曹晶珠，鄭 浩，陶元平，姚乃心，黃智平，汪珍光，黃 勤

1. 海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200433；

2. 海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院肝外三科，上海 200433；

3. 海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 200433；

4. 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州510010

部分肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者手術(shù)后的預(yù)后很差，導(dǎo)致這一結(jié)果的重要原因之一是肝癌轉(zhuǎn)移。因此，尋找和揭示調(diào)控肝癌轉(zhuǎn)移的重要基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對于改善肝癌患者術(shù)后預(yù)后意義十分重大［1］。

MicroRNA（miRNA）是一類非編碼RNA（長度為20～24 nt），通過影響靶基因mRNA的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和翻譯來發(fā)揮重要作用。許多miRNA可以直接作用于腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的靶點(diǎn)，從而影響腫瘤遷移和侵襲能力［2］。越來越多的證據(jù)表明，miR-509-3p在多種腫瘤中異常表達(dá)，并且參與腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡［3-5］。目前尚不清楚miR-509-3p具體對肝癌細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)和分子生物學(xué)機(jī)制。本研究采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測46例肝癌患者組織樣本和肝癌細(xì)胞系中miR-509-3p的表達(dá)。體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測miR-509-3p對肝癌細(xì)胞遷移的影響。蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測miR-509-3p與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)分子基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2和MMP-9蛋白表達(dá)之間的關(guān)系。我們的研究旨在闡明 miR-509-3p在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用和機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

46例HCC組織和配對的相鄰癌旁組織來自于2013年6月—2014年10月在海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院進(jìn)行根治性手術(shù)的肝細(xì)胞癌患者。癌旁組織距離癌灶邊緣超過5 cm。標(biāo)本和相應(yīng)的鄰近組織來自同一肝癌患者。由海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院擁有5年以上工作經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師檢查每例組織樣本，確認(rèn)組織類型。術(shù)后腫瘤組織立即凍存于-80 ℃液氮中以備后用?；颊咴谑中g(shù)前沒有接受任何治療。本研究經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)且所有患者均簽署知情同意書。

永生化人正常肝細(xì)胞系LO2、人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞株HCCLM3及MHCC97H購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、PBS均購自美國HyClone公司，miScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒、MicroRNA RTFQ-PCR檢測試劑盒均購自德國QIAGEN公司，TRIzol試劑盒、Lipofectamine? 2000購自美國Invitrogen公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司，RIPA裂解液、BCA蛋白檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，MMP-9、MMP-2、GAPDH均購自美國Santa Cruz公司，miR-509-3p抑制劑（inhibitor）購自廣州市銳博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RTFQ-PCR檢測

組織和細(xì)胞的總RNA的提取過程參照文 獻(xiàn)報道［6］，參照miScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，進(jìn)行下一步反應(yīng)。按照Real-Time Thermocycler 7500儀器說明書，每一樣本和基因同時做3個復(fù)孔，輸出數(shù)據(jù)為復(fù)孔Ct值的平均值，統(tǒng)計(jì)分析時采用2－ΔΔCt計(jì)算miR-509-3p的相對表達(dá)量。

miR-509-3p-上游引物序列為 5’-TCTTGCTGTTCCTGCTCCTG-3’，下游為 5’-AACACAGGCGCCTCTTCTAC-3’；U6-上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游為5’-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照文獻(xiàn)報道的方法［6］進(jìn)行。將MHCC97H和HCCLM3細(xì)胞在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞密度接近70%時，將miR-509-3p抑制劑應(yīng)用LipofectamineTM2000相應(yīng)的對照物進(jìn)行轉(zhuǎn)染。后續(xù)根據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行所有的實(shí)驗(yàn)操作。根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同將細(xì)胞分為：

Ⅰ：空白對照組（MHCC97H-NC）、miR-509-3p抑制劑組（MHCC97H抑制劑）；Ⅱ：空白對照組（HCCLM3-NC）、miR-509-3p抑制劑組（HCCLM3抑制劑）。通過RTFQ-PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-509-3p表達(dá)水平，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)按照文獻(xiàn)［6］報道的方法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)選擇穩(wěn)定低表達(dá)miR-509-3p的MHCC97H、HCCLM3兩種肝癌細(xì)胞系：MHCC97H抑制劑 vs MHCC97H-NC（陰性對照）；HCCLM3抑制劑 vs HCCLM3-NC（陰性對照）進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。將1.5×105個細(xì)胞重懸于不含F(xiàn)BS的300 μL DMEM培養(yǎng)基中且加入上室。將含10%FBS的500 μL DMEM培養(yǎng)基加入下室。在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、濕潤的條件下溫育48 h后細(xì)胞進(jìn)行固定和染色，選擇5個隨機(jī)視野進(jìn)行鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

