王 凱 王印庚 姜 勇 張 正① 于永翔 廖梅杰

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院上海 201306；4.青島國(guó)家海洋科學(xué)研究中心 青島 266071)

許氏平鲉(Sebastes schlegeli)屬鲉形目(Scorpaeniformes)、鲉科(Scorpaenidae)、平鲉屬(Sebastes)，又稱“黑鲪”、“黑石鱸”、“黑頭”，在我國(guó)主要分布于黃渤海區(qū)域。因其肉質(zhì)鮮美，生長(zhǎng)速度快，耐低溫，可在我國(guó)北方海域自然越冬，成為北方海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的主要魚類品種之一(常青等, 2009；顧中華等, 2015)。山東省長(zhǎng)島縣大欽島周邊是我國(guó)北方大型深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的最大集中地，養(yǎng)殖的主要品種就是許氏平鲉。經(jīng)過(guò)20年余的發(fā)展，隨著該海區(qū)深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，疾病的發(fā)生也越來(lái)越頻繁，成為影響?zhàn)B殖成活率的關(guān)鍵因素。特別是近幾年來(lái)，該海區(qū)養(yǎng)殖的許氏平鲉疾病呈現(xiàn)了傳染速度快、死亡率高等突出特點(diǎn)，已經(jīng)嚴(yán)重影響了正常的養(yǎng)殖生產(chǎn)。

2016年 7～9月，大欽島周邊海域深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的許氏平鲉再次發(fā)生大規(guī)模的疾病，引發(fā)了較為嚴(yán)重的死亡現(xiàn)象。病魚的主要臨床癥狀表現(xiàn)為：表皮出現(xiàn)明顯創(chuàng)傷性潰瘍，鰭條潰爛，個(gè)別病魚眼球突出、潰爛。本研究通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)采集發(fā)病魚樣品，對(duì)病魚體表病灶和腸道、肝臟、腎臟等內(nèi)臟器官進(jìn)行了病原菌分離，通過(guò)人工感染實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其致病性，并對(duì)病原菌的形態(tài)特征、生化特性、分類地位及藥物敏感性等進(jìn)行了分析，以期為防控該病提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用病魚取自山東省長(zhǎng)島縣大欽島周邊深水網(wǎng)箱，具有典型的皮膚潰瘍等臨床癥狀。人工感染用魚購(gòu)自威海某育苗場(chǎng)，體重(37.1±5.0) g。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌分離純化與形態(tài)觀察 現(xiàn)場(chǎng)采集具有典型癥狀的病魚帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原學(xué)檢驗(yàn)。解剖前，取病魚的黏液、病灶、鰓等組織制成水浸片，觀察是否有明顯寄生蟲及霉菌。無(wú)菌解剖后取病灶、腸、肝、腎等組織用 2.5%戊二醛固定液處理，透射電鏡觀察是否有病毒侵染。取病灶、腸、肝、腎等組織用1.5%滅菌生理鹽水人工勻漿，適當(dāng)稀釋后分別涂布于TSB和TCBS瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)觀察，觀察優(yōu)勢(shì)菌情況并進(jìn)行分離、純化培養(yǎng)，純化后的菌株用20%甘油生理鹽水保存于-80℃冰箱備用。

1.2.2 人工感染實(shí)驗(yàn) 將分離純化的優(yōu)勢(shì)菌接種于TSB瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h，用1.5%滅菌生理鹽水沖洗菌苔，經(jīng)分光光度法和平板計(jì)數(shù)法測(cè)定其菌懸液濃度為5.2× 109CFU/ml。用生理鹽水對(duì)該菌懸液進(jìn)行梯度稀釋后分別制成 5.2×108、5.2×107、5.2×106、5.2×105CFU/ml的菌懸液用于感染試驗(yàn)的注射菌液。取健康許氏平鲉140尾，分為7組，即5個(gè)實(shí)驗(yàn)組、1個(gè)陰性對(duì)照組和 1個(gè)空白對(duì)照組，每組20尾。實(shí)驗(yàn)組從背部肌肉注射(王曉冉等, 2017) 0.1 ml的菌液，陰性對(duì)照組注射等量的1.5%滅菌生理鹽水，空白對(duì)照組不做處理。飼養(yǎng)條件為160 L塑料桶，水溫控制在17～19℃。注射后觀察記錄魚的癥狀和發(fā)病死亡情況，對(duì)病魚及時(shí)進(jìn)行病原菌分離和鑒定。

