姚嘉赟 徐 洋 袁雪梅 藺凌云 尹文林 潘曉藝 郝貴杰 沈錦玉

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省魚類健康與營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江省淡水水產(chǎn)研究所 湖州 313001)

多子小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis)，屬纖毛門、寡膜綱、膜口目、凹口科、小瓜蟲屬(沈韞芬, 1999)。該纖毛蟲體被分散排布且長短均一的纖毛，其生活史分為滋養(yǎng)體(Trophont)、包囊體(Tomont)和掠食體(Theront) 3個(gè)階段(Ewing, 1992)。滋養(yǎng)體主要寄生在宿主體表，如鰓、皮膚、鰭和眼等的上皮組織中。在病灶處呈邊緣明顯的白點(diǎn)，故該寄生蟲病也稱“白點(diǎn)病”。滋養(yǎng)體在魚類表皮或鰓上發(fā)育成熟，之后脫離魚體并在水體中形成包囊，且經(jīng)多次分裂后形成幼蟲，感染性掠食體在短時(shí)間內(nèi)侵染魚體進(jìn)而感染魚體，形成一個(gè)生活史(Lomet al, 1994)。小瓜蟲幾乎可以感染所有淡水魚類，其生長繁殖不需借助任何中間寄主，給世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失(Klesiuset al, 1995； Wahliet al, 1993)。因此，小瓜蟲的防治研究一直都是水產(chǎn)學(xué)科研究中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

國內(nèi)外科研工作者對(duì)小瓜蟲的防治藥物進(jìn)行了大量的研究，孔雀石綠和硝酸亞汞較為有效，但因其具有致癌作用，目前已被禁用(Rowlandet al, 2009)。甲醛(Strauset al, 2009a)、硫酸銅(Strauset al, 2009a)、過氧化氫(Lahnsteineret al, 2007)，過氧乙酸(Strauset al,2009b)，過碳酸鈉(Heineckeet al, 2009)，溴硝醇(Shinnet al, 2012； Picón-Camachoet al, 2012)，高鐵酸鉀(Linget al, 2010)等被用于控制小瓜蟲病，雖有一定的功效，但長期使用帶來的是環(huán)境污染、藥物殘留、耐藥性等一系列問題，也成為當(dāng)前食品安全和水產(chǎn)品出口的綠色貿(mào)易壁壘問題，引起社會(huì)各界普遍關(guān)注。因此，尋找對(duì)小瓜蟲病治療行之有效的環(huán)境友好型藥物是一項(xiàng)迫在眉睫的任務(wù)。作者利用多種技術(shù)手段從天然植物博落回(Macleaya cordata)和小果博落回(Macleaya microcarpa)中分離獲得到了 3種苯菲啶異喹啉類化合物：血根堿(Yaoet al, 2010)、二氫血根堿和二氫白屈菜紅堿(Yaoet al, 2011)，藥效結(jié)果顯示，三者對(duì)小瓜蟲具有較強(qiáng)的殺滅作用。同時(shí)，構(gòu)效關(guān)系研究初步表明，其核心藥效基團(tuán)主要為四氫異喹啉，因此，本研究以 1-甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉為起始原料，在2位的胺基上引入與環(huán)己甲酰氯、苯甲酰氯、噻吩甲酰氯、環(huán)己基異硫氰酸酯以及氯乙酰氯等不同基團(tuán)，研究其殺蟲功能，以期研制開發(fā)新型的殺蟲藥物。

1 材料與方法

1.1 四氫異喹啉衍生物的合成及鑒定

四氫異喹啉衍生物的合成方法參照王文龍等(2013)的方法進(jìn)行。將 1-甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉化合物溶于二甲基亞砜(DMSO)中，冰浴條件下，分別加入環(huán)己甲酰氯、苯甲酰氯、噻吩甲酰氯、乙酰氯以及氯乙酰氯后，常溫條件下進(jìn)行攪拌，并利用薄層層析進(jìn)行追蹤檢測。經(jīng)酸洗、堿洗以及柱層析純化后得化合物 1～化合物 5，依次為環(huán)己基-(1-甲基-3,4-二氫異喹啉-2(1H)-基)-甲酮、二氫異喹啉-2(1H)-基)-苯基-甲酮、甲基-3,4-二氫異喹啉-2(1H)-基)-噻吩-2-基-甲酮、1-(1-甲基-3,4-二氫異喹啉-2(1H)-基)-乙酮和 2-氯-1-(1-甲基-3,4-二氫異喹啉-2(1H)-基)-乙酮，見圖1。

