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        淋巴漿細(xì)胞性淋巴瘤/華氏巨球蛋白血癥10例臨床病理學(xué)特征分析及MYD88基因突變檢測

        2019-01-17 07:11:32王維格蔣翔男朱曉麗周曉燕李小秋
        中國癌癥雜志 2018年12期

        盛 東,王維格,蔣翔男,薛 田,朱曉麗,周曉燕,李小秋

        復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科,復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系 上海 200032

        淋巴漿細(xì)胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma,LPL)是一類相對少見的小B細(xì)胞淋巴瘤,臨床上以男性患者居多,常伴有骨髓受累、貧血和血清IgM型免疫球蛋白異常增 高[1]。組織學(xué)形態(tài)多表現(xiàn)為淋巴結(jié)副皮質(zhì)區(qū)、髓質(zhì)區(qū)彌漫性淋巴樣浸潤,腫瘤由數(shù)量不等的小淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和漿樣淋巴細(xì)胞組 成[1]。免疫表型而言,腫瘤細(xì)胞表達(dá)全B細(xì)胞抗原,并限制性表達(dá)免疫球蛋白輕鏈[1]。華氏巨球蛋白血癥(Waldenstr?m macroglobulinemia,WM)為LPL中累及骨髓并伴有血清IgM蛋白不同程度增高的病例[2]。LPL/WM常需與其他小B細(xì)胞性腫瘤、特別是伴有漿細(xì)胞樣分化的病例鑒 別[1],然而,相當(dāng)部分LPL/WM具有不典型臨床或組織病理學(xué)表現(xiàn)[3],使得此類鑒別診斷較為困難。近期研究發(fā)現(xiàn),絕大部分LPL/WM病例存在MYD88 L265P基因突變[4],而其他小B細(xì)胞類腫瘤則較少檢出這一異常[3-5]。在國外,利用二代測序等技術(shù)檢測MYD88 L265P突變已被應(yīng)用于臨床實踐,而在我國,應(yīng)用這一檢查手段診斷和鑒別LPL/WM尚未推廣、普及,相關(guān)報道亦不多見。本研究回顧性分析了10例LPL/WM的臨床病理學(xué)特點,并應(yīng)用傳統(tǒng)測序技術(shù)完成MYD88 L265P突變點檢查,從而探討這一分子生物學(xué)標(biāo)志物對于確診LPL/WM的意義。

        1 資料和方法

        1.1 臨床資料

        收集復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科2016年—2017年期間診斷的LPL/WM病例10例,對照組包括5例伴有顯著漿細(xì)胞性分化的黏膜相關(guān)淋巴組織(mucosa-associated lymphoid tissue,MALT)型邊緣區(qū)淋巴瘤、4例低級別濾泡性淋巴瘤以及4例小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤/慢性淋巴細(xì)胞性白血?。╯mall lymphocytic lymphoma/chronic lymphocytic leukemia,SLL/CLL),復(fù)閱所有病例的H-E及免疫組織化學(xué)染色切片,并適當(dāng)補(bǔ)充、完善免疫組織化學(xué)指標(biāo)檢測。所有病例診斷均由3位淋巴瘤專科病理醫(yī)師復(fù)核、確認(rèn)?;颊吲R床資料來自病史以及部分電話隨訪信息。

        1.2 免疫組織化學(xué)染色

        采用全自動免疫組織化學(xué)分析儀(BenchMark XT,美國Roche公司)進(jìn)行EnVision兩步法染色。第一抗體CD20、CD5、CD10和Ki-67購自瑞士Roche公司,第一抗體kappa、lambda和CD23購自丹麥Dako公司,IgG4購自廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司。具體操作步驟參照試劑盒說明書和全自動免疫組織化學(xué)分析儀的標(biāo)準(zhǔn)操作流程。染色結(jié)果半定量判讀為以下4種類型:① 彌漫強(qiáng)陽性(記作“+”),90%以上的腫瘤細(xì)胞呈彌漫強(qiáng)陽性著色;② 陽性(記作“+/-”),瘤細(xì)胞有強(qiáng)弱不等的抗原表達(dá),且陽性細(xì)胞占所有瘤細(xì)胞比例為25%~90%;③ 弱陽性(記作“-/+”),10%~25%的瘤細(xì)胞強(qiáng)陽性或異質(zhì)性陽性著色;④ 陰性(記作“-”),無陽性瘤細(xì)胞或陽性瘤細(xì)胞比例少于10%。