1.2.3 病原菌理化特性研究 將病原菌接種于TSB和TCBS瓊脂培養(yǎng)基上，觀察菌落形態(tài)和大小。對(duì)細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色觀察，同時(shí)，用 2.5%戊二醛固定液處理，透射電鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。在無(wú)菌條件下挑取單一純菌落制備菌懸液，用常規(guī)的生理生化試劑盒(青島海博生物技術(shù)有限公司)對(duì)病原菌進(jìn)行理化特性測(cè)定。

1.2.4 菌株gyrB和16S rDNA基因序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析 挑取單菌落于50 μl去離子水中反復(fù)吹打，99℃金屬浴 10 min，12000 r/min 離心 1～2 min，取上清液作PCR模板。gyrB基因序列的PCR擴(kuò)增引物為 UP-1 (正向引物)：5'-GAAGTC ATCATGACCGTTCTGCA(C/T)GCAGGAGGCAA(A/G)TTCGA-3'和UP-2r (反向引物)：5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCATCGAC (A/G)TCGGCGTCCGTCAT-3'。16S rDNA基因序列的PCR 擴(kuò)增引物為27F (正向引物)：5'-AGA GTT TGA TC(C/A) TGG CTC AG-3'和1492R(反向引物)：5'-RGGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'。PCR 反應(yīng)體系 50 μl，包括 2 μl DNA 模板，5 μl 10×PCR Buffer，4 μl dNTP (2.5 mmol/L)，0.5 μlTaqDNA酶(5 U/μl)，正反向引物各 0.8 μl (10 μmol/L)，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至50 μl。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min 20 s，30 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳純化，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收產(chǎn)物。

取回收的產(chǎn)物用pMD18-T載體連接，混勻后加入SolutionI，16℃金屬浴中連接6 h以上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞 DH-5α中，挑選有插入目的片段的陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。將gyrB和16S rDNA基因序列通過(guò)NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析，從中分別選取與所獲的序列同源性較高的菌株的gyrB和16S rDNA基因序列，用 Mega 6.0采用鄰接法(Neighbor-joining method)獲得系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過(guò) Bootstrap法(1000次重復(fù))檢驗(yàn)。

1.2.5 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法對(duì)菌株進(jìn)行藥物敏感性測(cè)試。抗菌紙片采用杭州天和微生物試劑公司的藥敏紙片試劑盒，將抗菌紙片貼于涂滿菌液的 MH瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)18～24 h后，參考陳建國(guó)等(2017)記錄菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 病魚檢查

患病許氏平鲉初期攝食下降，貼于網(wǎng)箱壁緩慢游動(dòng)，中后期軀體表面出現(xiàn)創(chuàng)傷潰瘍，鰭條略有潰爛。解剖病魚發(fā)現(xiàn)腸壁透明，有少量積水，肝臟質(zhì)地松散，顏色較淺。黏液、病灶和鰓等器官組織水浸片檢查未見(jiàn)寄生蟲和真菌，光學(xué)顯微鏡下觀察無(wú)寄生蟲和真菌；透射電鏡觀察病灶、腸、肝、腎等組織無(wú)病毒粒子出現(xiàn)(圖1)。

圖1 患病許氏平鲉體表潰瘍Fig.1 The diseased S.schlegeli with skin ulcer

2.2 病原菌的形態(tài)觀察

從病魚病灶中分離出一株具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的菌株，命名為BZ01。對(duì)BZ01進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，在TSB瓊脂平板培養(yǎng)18～24 h后菌落呈半透明圓形，表面光滑，中央略隆起，直徑多在2 mm左右(圖2A)，同時(shí)菌落有明顯臭味。在TCBS上該菌也可生長(zhǎng)，菌落圓形光滑、邊緣整齊、隆起、呈綠色(圖2B)。革蘭氏染色呈陰性，短棒狀(圖2C)。透射電鏡觀察, 菌株呈短桿狀、兩端鈍圓, 具單根極生鞭毛, 菌體大小約為1.8 μm×0.8 μm (圖 2D)。