圖1 1-甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉衍生物合成過程Fig.1 Synthesis process of 1-methyl-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline derivatives

針對(duì)上述合成的 5種化合物，利用質(zhì)譜(Waters micromas platform LCZ)、核磁氫譜、核磁碳譜(BRUKER AVIII-400型核磁共振儀)等波譜技術(shù)進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定，進(jìn)而確定化合物合成是否成功。

1.2 四氫異喹啉衍生物對(duì)小瓜蟲的體外殺滅實(shí)驗(yàn)

1.2.1 蟲體的收集 將嚴(yán)重感染小瓜蟲的翹嘴紅鲌(Erythroculter ilishaeformi)飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室的階梯式養(yǎng)殖水槽中，在養(yǎng)殖水槽的底部放入大量自制的玻璃蟲體收集器，待魚體上的小瓜蟲游出魚體，進(jìn)入水體底部的玻璃收集器后，收集蟲體，一部分蟲體放入22℃的蟲體培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，獲取小瓜蟲掠食體進(jìn)行殺蟲實(shí)驗(yàn)。另一部分放入平皿，進(jìn)行體外包囊藥物實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 藥物對(duì)小瓜蟲掠食體的體外殺滅實(shí)驗(yàn) 用DMSO溶解合成的所有藥物，進(jìn)而配制成不同濃度梯度，向24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入150 μl藥物。收集小瓜蟲掠食體，并放置在燒杯中進(jìn)行稀釋，至濃度約為200個(gè)/100 μl，待藥物加入細(xì)胞培養(yǎng)皿后，向每個(gè)藥物孔中加入50 μl蟲體，并用槍頭混勻。觀察小瓜蟲的死亡情況，并統(tǒng)計(jì)每個(gè)藥物濃度的4 h死亡率。實(shí)驗(yàn)設(shè)1個(gè)空白對(duì)照組和1個(gè)DMSO對(duì)照組(前期實(shí)驗(yàn)表明，藥物中所添加的最高濃度 DMSO對(duì)小瓜蟲掠食體沒有毒性)。每個(gè)藥物濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 藥物對(duì)小瓜蟲包囊的體外殺蟲實(shí)驗(yàn) 按照前面的方法配制不同濃度梯度的藥物，并進(jìn)行殺蟲預(yù)實(shí)驗(yàn)，初步確定藥物對(duì)包囊的殺蟲濃度范圍，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行殺蟲藥效評(píng)價(jià)。向24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入150 μl藥物。收集小瓜蟲包囊，并放置在燒杯中進(jìn)行稀釋，至濃度約為60個(gè)/100 μl，待藥物加入細(xì)胞培養(yǎng)皿后，向每個(gè)藥物孔中加入50 μl蟲體，置于22℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)20～36 h后，統(tǒng)計(jì)各藥物濃度組的包囊死亡數(shù)量和孵化的幼蟲數(shù)量。實(shí)驗(yàn)設(shè)1個(gè)空白對(duì)照組和1個(gè)DMSO對(duì)照組(前期實(shí)驗(yàn)表明，藥物中所添加的最高濃度 DMSO對(duì)小瓜蟲包囊沒有毒性)。每個(gè)藥物濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3 環(huán)己基-(1-甲基-3,4-二氫異喹啉-2(1H)-基)-甲酮對(duì)翹嘴紅鲌的急性毒性實(shí)驗(yàn)

