王麗麗 李寶山 王際英① 孫永智 韓秀杰 王雅平 郝甜甜 王世信

(1.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院 水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心 上海 201306；2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院山東省海洋生態(tài)修復重點實驗室 煙臺 264006)

維生素 D3為脂溶性類固醇衍生物，是水生動物 生長所必需的營養(yǎng)素(黎德兵等, 2015)。水生動物自身不能合成或者合成量不能滿足機體的需要，必需從食物中獲取足量的維生素 D3來滿足機體生理生化功能的需要(彭翔等, 2010； Yaniket al, 2016)。已有研究表明，維生素D3能夠促進腸道黏膜上皮細胞Ca結合蛋白的形成，促進 Ca、P的吸收，調節(jié)體內(nèi) Ca、P平衡(李愛杰, 1996)。此外，維生素D3還參與協(xié)調提高機體的免疫(付京花等, 2006)及抗氧化能力(Martínez-álvarezet al, 2005)。目前，有關水生動物對維生素 D3最適需求量的研究主要集中在鯉魚(Cyprinus carpio)(張桐等, 2011)，黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco) (段鳴鳴等, 2014)，鱸魚(Lateolabrax japonicus)(張璐等, 2016)，草魚(Ctenopharyngodon idellus)(蔣明等, 2009)等魚類，有關仿刺參(Apostichopus japonicus)幼參對維生素D3的最適需求量未見報道。

仿刺參具有較高保健功效及經(jīng)濟價值，是我國渤海和黃海水域的重要海水養(yǎng)殖種類(張德瑞等, 2016)。目前，維生素在仿刺參飼料中的應用研究較少，僅見維生素C(Luoet al, 2014)和維生素E(汪將, 2014)對仿刺參生長和免疫特性影響的研究。因此，本研究通過在飼料中添加不同水平的維生素D3，研究其對仿刺參幼參生長、消化酶活力及免疫能力的影響，以期為仿刺參對飼料中維生素D3的需求量提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗設計與飼料制備

實驗分為6個處理組，每個處理組3個重復，每個重復30頭仿刺參[(15.43±0.14) g]。實驗所用維生素D3含量為500000 IU/g(浙江新維普添加劑有限公司)。以魚粉和發(fā)酵豆粕為蛋白源，魚油和大豆卵磷脂為脂肪源，配制粗蛋白含量為22%，粗脂肪含量為4%的基礎飼料，在基礎飼料中分別添加0、250、500、1000、2000、3000 IU/kg的維生素D3，配制成6種實驗飼料，命名為 D1、D2、D3、D4、D5、D6。固體原料超微粉碎過200目標準篩，按配比稱重，加入新鮮魚油及適量的蒸餾水混勻，用小型顆粒飼料擠壓機制成直徑為0.3 cm、厚度為0.05 cm的片狀飼料，60℃烘干備用。實驗飼料配方及營養(yǎng)組成見表1。

1.2 實驗用參及實驗管理

養(yǎng)殖實驗在山東省海洋資源與環(huán)境研究院東營實驗基地循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行，實驗用仿刺參幼參購自山東蓬萊安源水產(chǎn)有限公司。挑選大小均勻、健康無病的仿刺參于養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)15 d，期間投喂基礎飼料。待其完全適應飼養(yǎng)條件后，隨機分為6個處理組，每個處理組3個重復，每個重復30頭仿刺參，平均體重為(15.43±0.14) g，隨機放養(yǎng)于18個圓柱形養(yǎng)殖桶(70 cm×80 cm)中，控制水深為60 cm，實驗周期為56 d。每桶放海參養(yǎng)殖筐2個，內(nèi)嵌波紋板20張，每隔30 d更換養(yǎng)殖筐 1次。養(yǎng)殖期間，控制水溫為17～19℃，水流速為 2 L/min，鹽度為 26～28，pH為7.6～8.2，溶解氧＞5.0 mg/L，氨氮(NH4-N)和亞硝酸鹽(NaNO2)＜0.05 mg/L。每天 08：00 換水，換水量為 1/3，每天 16：00投餌1次，初始投喂量占體重的 2%，每天觀察仿刺參的攝食情況及時調整投喂量，并記錄水溫及死亡情況。每3 d吸底1次，用虹吸法將殘餌及糞便吸出，養(yǎng)殖實驗在弱光環(huán)境下進行。

1.3 樣品采集與處理

養(yǎng)殖實驗結束后，控食48 h，統(tǒng)計各桶仿刺參的數(shù)量并稱重，用于存活率(Survival rate, SR, %)、增重率(Weight gain rate, WGR, %)、特定生長率(Specific growth rate, SGR, %/d)及腸體比(Ratio of intestine weight to body weight, IWR, %)的計算。每桶隨機取8頭置于潔凈的泡沫板上，用濾紙輕輕將仿刺參體表的水分吸干后分別稱重。去除體腔液后，置冰盤上分離腸道和體壁。腸道去除內(nèi)容物，用定性濾紙擦凈后分別稱重，將腸道樣品和體壁放在-20℃條件下冷凍保存，待測。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 生長指標