圖2 菌株的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of the strain

2.3 致病性驗(yàn)證

感染試驗(yàn)共進(jìn)行12 d，以注射結(jié)束后24 h計(jì)為1 d，以此類推。如圖 3 所示，5.2 × 109、5.2 × 108、5.2 × 107、5.2 × 106CFU/ml實(shí)驗(yàn)組的許氏平鲉均在注射菌液2 d后出現(xiàn)死亡。其中，5.2 × 109CFU/ml組在第3天全部死亡，5.2×108CFU/ml組在第5天全部死亡，5.2×107CFU/ml組在第7天全部死亡。低濃度組(5.2×105CFU/ml組)在第5天開(kāi)始出現(xiàn)死亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)累計(jì)死亡率為65%。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組均無(wú)死亡。人工感染后實(shí)驗(yàn)魚攝食量減少，貼于桶壁緩慢游動(dòng)、活力下降，注射處出現(xiàn)紅腫，皮膚出現(xiàn)點(diǎn)狀潰瘍、出血，后期潰瘍創(chuàng)面逐漸擴(kuò)大，部分病魚會(huì)出現(xiàn)腹水和白便現(xiàn)象，與自然感染下癥狀一致，而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組未出現(xiàn)任何異狀。參考李長(zhǎng)紅等(2009)的改良寇氏法，計(jì)算出菌株 BZ01對(duì)許氏平鲉12 d 的 LD50為 2.07×106CFU/ml。

圖3 菌株BZ01人工感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The artificial infection results of the strain BZ01

2.4 病原菌理化特性和藥物敏感性測(cè)定

菌株BZ01的理化特性結(jié)果見(jiàn)表1。可利用葡萄糖、甘露醇和阿拉伯糖，不利用蔗糖和乳糖，氧化酶陽(yáng)性，鳥氨酸水解酶和賴氨酸水解酶陽(yáng)性，精氨酸雙水解酶陰性，其理化特性與輪蟲弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株LMG21460T僅在密二糖和西蒙氏枸椽酸鹽 2個(gè)指標(biāo)上有差異。

2.5 病原菌gyrB和16S rDNA基因序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析

由引物UP-1和UP-2r擴(kuò)增菌株BZ01的gyrB基因序列，獲得有效基因序列長(zhǎng)度為1141 bp，通過(guò)Blast檢索發(fā)現(xiàn)其與弧菌屬同源性較高。其中，與輪蟲弧菌(Vibrio rotiferianus)同源性達(dá)99%。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)取相似度最高的10個(gè)菌株的gyrB基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖4所示，菌株BZ01與輪蟲弧菌聚合，置信度為100%。

表1 菌株BZ01的生理生化特征Tab.1 The biochemical reaction of the strain BZ01

由引物27F和1492R擴(kuò)增菌株BZ01的16S rDNA基因序列，獲得有效基因序列長(zhǎng)度為1480 bp，通過(guò)Blast檢索發(fā)現(xiàn)其與弧菌屬序列同源性最高。其中，與輪蟲弧菌(Vibrio rotiferianus)、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、坎氏弧菌(Vibrio campbellii)及需鈉弧菌(Vibrio natriegens)序列均有較高相似度。從以上相似度最高的序列中選擇12個(gè)菌株的16S rDNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖5所示，菌株BZ01與輪蟲弧菌聚合，置信度為51%。

綜合gyrB和16S rDNA基因序列鑒定結(jié)果，將菌株BZ01鑒定為輪蟲弧菌。

2.6 藥敏實(shí)驗(yàn)

對(duì)菌株BZ01進(jìn)行30種抗菌藥物的敏感性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，該菌株對(duì)菌必治、新霉素、四環(huán)素、氧氟沙星、氟哌酸、氟羅沙星、新生霉素、強(qiáng)力霉素、萘啶酸和氟苯尼考10種藥物高度敏感，對(duì)美滿霉素和頭孢噻肟 2種藥物中度敏感，而對(duì)青霉素、吡哌酸、頭孢他啶、鏈霉素、頭孢氨芐、頭孢拉定、先鋒必、頭孢唑啉、乙酰螺旋霉素、克拉霉素、阿米卡星、慶大霉素、阿奇霉素、卡那霉素、苯唑青霉素、氨芐青霉素、多粘菌素B、復(fù)方新諾明18種藥物耐藥。

圖4 基于gyrB基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree based on gyrB gene sequence alignment

圖5 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 The phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequence alignment