因化合物 1 [環(huán)己基-(1-甲基-3,4-二氫異喹啉-2(1H)-基)-甲酮]對(duì)小瓜蟲的體外殺蟲效果最強(qiáng)，故而研究其對(duì)翹嘴紅鲌的安全性。急性毒性實(shí)驗(yàn)按照Yao等(2010)的方法進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)魚暫養(yǎng)7 d (其自然死亡率為0.5%)后，進(jìn)行毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)，初步確定藥物的毒性實(shí)驗(yàn)濃度，按等對(duì)數(shù)間距設(shè)計(jì)7個(gè)濃度(289.0、256.0、225.0、196.0、156.0、144.0和121.0 mg/L)，每個(gè)濃度組隨機(jī)放置10尾實(shí)驗(yàn)魚。實(shí)驗(yàn)控制水溫為(25±1)℃，氨氮濃度＜0.05 mg/L，溶解氧＞6 mg/L，亞硝酸鹽＜0.01 mg/L。實(shí)驗(yàn)期間不投喂飼料，一旦有死魚，及時(shí)撈出，每個(gè)藥物濃度實(shí)驗(yàn)設(shè) 3個(gè)重復(fù)。根據(jù) 12、24、48和96 h的平均死亡率，利用直線內(nèi)插法求出半致死濃度(LD50)，其安全濃度的計(jì)算公式如下：

安全濃度=(24 h LD50×0.3)/(24 h LD50/48 h LD50)3

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 16.0軟件處理藥效數(shù)據(jù)，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SE)表示，采用方差分析進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 四氫異喹啉衍生物對(duì)小瓜蟲掠食體的殺滅作用

5種四氫異喹啉衍生物對(duì)小瓜蟲幼蟲的殺滅作用見圖2。由圖2可知，5種化合物在所測的濃度范圍內(nèi)對(duì)小瓜蟲掠食體均具有殺滅作用。而殺蟲效果最好的為化合物1，其濃度為24.0 mg/L時(shí)，在4 h即可殺滅100%幼蟲，4 h的LD50為16.4 mg/L，而殺蟲效果最差的為化合物4，其濃度為25.0 mg/L時(shí)，殺滅率為39.7%，4 h的LD50為30.6 mg/L。對(duì)小瓜蟲掠食體的殺滅效果依次是化合物1＞化合物3＞化合物2＞化合物5＞化合物4。

體外殺蟲實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，5種四氫異喹啉衍生物對(duì)小瓜蟲掠食體具有一定的細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞作用，使用藥物后，小瓜蟲的纖毛不運(yùn)動(dòng)，胞質(zhì)不流動(dòng)，甚至胞膜破裂，細(xì)胞核破碎，而對(duì)照組小瓜蟲體表纖毛完整，運(yùn)動(dòng)正常。

2.2 四氫異喹啉衍生物對(duì)小瓜蟲包囊的殺滅作用

5種四氫異喹啉衍生物對(duì)小瓜蟲包囊的殺滅作用見表1。由表1可知，5種化合物在所測的濃度范圍內(nèi)對(duì)小瓜蟲的包囊均具有殺滅或抑制作用。殺蟲效果最好的為化合物1，其濃度為60.0 mg/L時(shí)，可100%殺滅包囊，化合物3的效果最差，其濃度為60.0 mg/L時(shí)，包囊的死亡率為30%。5種化合物對(duì)小瓜蟲包囊的殺滅效果依次是化合物1＞化合物5＞化合物4＞化合物2＞化合物3。

體外殺蟲實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，使用后藥物組的包囊破裂、邊界模糊，蟲體不分裂，胞質(zhì)不清晰，包囊不能進(jìn)行分裂為幼蟲。而空白對(duì)照組的包囊進(jìn)行分裂，最后孵化成幼蟲(圖3)。

2.3 環(huán)己基-(1-甲基-3,4-二氫異喹啉-2(1H)-基)-甲酮對(duì)翹嘴紅鲌的急性毒性實(shí)驗(yàn)

環(huán)己基-(1-甲基-3,4-二氫異喹啉-2(1H)-基)-甲酮對(duì)翹嘴紅鲌的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，由直線內(nèi)插法計(jì)算可得，環(huán)己基-(1-甲基-3,4-二氫異喹啉-2(1H)-基)-甲酮對(duì)翹嘴紅鲌的24 h的LD50為245.3 mg/L；48 h的LD50為234.3 mg/L；96 h的LD50為197.8 mg/L；根據(jù)公式計(jì)算可得，其安全濃度為64.1 mg/L。

