曹達(dá)龍，朱文愷，黃永墻，盛昊悅，施國海，張海梁，葉定偉

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

腎癌是常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一。最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2018年全球?qū)⒂?403 262例新發(fā)病例和175 098例死亡病例［1］。與腎癌相關(guān)的危險因素包括肥胖、吸煙及高血壓等，尤其吸煙目前被認(rèn)為是腎癌主要的致病因子之一［2］。F2R樣凝血酶/胰蛋白酶受體3（F2R like thrombin or trypsin receptor 3，F(xiàn)2RL3）在既往的研究中被發(fā)現(xiàn)與吸煙狀態(tài)密切相關(guān)［3］，同時還與一些癌癥的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)［4］。我們的研究同樣發(fā)現(xiàn)F2RL3的表達(dá)狀態(tài)與腎癌的預(yù)后密切相關(guān)，即高表達(dá)F2RL3的患者預(yù)后較差［5］。眾所周知，腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移潛能是腫瘤難以被根治的重要原因。腫瘤細(xì)胞的基本生命活動需要細(xì)胞代謝進(jìn)行供能，腫瘤代謝被認(rèn)為在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著至關(guān)重要的供能作用［6］。已有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移時細(xì)胞的代謝模式會從線粒體的氧化磷酸化轉(zhuǎn)化成糖酵解效應(yīng)，即瓦伯格效應(yīng)（Warburg effect）［7］。瓦伯格效應(yīng)是一種異常的代謝模式，即在氧供充足的條件下腫瘤細(xì)胞仍主要依賴糖酵解生成生命活動所需的物質(zhì)和能量。2011年，Weinberg在總結(jié)腫瘤生物學(xué)特征的經(jīng)典論著Hallmarks of Cancer：the Next Generation中，將腫瘤細(xì)胞的糖酵解代謝模式歸納為腫瘤的十大特征之一，與腫瘤的多種惡性生物學(xué)行為相關(guān)［8-9］。因此，深入了解腫瘤代謝、侵襲轉(zhuǎn)移及它們之間的關(guān)系，有利于為探索腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及干預(yù)腫瘤的惡性生物學(xué)行為提供重要線索。本研究將在腎癌A498細(xì)胞中探討F2RL3對細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和葡萄糖代謝的影響，了解腫瘤代謝與腫瘤惡性生物學(xué)行為之間的關(guān)系，為通過干預(yù)腫瘤代謝進(jìn)而阻止腫瘤惡性生物學(xué)行為提供重要依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)

人腎癌A498細(xì)胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）；A498細(xì)胞系在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所Dojindo，F(xiàn)2RL3抗體（ab137927）、c-myc抗體（ab32072）和缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）抗體（ab51608）購自英國Abcam公司，β-actin內(nèi)參抗體購自美國Proteintech公司，葡萄糖吸收和乳酸生成分析試劑盒購自美國Biovision公司。

1.3 載體構(gòu)建及慢病毒轉(zhuǎn)染

敲減F2RL3基因的慢病毒載體采用pLKO.1 TRC cloning vector，購自美國Addgene公司，針對F2RL3基因的靶序列為TCACTAGCGGAGGTCACTTTG。慢病毒的生產(chǎn)采用HEK-293T細(xì)胞，按照4∶3∶1的比例將慢病毒載體、包裝質(zhì)粒sPAX2和pMD2.G轉(zhuǎn)染至 HEK-293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后收集慢病毒顆粒，于-80 ℃凍存，用于感染目的A498細(xì)胞。將待感染A498細(xì)胞鋪在6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后每孔加入2 mL所收集的慢病毒顆粒，24 h后更換成完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿后傳入 25 cm2的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞豐度達(dá)到80%時加入嘌呤霉素篩選出F2RL3低表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

1.4 細(xì)胞增殖實驗

實驗分成兩組，一組為對照組，另一組為F2RL3基因敲低的實驗組。將待檢測的10 000個/孔（100 μL）實驗組或者對照組細(xì)胞分別鋪于96孔板中，以30%初始豐度為宜，每組設(shè)置6個平行孔，重復(fù)3次。細(xì)胞貼壁后，分別在24、48、72、96和120 h的同一個時間點，按照100 μL培養(yǎng)基加入10 μL CCK-8檢測試劑，2 h后測吸光度（D）。將所得D值進(jìn)行比較和作圖。

1.5 克隆形成實驗

將每孔400個的處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞分別鋪在6孔板內(nèi)，輕輕搖勻使細(xì)胞分散均勻，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周左右，期間每3天左右觀察細(xì)胞生長情況并換液。每組設(shè)置3個平行孔，重復(fù)3次。待克隆數(shù)達(dá)到30個左右時，棄去上清液，用PBS小心浸洗2遍。棄PBS，每孔加入4%多聚甲醛1 mL固定30 min，再用結(jié)晶紫（0.5%）在室溫下固定0.5 h，再用PBS洗3遍，空氣中干燥后拍照，計算細(xì)胞的克隆形成數(shù)并進(jìn)行比較。