        1.3 MYD88 L265P基因突變檢測

        經(jīng)常規(guī)4%甲醛溶液固定、石蠟包埋的腫瘤組織樣本制備成4~6 μm厚度切片,經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度濃度乙醇去除二甲苯和流水沖洗水化后進(jìn)行核酸提取,步驟按照DNA提取試劑盒(QIAamp DNA迷你試劑盒,德國Qiagen公司)說明書進(jìn)行。提純后的核酸模板加入聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)混合液,PCR法擴(kuò)增MYD88基因。根據(jù)MYD88基因組序列設(shè)計PCR引物,上游引物為5’-GGGG-ATGGCTGTTGTTAA-3’,下游引物為5’-GCAGGGGTTGGT-GTAGTC-3’。反應(yīng)體系50 μL,反應(yīng)條件:96 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,共40個循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定和PCR純化試劑盒(QIA quick PCR purification kit,購自美國Qiagen公司)純化后,在ABI3730XL測序儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)上行測序驗證。具體操作參考儀器及儀器配套試劑盒的說明書。

        2 結(jié) 果

        2.1 臨床資料

        10例LPL/WM病例的臨床特點總結(jié)見表1。所有患者均為男性,發(fā)病年齡58~77歲,中位61歲。臨床表現(xiàn)多為乏力(9例)、貧血(8例)、出血(包括鼻衄、牙齦出血、皮膚紫癜和瘀斑等,5例),1例有B癥狀(發(fā)熱、盜汗、體重減輕)。8例表現(xiàn)為淋巴結(jié)腫大,2例伴有脾腫大。所有患者行血清蛋白電泳檢查及骨髓活檢,均發(fā)現(xiàn)有不同程度的IgM型血清免疫球蛋白水平升高(IgM范圍為6.8~37.4 g/L)和骨髓受累表現(xiàn) 。4例患者接受R-CHOP(利妥昔單抗+環(huán)磷酰胺+多柔比星+長春新堿+潑尼松)方案治療,2例接受苯丁酸氮芥(留可然)治療,1例接受BRD(硼替佐米+利妥昔單抗+地塞米松)方案治療,1例接受BR(硼替佐米+利妥昔單抗)方案治療。隨訪6~36個月(中位18個月),至隨訪終點,2例無病生存,5例帶病生存,3例死亡。

        表 1 10例LPL/WM病例的臨床信息Tab. 1 Clinical features of 10 LPL/WM cases

        2.2 組織病理學(xué)表現(xiàn)

        10例患者均行病變淋巴結(jié)及骨髓活檢,鏡檢結(jié)果顯示淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)部分破壞,但多數(shù)病例濾泡和淋巴竇結(jié)構(gòu)仍可辨認(rèn),腫瘤細(xì)胞浸潤至淋巴結(jié)外脂肪組織(圖1A),邊緣竇和部分髓竇開放(圖1B)。腫瘤細(xì)胞主要由腫瘤性小淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和漿樣淋巴細(xì)胞構(gòu)成(圖1C)。腫瘤性小淋巴細(xì)胞體積較正常成熟淋巴細(xì)胞稍大,細(xì)胞質(zhì)較少,細(xì)胞核圓形或輕度不規(guī)則,染色質(zhì)粗,核仁不明顯;腫瘤性漿細(xì)胞有異型性,體積較正常漿細(xì)胞大,細(xì)胞核增大,染色質(zhì)凝集,車輻狀結(jié)構(gòu)不明顯。漿樣淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核與小淋巴細(xì)胞相似,但呈偏心性分布,細(xì)胞質(zhì)相對豐富(圖1D)。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果總結(jié)見表2。所有病例腫瘤細(xì)胞CD20呈彌漫強(qiáng)陽性(圖2A),6例程度不等地表達(dá)CD23(圖2B),2例少數(shù)細(xì)胞表達(dá)CD5(圖2C),所有檢測病例均呈CD10陰性,所有病例腫瘤細(xì)胞限制性表達(dá)κ輕鏈(圖2D,2E)。腫瘤細(xì)胞Ki-67增殖指數(shù)在5%~30%之間。IgG4染色顯示有4例病灶中反應(yīng)性漿細(xì)胞成分低水平表達(dá)這一抗原(圖2F)。骨髓活檢示7例有骨髓受累表現(xiàn),多呈結(jié)節(jié)狀或彌漫性小淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及漿樣淋巴細(xì)胞混合性 浸潤。

        圖 1 LPL/WM組織學(xué)形態(tài)Fig. 1 Histological features of LPL/WM

        表 2 10例LPL/WM病例的免疫表型特征Tab. 2 Immunohistochemical features of 10 LPL/WM cases

        圖 2 LPL/WM免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig. 2 Immunohistochemical features of LPL/WM

        2.3 MYD88 L265P突變分析

        10例LPL/WM病例均可檢出MYD88 L265P突變(圖3),而對照組邊緣區(qū)淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤與小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤/慢性淋巴細(xì)胞性白血病均未檢出。