圖2 5種化合物對(duì)小瓜蟲掠食體的殺滅作用(4 h)Fig.2 Antiparasitic efficacy of the five synthesized compounds against I.multifiliis theronts after 4 h exposure

表1 化合物1～5對(duì)小瓜蟲包囊的成活和孵化影響(6 h)Tab.1 I.multifiliis tomont survival and reproduction after 6 h exposure to the five synthesized compounds

圖3 異喹啉衍生物作用小瓜蟲包囊后的顯微結(jié)構(gòu)Fig.3 Microstructure of I.multifiliis tomont after treated with the five 1-methyl-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline derivatives

3 討論

小瓜蟲是危害水產(chǎn)養(yǎng)殖中的一個(gè)重要寄生蟲，因其生活史中不需要中間寄主，故而只要切斷其中一個(gè)生活史階段即可達(dá)到病害防控的目的。目前，魚體上滋養(yǎng)體階段的小瓜蟲因包囊外包一層膜，因此，藥物很難進(jìn)入將其殺死。本研究通過合成5種異喹啉類衍生物研究其對(duì)小瓜蟲的掠食體和包囊殺滅作用，結(jié)果顯示，5種化合物對(duì)2個(gè)生活史階段的多子小瓜蟲均有較好的殺滅作用，具有一定的開發(fā)應(yīng)用前景。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)化合物1對(duì)二者的殺滅作用最強(qiáng)，而較為有意義的發(fā)現(xiàn)是化合物 5對(duì)包囊的殺滅作用要強(qiáng)于對(duì)掠食體的殺滅作用，一般而言，包囊的殺滅難度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于掠食體階段，而化合物5則相反，故而該藥物可能存在著針對(duì)包囊的作用靶點(diǎn)或者藥效基團(tuán)。前期工作中也發(fā)現(xiàn)，制霉菌素對(duì)小瓜蟲包囊的殺滅作用也是強(qiáng)于掠食體階段(Yaoet al, 2015)，因此，今后可針對(duì)這2種藥物進(jìn)行包囊藥物靶點(diǎn)和藥效基團(tuán)方面的研究。

表2 環(huán)己基-(1-甲基-3,4-二氫異喹啉-2(1H)-基)-甲酮對(duì)翹嘴紅鲌的急性毒性Tab.2 Acute toxicity of cyclohexyl-(1-methyl-3,4-dihydroiso-quinoline)-ketone to E.ilishaeformis

異喹啉及其衍生物是一類重要的醫(yī)藥化工中間體，被廣泛應(yīng)用于各種重要醫(yī)用藥物。國內(nèi)外的研究表明，異喹啉類生物堿具有抗腫瘤、抗菌、降壓等多種生物活性(Navarroet al, 1999； Menget al, 2009； Huet al, 2006)，Wang 等(2010)和 Yao 等(2010、2011)也獲得多種具有殺指環(huán)蟲和小瓜蟲的異喹啉類生物堿。分析各類異喹啉類生物堿的結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，絕大部分該類化合物均存在著異喹啉或者異喹啉衍生物的基本框架結(jié)構(gòu)。本研究參考王文龍等(2013)的方法以1-甲基-1,2,3,4-四氫異喹啉為起始原料，合成了 5種異喹啉類生物堿，殺小瓜蟲藥效結(jié)果顯示，在2位的胺基上引入以含環(huán)己基的化合物 1的殺蟲活性明顯高于含芳香環(huán)的化合物2和化合物3，說明芳香環(huán)的引入有礙于殺蟲活性的提高，該結(jié)果與王文龍等殺日本血吸蟲的藥效結(jié)果類似。氯乙酰基是一種重要的活性基團(tuán)，異喹啉類衍生物引入氯乙?；尚纬瑟?dú)特的殺蟲活性藥效團(tuán)(王文龍, 等2013)，但本研究通過引入氯乙酰基其殺蟲活性并未得到提升，可能是殺蟲活性與氯乙?；旧斫Y(jié)構(gòu)關(guān)系較小。故而，將來在對(duì)異喹啉類藥物進(jìn)行合成時(shí)需要盡量減少芳香基團(tuán)和氯乙酰基等基團(tuán)的引入。