1.6 侵襲、遷移實驗

細(xì)胞的侵襲、遷移能力可通過transwell小室法進(jìn)行評價。侵襲能力檢測：首先使用60 μL的Matrigel基質(zhì)膠（加拿大BD Biosciences公司）用無血清培養(yǎng)基按1∶5比例稀釋，加入到小室上層，放置8 h后使用。實驗分成兩組，一組為對照組，另一組為F2RL3基因敲低的實驗組，每組設(shè)置3個平行孔，重復(fù)3次。在每個小室的上層中分別加入在200 μL無血清培養(yǎng)基中稀釋的實驗組或者對照組A498細(xì)胞20 000個。將小室放入含有750 μL完全培養(yǎng)基的24孔板中。在37 ℃培養(yǎng)箱中，將A498細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，將小室轉(zhuǎn)入新的加入4%多聚甲醛的24孔板中。固定30 min后，再用結(jié)晶紫（0.5%）在室溫下固定0.5 h。細(xì)胞用PBS洗3遍后，擦去上層細(xì)胞，在顯微鏡下拍照。每個孔拍攝5張照片，計數(shù)每張相片細(xì)胞數(shù)，計算平均數(shù)進(jìn)行比較。遷移能力檢測：同樣分成兩組，每組設(shè)置3個平行孔，重復(fù)3次，然后直接在每個小室的上層中分別加入在200 μL無血清培養(yǎng)基中稀釋的20 000個實驗組或?qū)φ战MA498細(xì)胞。將小室放入含有750 μL完全培養(yǎng)基的24孔板中。與檢測侵襲能力相似，在37 ℃培養(yǎng)箱中將A498細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，將小室轉(zhuǎn)入新的加入4%多聚甲醛的24孔板中。固定30 min后，再用結(jié)晶紫（0.5%）在室溫下固定0.5 h。細(xì)胞用PBS洗3遍后，擦去上層細(xì)胞，在顯微鏡下拍照。每個孔拍攝5張照片，計數(shù)每張相片細(xì)胞數(shù)，計算平均數(shù)進(jìn)行比較。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）和代謝葡萄糖能力的檢測

HIF-1α和c-myc是腫瘤細(xì)胞代謝的關(guān)鍵性調(diào)控分子，通過調(diào)控代謝途徑中的關(guān)鍵酶而影響腫瘤細(xì)胞代謝模式的轉(zhuǎn)化。F2RL3、HIF-1α和c-myc的蛋白水平按照Western blot的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行檢測。根據(jù)葡萄糖吸收和乳酸生成分析試劑盒（美國Biovision公司）的說明書，通過檢測不同組細(xì)胞的葡萄糖吸收和乳酸生成水平來計算各組細(xì)胞代謝葡萄糖的能力。實驗組和對照組分別設(shè)置3個平行組，共重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用IBM SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)意義。組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 敲減F2RL3基因可以抑制A498細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力

通過慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方式，干擾細(xì)胞內(nèi)F2RL3的表達(dá)，進(jìn)而觀察F2RL3對細(xì)胞增殖和克隆形成的影響。使用CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)F2RL3低表達(dá)組與對照組比較，細(xì)胞生長在第3～5天時受到明顯抑制，表明敲減F2RL3具有抑制細(xì)胞增殖的作用（P＜0.05，圖1A）。另外，通過克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)F2RL3低表達(dá)細(xì)胞的克隆形成率顯著低于陰性對照組細(xì)胞（P=0.001 3，圖1B）。這一結(jié)果與上述細(xì)胞增殖實驗結(jié)果一致，均表明敲減F2RL3基因能夠抑制A498細(xì)胞的增殖能力。

惡性腫瘤的特征之一是無限增殖，其獲得侵襲轉(zhuǎn)移潛能是無法根治的主要原因。隨后，借助于transwell小室檢測了細(xì)胞的侵襲和遷移能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)F2RL3低表達(dá)的細(xì)胞的侵襲能力顯著低于對照組（P=0.009 3，圖1C）。F2RL3低表達(dá)的細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力亦顯著降低（P=0.004 0，圖1D）。這些結(jié)果表明，F(xiàn)2RL3與腎癌A498細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切 相關(guān)。

圖 1 敲減F2RL3基因后抑制A498細(xì)胞的增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力Fig. 1 Decreased F2RL3 gene inhibited proliferation, clone formation, invasion and migration of A498 cells