        圖 3 LPL/WM顯示有MYD88 L265P突變Fig. 3 MYD88 L265P mutation in LPL/WM

        3 討 論

        LPL/WM是一類較為罕見的非霍奇金淋巴瘤,根據(jù)國內(nèi)一項多中心大樣本研究,LPL/WM只占所有淋巴瘤的0.57%[6]。LPL累犯淋巴結(jié)通常缺乏特征性形態(tài)改變,盡管傳統(tǒng)上認(rèn)為淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)部分保留是這類腫瘤的形態(tài)學(xué)特點之一,但近來研究發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)完全毀損者也并不少見,瘤細(xì)胞形態(tài)方面,LPL/WM主要由腫瘤性小淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和漿樣淋巴細(xì)胞構(gòu)成,這和其他伴有明顯漿細(xì)胞樣分化的小B細(xì)胞類腫瘤(例如MALT型或淋巴結(jié)邊緣區(qū)淋巴瘤、SLL/CLL)非常相似而不易區(qū)分[1]。另一方面,LPL/WM又不像濾泡性淋巴瘤、SLL/CLL等其他小B細(xì)胞腫瘤那樣具有特征性的免疫表型以助確診與鑒別,不僅如此,部分LPL/WM病例還會像本研究病例那樣呈現(xiàn)CD23陽性、CD5陽性乃至CD10陽性的異常表型,從而導(dǎo)致誤診。Remstein等[7]報道了26例LPL,發(fā)現(xiàn)僅58%的病例呈典型表型,其余均程度不等地表達(dá)CD5、CD10和CD23。此外,相當(dāng)多的LPL/WM患者起病階段或整個病程中均無WM表現(xiàn),對于這一病種的確診也增加了困難。有趣的是,我們還發(fā)現(xiàn)在部分LPL/WM病灶中有散在分布的IgG4陽性漿細(xì)胞存在,但此類細(xì)胞形態(tài)成熟,且無免疫球蛋白輕鏈限制性,提示為反應(yīng)性成分。

        分子生物學(xué)研究新進(jìn)展為此類腫瘤的確診和鑒別提供了新的依據(jù),Treon等[4]發(fā)現(xiàn)90%的LPL/WM病例染色體3p22.2的38182641位點有MYD88蛋白編碼區(qū)第265位氨基酸(MYD88 L265P)錯義突變,為亮氨酸錯變?yōu)楦彼?。同時,MYD88 L265P突變在IgM型意義不明的單克隆免疫球蛋白血癥中也較為常見[8]。此外,活化細(xì)胞樣型彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)、腿型原發(fā)性皮膚DLBCL以及原發(fā)于乳腺、睪丸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的DLBCL亦有高頻MYD88 L265P突變檢 出[9-13]。而在SLL/CLL、邊緣區(qū)淋巴瘤等其他類型的小B細(xì)胞性腫瘤中,MYD88 L265P突變極少被檢出[3]。本研究結(jié)果顯示,10例LPL/WM均有MYD88 L265P突變,而13例對照組小B細(xì)胞腫瘤病例均呈陰性結(jié)果,這一結(jié)果同國外研究結(jié)果相符。MYD88 L265P突變對于LPL/WM與其他伴有漿細(xì)胞樣分化的小B細(xì)胞性腫瘤的鑒別以及臨床表現(xiàn)、組織學(xué)形態(tài)或免疫表型不典型的LPL/WM的確診尤有價值。Hamadeh等[3]分析了87例髓外LPL、脾邊緣區(qū)淋巴瘤、未定義的脾淋巴瘤、伴有漿細(xì)胞分化的淋巴結(jié)邊緣區(qū)淋巴瘤或小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤的MYD88 L265P突變狀態(tài),發(fā)現(xiàn)幾乎所有的MYD88突變者皆為LPL(包括病理學(xué)特征不典型的病例)。

        近來有研究表明,MYD88 L265P突變還與LPL/WM的臨床表現(xiàn)和患者預(yù)后相關(guān),Treon 等[14]發(fā)現(xiàn)有MYD88突變往往預(yù)示較好預(yù)后,而CXCR4突變則與臨床高侵襲性相關(guān)。此外,MYD88 L265P突變可能在LPL/WM的腫瘤發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮重要作用。Yang等[15]發(fā)現(xiàn),MYD88突變可以通過激活布魯頓酪氨酸激酶(新興小分子藥物依魯替尼的靶點)和IRAK分子,進(jìn)而激活NF-κB信號通路,從而促進(jìn)LPL/WM腫瘤細(xì)胞的生長。而共同抑制布魯頓酪氨酸激酶和IRAK后,則導(dǎo)致NF-κB信號通路失活、腫瘤細(xì)胞死亡。

        我們的研究顯示,多數(shù)LPL/WM病例仍具有相對典型的臨床表現(xiàn)、組織學(xué)形態(tài)以及免疫表型,但少數(shù)病例亦可有CD23+或CD5+等異常免疫表型。MYD88 L265P突變作為此類腫瘤的特征性分子遺傳學(xué)改變,對于疾病的確診與鑒別、預(yù)測預(yù)后乃至指導(dǎo)個體化治療可能具有重要 意義。

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