裂解細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA測定蛋白濃度試劑盒對蛋白進(jìn)行定量后，進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳，以MMP-9、MMP-2和GAPDH為一抗（1∶500稀釋），二抗為相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG，電泳分離、轉(zhuǎn)膜、顯影及照相參見文獻(xiàn)［6］方法操作。圖片結(jié)果應(yīng)用WO-9413B型凝膠成像系統(tǒng)自帶軟件Gelpro32分析目的條帶平均灰度及背景灰度，前者減去后者作為統(tǒng)計(jì)分析數(shù)值。最后統(tǒng)計(jì)取值為其灰度值與相應(yīng)內(nèi)參灰度值比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。各組間比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-509-3p在HCC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況

收集46例HCC組織和對應(yīng)的癌旁組織，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA，并進(jìn)行RTFQ-PCR反應(yīng)，得到Ct值，采用2－ΔΔCt表征兩組之間miR-509-3p表達(dá)的倍數(shù)關(guān)系。其中U6為內(nèi)參基因，miR-509-3p在癌組織中的表達(dá)水平是癌旁組織的1.50倍（P＜0.001）。本研究提取MHCC97H、HCCLM3、SMMC-7721和LO2細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA，并進(jìn)行RTFQ-PCR反應(yīng)，得到Ct值，采用2－ΔΔCt表征各組之間miR-509-3p表達(dá)的倍數(shù)關(guān)系，其中U6為內(nèi)參基因，LO2為對照組。結(jié)果顯示，miR-509-3p在MHCC97H中的表達(dá)水平是LO2組的7.19倍（P＜0.001），在HCCLM3中是LO2組的6.88倍（P＜0.001），在SMMC-7721中是LO2組的3.86倍（P＜0.001）。上述結(jié)果表明，miR-509-3p在MHCC97H、HCCLM3、SMMC-7721及LO2中的表達(dá)水平逐漸下降。結(jié)果證實(shí)miR-509-3p在肝癌中可能發(fā)揮促癌基因的作用，并且其異常高表達(dá)可能與肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)（圖1）。

2.2 RTFQ-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染抑制劑后miR-509-3p在MHCC97H和HCCLM3細(xì)胞中的表達(dá)情況

將構(gòu)建好的miR-509-3p抑制劑轉(zhuǎn)染至MHCC97H和HCCLM3兩株HCC細(xì)胞中，48 h后收集細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA，并進(jìn)行RTFQ-PCR反應(yīng)，得到Ct值，采用2－ΔΔCt表征各組之間miR-509-3p表達(dá)的倍數(shù)關(guān)系，其中U6為內(nèi)參基因，MHCC97H-NC組和HCCLM3-NC為對照組。結(jié)果顯示，miR-509-3p在MHCC97H-NC組中的表達(dá)水平是MHCC97H抑制劑組的3.18倍（P＜0.05）；HCCLM3-NC是HCCLM3抑制劑組的3.16倍（P＜0.05）；NC組中miR-509-3p的表達(dá)水平高于抑制劑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明miR-509-3p抑制劑轉(zhuǎn)染成功 （圖2）。

2.3 降低miR-509-3p表達(dá)抑制MHCC97H和HCCLM3細(xì)胞遷移的侵襲能力

通過transwell實(shí)驗(yàn)（不含有基質(zhì)膠）檢測miR-509-3p對HCC細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示，MHCC97H-NC組與MHCC97H抑制劑組穿過小室細(xì)胞數(shù)量比值為2.848，HCCLM3NC組與HCCLM3抑制劑組穿過小室細(xì)胞數(shù)量比值為2.870；與MHCC97H和HCCLM3的NC組相比，在MHCC97H和HCCLM3的抑制劑組穿過小室細(xì)胞數(shù)量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制miR-509-3p的表達(dá)可以降低肝癌細(xì)胞的遷移能力（圖3、4）。

圖 1 RTFQ-PCR檢測miR-509-3p的表達(dá)情況 Fig. 1 Expression of miR-509-3p detected by RTFQ-PCR

圖 2 RTFQ-PCR檢測轉(zhuǎn)染miR-509-3p抑制劑后各細(xì)胞株中miR-509-3p的表達(dá)水平Fig. 2 Expression of miR-509-3p in highly metastatic HCC cell lines after transfection of miR-509-3p inhibitor detected by RTFQPCR

圖 4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-509-3p抑制劑后transwell遷移實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)Fig. 4 Cell count of transwell migration assay after transfection of miR-509-3p inhibitor

Transwell實(shí)驗(yàn)（含有基質(zhì)膠）結(jié)果顯示，MHCC97H-NC組與MHCC97H抑制劑組穿過小室細(xì)胞數(shù)量比值為2.375，HCCLM3-NC組與HCCLM3抑制劑組穿過小室細(xì)胞數(shù)量比值為2.529。與MHCC97H和HCCLM3的NC組相比，在MHCC97H和HCCLM3的抑制劑組穿過小室細(xì)胞數(shù)量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。上述實(shí)驗(yàn)提示，抑制miR-509-3p的表達(dá)可以降低肝癌細(xì)胞的侵襲能力（圖5、6）。