3 討論

山東省長(zhǎng)島縣作為中國(guó)北方最大的深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖基地，在冷水性魚類尤其是許氏平鲉的網(wǎng)箱養(yǎng)殖中占有極其重要的地位。但近年來(lái)隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，加之當(dāng)?shù)貪O民傳統(tǒng)作業(yè)生產(chǎn)中大量使用冰鮮雜魚餌料，致使水中有害微生物逐漸增多，疾病頻繁暴發(fā)，給當(dāng)?shù)貪O業(yè)發(fā)展造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其中，細(xì)菌性疾病更以其高傳染率和死亡率成為限制行業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素。目前，已報(bào)道的可對(duì)許氏平鲉致病的細(xì)菌主要有β-溶血性鏈球菌(β-heamolytic streptococcus)(Masahiroet al, 1986)格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)(Kanget al, 2004)、殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida) (Hanet al, 2011)、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi) (孟鵬等, 2010； Wonet al, 2008)、海分枝桿菌(Mycobacterium marinum) (繩秀珍等, 2011)、鰻利斯頓氏菌(Listonella anguillarum) (王庚申等, 2012)等。

本研究從患有皮膚潰瘍癥的許氏平鲉體表病灶分離到一株絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，通過(guò)回歸感染試驗(yàn)，驗(yàn)證該菌對(duì)許氏平鲉具有較強(qiáng)的致病力，人工感染后的許氏平鲉表現(xiàn)出體表潰瘍等與自然感染相同的癥狀。經(jīng)細(xì)菌形態(tài)特征、生理生化、gyrB和16S rDNA基因序列比對(duì)分析等多種方法將該菌株鑒定為輪蟲弧菌。國(guó)外有關(guān)輪蟲弧菌的報(bào)道始見(jiàn)于 2003年，由 Gomez-Gil等(2003)在褶皺臂尾輪蟲中分離得到，此后陸續(xù)出現(xiàn)有關(guān)于該菌的報(bào)道(Chowdhuryet al, 2011； Labbateet al, 2011)。近幾年來(lái)，國(guó)內(nèi)分別在養(yǎng)殖半滑舌鰨(陳政強(qiáng)等, 2012)、南美白對(duì)蝦(金春英, 2013)和線紋海馬(楊求華, 2017)中發(fā)現(xiàn)了輪蟲弧菌。感染該菌的半滑舌鰨主要癥狀為體表潰爛、尾部出血?；疾∧厦腊讓?duì)蝦主要癥狀為體表發(fā)紅、肌肉白濁、鰓部變黃潰爛。而患病線紋海馬主要癥狀為腹部凹陷，尾部呈L形，尾末端表皮脫落、潰爛等。但輪蟲弧菌感染游泳性魚類發(fā)病的案例尚未見(jiàn)報(bào)道。值得一提的是，本研究得到的輪蟲弧菌在TCBS培養(yǎng)基上菌落為綠色，說(shuō)明其不發(fā)酵蔗糖，因此，不能采用TCBS培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行定性鑒定。從16S rDNA和gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹上看, 根據(jù)16S rDNA基因序列建立的發(fā)育樹置信度普遍較低, 菌株BZ01與輪蟲弧菌(NR04281.1)置信度為51%，遠(yuǎn)低于gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度。因此，在區(qū)分親緣關(guān)系較近的種類時(shí)，gyrB基因序列更為適合做分類研究(王曉冉等, 2017)。

表2 菌株BZ01對(duì)抗菌藥物的敏感性測(cè)試Tab.2 The drug sensitivity test of strain BZ01

從藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，此次分離的輪蟲弧菌對(duì)不同類抗菌藥物的敏感性不同。其中，對(duì)四環(huán)素類(四環(huán)素、強(qiáng)力霉素)、喹諾酮類(氧氟沙星、氟哌酸、氟羅沙星、萘啶酸)、香豆素類(新生霉素)、肽酰轉(zhuǎn)移酶類(氟苯尼考)高度敏感，而對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(克拉霉素、乙酰螺旋霉素、阿奇霉素)、多肽類(多粘菌素B)、磺胺類(復(fù)方新諾明)、β-內(nèi)酰胺類(青霉素、苯唑青霉素、氨芐青霉素、頭孢他啶、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑啉、頭孢噻肟、先鋒必)、氨基糖苷類(鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星)中度敏感或不敏感。而在海馬中發(fā)現(xiàn)的輪蟲弧菌(楊求華等, 2017)對(duì)頭孢類和氨基糖苷類敏感，對(duì)四環(huán)素類和喹諾酮類耐藥，這與本次得到的輪蟲弧菌藥物敏感性不同，這說(shuō)明同種細(xì)菌不同菌株也會(huì)因養(yǎng)殖環(huán)境不同而表現(xiàn)不同的耐藥性。因此，養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)當(dāng)合理篩選和使用抗菌藥物，既要達(dá)到理想的預(yù)防治療疾病效果，更要避免細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。