 討 論

脂筏（1ipid raft）是細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)域，在細(xì)胞膜上呈島狀分布，如漂浮的木筏，因此被稱為脂筏。脂筏可動(dòng)態(tài)性和選擇性地聚集多種蛋白質(zhì)，使膜蛋白區(qū)域化進(jìn)而使膜功能區(qū)域化。定位于脂筏上的接頭蛋白，它們共同含有一個(gè)將其定位于脂筏上的模體［C-X-X-C，C=半胱氨酸（Cys），X=任意氨基酸］。Cys被棕櫚?；螅宇^分子被錨定于脂筏上。CBP在細(xì)胞質(zhì)上的脂質(zhì)修飾是棕櫚?；?，7-8］，這種棕櫚?；揎椩诩?xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中都起著重要的作用［9］。且有研究表明棕櫚?；稽c(diǎn)突變后的CBP將不能定位到脂筏上［10］。

CBP是短胞外域和一個(gè)較長(zhǎng)的胞質(zhì)域構(gòu)成的參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)的跨膜銜接蛋白［11］。CBP的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有棕櫚酰化位點(diǎn)，使 CBP定位于富含膽固醇的膜微域，是參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)的接頭蛋白。位于脂筏上的CBP被SFK磷酸化后，CBP通過(guò)特定位點(diǎn)（人類中的Tyr-317）與C末端Src激酶（一種SFK的負(fù)調(diào)節(jié)劑）相關(guān)聯(lián)并使其與膜相關(guān)的SFK接近。然后Csk磷酸化SFK的C端負(fù)調(diào)節(jié)酪氨酸殘基，抑制它們的活化。SFKs是與膜相關(guān)的非受體蛋白酪氨酸激酶，在調(diào)節(jié)包括增殖、分化、黏附、遷移和存活在內(nèi)的各種細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，Csk具有腫瘤抑制活性，并且研究表明其表達(dá)減少可以促進(jìn)由c-Src促進(jìn)的惡性細(xì)胞行為［12］。Csk是細(xì)胞質(zhì)蛋白［13］，需要適當(dāng)?shù)哪ゃ暯拥鞍滓允蛊浣Y(jié)合錨定在膜上的c-Src。有研究已經(jīng)表明，發(fā)揮這種作用的蛋白質(zhì)為CBP，也稱為PAG［7］，作為Csk的特定膜適配器［11］。CBP通過(guò)棕櫚酰化修飾定位于脂筏中，并通過(guò)將Csk募集到SFK積累的脂筏中參與調(diào)節(jié)Src家族激酶（SFK）的活性［14-15］。同時(shí)Fyn和Csk是與CBP相互作用蛋白中表現(xiàn)最好的兩種 蛋白［16］。

為了探討CBP棕櫚?；稽c(diǎn)突變對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌正常生物學(xué)行為的影響，本實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建有CBP棕櫚?；稽c(diǎn)中的半胱氨酸突變?yōu)楸彼幔–-X-X-C變?yōu)锳-X-X-A）的載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入A431細(xì)胞中，并用穩(wěn)定過(guò)表達(dá)棕櫚酰化位點(diǎn)正常（C-X-X-C）的野生型CBP的A431細(xì)胞作為對(duì)照，結(jié)果提示CBP的棕櫚?；稽c(diǎn)對(duì)CBP在控制皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞系惡性潛能方面的重要作用。但CBP膜近側(cè)的Cys被Ala替換后，棕櫚酰化位點(diǎn)突變，過(guò)表達(dá)棕櫚酰化位點(diǎn)突變的CBP并不呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)CBP的生物功能，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示棕櫚酰化位點(diǎn)突變的CBP影響了CBP在A431中發(fā)揮正常的細(xì)胞生物學(xué)功能，同時(shí)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示棕櫚酰化位點(diǎn)突變的CBP對(duì)Src家族激酶活性也沒(méi)有出現(xiàn)明顯的影響。說(shuō)明棕櫚?；稽c(diǎn)突變的CBP喪失了CBP通過(guò)促進(jìn)Src的失活發(fā)揮Src介導(dǎo)的抑制腫瘤進(jìn)展的生物學(xué)功能。

本研究表明，CBP通過(guò)Src信號(hào)通路抑制A431細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)凋亡，抑制細(xì)胞的遷移和侵襲。而CBP棕櫚?；稽c(diǎn)突變后，突變的CBP不再通過(guò)調(diào)節(jié)Src信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平的變化，而發(fā)揮抑癌的生物學(xué)效應(yīng)。最近，一些研究陸續(xù)表明CBP在惡性腫瘤中發(fā)揮不同的生物學(xué)作用，CBP根據(jù)不同的癌癥類型具有不同的功能。棕櫚?；稽c(diǎn)的突變也可能因?yàn)镃BP在不同細(xì)胞中生物學(xué)功能的不同，而發(fā)揮不同的生物學(xué)作用。為了闡明CBP的不同功能的分子基礎(chǔ)，以及棕櫚?；稽c(diǎn)對(duì)不同細(xì)胞CBP生物學(xué)功能的影響，需要在每種情況下對(duì)棕櫚酰化位點(diǎn)突變的CBP功能進(jìn)行更廣泛的分析。尋找CBP參與癌細(xì)胞功能的信號(hào)途徑作用位點(diǎn)，為癌癥的診斷與治療提供新的研究方向，并積極尋找抗癌藥物的新靶點(diǎn)，以提高腫瘤患者的生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生 存期。