2.2 F2RL3表達(dá)下調(diào)能抑制A498細(xì)胞的糖酵解效應(yīng)

為了驗證F2RL3是否與糖代謝模式轉(zhuǎn)化相關(guān)，首先在蛋白水平上檢測了影響代謝的關(guān)鍵分子c-myc和HIF-1α的變化。結(jié)果顯示，F(xiàn)2RL3表達(dá)下調(diào)伴隨著c-myc和HIF-1α分子的明顯下調(diào)（圖2A），提示F2RL3下調(diào)引起A498細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力減弱的同時伴有糖代謝模式的轉(zhuǎn)化。隨后，通過檢測A498細(xì)胞吸收葡萄糖和分泌乳酸的水平發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2RL3下調(diào)明顯抑制了A498細(xì)胞吸收葡萄糖和生成乳酸的能力（P=0.013和P=0.006，圖2B）。這些結(jié)果顯示，F(xiàn)2RL3下調(diào)不僅可抑制A498細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力，而且抑制腫瘤細(xì)胞以糖酵解方式代謝葡萄糖的能力。

圖 2 Western blot檢測敲減F2RL3基因抑制A498細(xì)胞代謝葡萄糖的能力Fig. 2 Knocking down F2RL3 gene inhibited glucose utilization in A498 cells detected by Western blot

3 討 論

在既往的研究中F2RL3被發(fā)現(xiàn)不僅與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［10-11］，而且與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)［12］。F2RL3同時也是一種凝血酶受體并調(diào)控著血液的凝固過程。癌癥患者的特征之一是血液呈現(xiàn)高凝狀態(tài)，這也從另一個角度揭示F2RL3與癌癥之間存在密切的聯(lián)系［13］。我們的研究同樣發(fā)現(xiàn)F2RL3還與腎癌的預(yù)后密切相關(guān)［5］。因此，進(jìn)一步研究F2RL3在腎癌發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機(jī)理有助于為干預(yù)腎癌的惡性生物學(xué)行為提供重要線索。

腫瘤細(xì)胞維持惡性增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力需要細(xì)胞代謝不斷地提供能量和物質(zhì)。對于惡性腫瘤細(xì)胞而言，代謝模式轉(zhuǎn)化至有氧糖酵解模式不僅可以為其惡性生物學(xué)行為提供ATP，而且可以為其合成生物大分子提供原料［14］。同時，糖酵解會伴隨著乳酸生成的增加，造成腫瘤微環(huán)境呈酸性狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞基質(zhì)的不穩(wěn)定性和降解，有利于腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移［15］。因此，腫瘤細(xì)胞代謝與其惡性增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力之間存在著一定的聯(lián)系。綜上所述，研究F2RL3與腫瘤代謝模式轉(zhuǎn)化、惡性增殖、侵襲轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系有助于尋找新的干預(yù)腎癌惡性生物學(xué)行為的 手段。

在F2RL3的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究中，Baglietto 等［11］發(fā)現(xiàn)F2RL3基因甲基化狀態(tài)可以預(yù)測肺癌的風(fēng)險。同樣，亦有研究發(fā)現(xiàn)F2RL3可以作為治療心血管疾病的靶點［16］。在乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)時，伴隨著其代謝模式發(fā)生明顯的變化，果糖-1,6-二磷酸酶1（fructose-1,6-bisphosphatase 1，F(xiàn)BP1）的下調(diào)能進(jìn)一步促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞獲得代謝優(yōu)勢并增強(qiáng)其惡性潛能［7］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)人腎癌A498細(xì)胞系中F2RL3下調(diào)后可以明顯抑制其增殖、侵襲及遷移能力。HIF-1α和c-myc是腫瘤細(xì)胞代謝的關(guān)鍵性調(diào)控分子，通過調(diào)控代謝途徑中的關(guān)鍵酶而影響腫瘤細(xì)胞代謝模式的轉(zhuǎn)化。在本研究中我們同樣發(fā)現(xiàn)，敲減F2RL3基因后可以引起腎癌A498細(xì)胞中HIF-1α和c-myc的下調(diào)，同時可以明顯抑制該細(xì)胞吸收葡萄糖和生成乳酸的能力。

本文研究結(jié)果顯示腎癌A498細(xì)胞中F2RL3不僅與腫瘤的惡性增殖、侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，而且與腫瘤代謝模式轉(zhuǎn)化有關(guān)，同時間接揭示了腫瘤細(xì)胞代謝與其侵襲轉(zhuǎn)移能力之間存在著一定的聯(lián)系。這些結(jié)果為后續(xù)研究腎癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移與糖代謝之間的關(guān)系提供了重要的理論依據(jù)，同時為尋找干預(yù)腎癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的手段提供了重要線索。