2.4 降低miR-509-3p表達(dá)對MHCC97H和HCCLM3細(xì)胞中MMP-9、MMP-2的蛋白表達(dá)的影響

將構(gòu)建好的miR-509-3p抑制劑轉(zhuǎn)染至MHCC97H和HCCLM3兩株HCC細(xì)胞中，48 h后收集細(xì)胞，提取蛋白進(jìn)行Western blot檢測。本研究以GAPDH為內(nèi)參基因，MHCC97H-NC和HCCLM3-NC組為對照組。Western blot檢測結(jié)果顯示，MHCC97H-NC組、MHCC97H抑制劑組、HCCLM3-NC和HCCLM3抑制劑組MMP-2/GAPDH的灰度值比值分別為1.832 7、0.352 7、1.921 3和0.340 3，MHCC97H-NC組、MHCC97H抑制劑組、HCCLM3-NC和HCCLM3抑制劑組MMP-9/GAPDH的灰度值比值分別為1.930 0、0.309 7、1.639 3和0.340 0。結(jié)果顯示，與MHCC97H和HCCLM3的NC組相比，在MHCC97H和HCCLM3的抑制劑組中MMP-9和MMP-2的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。上述結(jié)果提示，miR-509-3p可能通過正向調(diào)控MMP-9和MMP-2蛋白的表達(dá)來發(fā)揮促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用（圖7）。

圖 5 MHCC97H和HCCLM3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-509-3p抑制劑后的transwell侵襲實(shí)驗(yàn) (×200)Fig. 5 Transwell invasion assay of MHCC97H and HCCLM 3 after transfection of miR-509-3p inhibitor (×200)

圖 6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-509-3p抑制劑后transwell侵襲實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)Fig. 6 Cell count of transwell migration assay after transfection of miR-509-3p inhibitor

圖 7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-509-3p抑制劑后的Western blot實(shí)驗(yàn)Fig. 7 Expressions of MMP-2 and MMP-9 after transfection of miR-509-3p inhibitor detected by Western blot

3 討 論

文獻(xiàn)報道，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用［2,7］，miRNA的異常表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞的異常增殖、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［8］。因此，深入研究miRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制有助于研究者深入了解腫瘤的進(jìn)展過程以及建立預(yù)測和評估患者預(yù)后的風(fēng)險模型。以往的文獻(xiàn)報道證實(shí)miR-509-3p與腫瘤的發(fā)生密切相 關(guān)［4，9］，然而對于miR-509-3p在肝癌中的研究鮮見報道。本研究首先檢測了miR-509-3p在肝癌患者術(shù)后組織樣本和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，miR-509-3p在HCC組織和高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞系中異常升高。通過構(gòu)建MHCC97H抑制劑和HCCLM3抑制劑細(xì)胞系，探索miR-509-3p在HCC細(xì)胞中的生物學(xué)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制miR-509-3p表達(dá)可降低肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。我們的研究結(jié)果提示miR-509-3p與肝癌轉(zhuǎn)移 相關(guān)。

研究證實(shí)，EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移早期發(fā)揮著重要的作用［10-11］。EMT有一些比較明顯的特征：E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、α-連環(huán)蛋白（α-catenin）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）等表達(dá)降低；N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和EMT相關(guān)的MMP表達(dá)升高，如MMP-2、MMP-3和MMP-9 等［12］。以往的研究和相關(guān)報道證明，miRNA確實(shí)能夠通過影響EMT過程中的靶蛋白來對腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲產(chǎn)生影響［13-15］。本研究的臨床數(shù)據(jù)和生物功能學(xué)實(shí)驗(yàn)提示，miR-509-3p與肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲密切相關(guān)，結(jié)合EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮的重要作用，我們推測miR-509-3p有可能通過EMT途徑促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究通過Western blot檢測證實(shí)在高轉(zhuǎn)移性HCC細(xì)胞系中抑制miR-509-3p表達(dá)后，MMP-2和MMP-9的表達(dá)也顯著降低，表明miR-509-3p通過某些重要信號通路促進(jìn)HCC細(xì)胞的EMT過程。

綜上所述，本研究證實(shí)miR-509-3p在HCC組織中高表達(dá)，同時高轉(zhuǎn)移性的HCC細(xì)胞系中亦上調(diào)。功能學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)降低miR-509-3p可抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，EMT相關(guān)分子MMP-2、MMP-9的表達(dá)亦顯著降低。基于以上研究結(jié)果，我們推測miR-509-3p可通過調(diào)控MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)來促進(jìn)HCC細(xì)胞EMT的過程，從而增強(qiáng)HCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力。miR-509-3p的具體靶基因還有待進(jìn)一步研究。