WGR =(Wt-W0)×100/W0；

SGR =(lnWt-lnW0)×100/d；

SR=(實驗末參數(shù)/實驗初參數(shù))×100；

IWR=(Wi/Wt)×100。

式中，W0為實驗初仿刺參體重，Wt為實驗末仿刺參體重，d為實驗天數(shù)，Wi為實驗末仿刺參腸道重量。

1.4.2 飼料及體壁基本營養(yǎng)成分的測定 飼料及體壁水分采用105℃烘干至恒重法(GB/T6435-2014)；粗蛋白采用凱氏定氮法(GB/T6432-2006)；粗脂肪采用索氏抽提法(GB/T6433-2006)；粗灰分采用 550℃馬弗爐灼燒法(GB/T6438-2007)；Ca采用乙二胺四乙酸二鈉絡合滴定法(GB/T6436-2002)、總磷采用分光光度法(GB/T6437-2002)。飼料能量采用燃燒法(IKA,C6000, 德國)；飼料維生素D3在通標標準技術(青島)有限公司采用高效液相色譜法-皂化提取法(GB/T 17818-2010)測定。測定步驟：稱取樣品進行皂化，將皂化液轉移到分液漏斗中進行提取，最后將提取液進行蒸干濃縮，加入甲醇溶解，進行過濾，得到待測液，用高效液相色譜儀(Agilent 1200, 美國)檢測；體壁 Mg、Fe、Mn采用濃硝酸微波消解后用電感耦合等離子體質譜儀(Agilent 7700, 美國)測定；體壁羥脯氨酸采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定；體壁維生素 D3含量采用上海酶聯(lián)生物科技有限公司ELISA試劑盒測定，具體測定步驟參照試劑盒說明書。

表1 實驗飼料配方及營養(yǎng)成分(干物質%)Tab.1 Formulation and proximate composition of experimental diets (Dry matter %)

1.4.3 抗氧化酶活力的測定 取腸道樣品，剪碎，加入9倍體積冰冷的生理鹽水(0.9%)，制成10%的勻漿，在4℃條件下，8000 r/min離心10 min，取出上清液，分裝于 2 ml的離心管中，保存于-80℃冰箱，待測。

堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)、總超氧化物歧化酶(Total superoxide dismutase, T-SOD)、過氧化氫酶(Catalase, CAT)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)以及總抗氧化能力(Total antioxidant capacity, T-AOC)均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定，堿性磷酸酶活力單位轉化為國際單位，其他酶活定義及具體測定步驟參照試劑盒說明書。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用 SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析(Oneway ANOVA)，當處理之間差異顯著(P＜0.05)時，用Duncan’s檢驗進行多重比較分析。統(tǒng)計數(shù)據(jù)以平均值±標準誤(Mean±SE)表示。

2 結果與分析

2.1 維生素D3對仿刺參幼參生長性能的影響

飼料維生素D3對仿刺參的SR無顯著影響(P＞0.05)，隨著飼料維生素D3含量的增加，WGR及SGR呈先上升后下降的趨勢，均在D4組達到最高值，D1組顯著低于其他組(P＜0.05)。D3、D4、D5 組 IWR顯著高于其他 3組(P＜0.05)，但 3組之間差異不顯著(P＞0.05)(表 2)。

以WGR為評價指標，經(jīng)一元二次回歸分析得出，初始體重為15.43 g的仿刺參對飼料中維生素D3的最適需求量為1587.5 IU/kg(圖1)。

圖1 維生素D3水平與仿刺參增重率的相關性分析Fig.1 Relationship between dietary vitamin D3 level and weight gain rate (WGR) of A.japonicus

2.2 維生素D3對仿刺參幼參體組成的影響

飼料維生素 D3顯著影響了仿刺參體壁粗灰分、Ca、P、Mg、Fe及羥脯氨酸含量(P＜0.05)，但對水分、粗蛋白、粗脂肪及 Mn含量影響不顯著(P＞0.05)。隨著飼料維生素 D3含量的增加，粗灰分含量呈上升趨勢，D3、D4、D5組無顯著性差異(P＞0.05)，D1、D2、D6組顯著低于D4、D5組(P＜0.05)，與D3組無顯著性差異(P＞0.05)；羥脯氨酸含量呈先降后升的趨勢，D4組達到最低值，D1、D6組無顯著性差異，顯著高于其他4組(P＜0.05)；仿刺參體壁維生素D3沉積量與羥脯氨酸呈相同趨勢，但 D4組顯著高于其他組(P＜0.05)，D4、D5、D6 組顯著高于 D1、D2 組(P＜0.05)，D5、D6組與D3組間無顯著性差異(P＞0.05)(表3)。

飼料維生素D3顯著提高了仿刺參體壁Ca含量，各組顯著高于D1組(P＜0.05)；隨著飼料維生素D3含量的增加，P含量呈先上升后平穩(wěn)的趨勢，D1、D2組無顯著性差異(P＞0.05)，D4、D5、D6組顯著高于D1、D2 組(P＜0.05)，且 3組間無顯著性差異(P＞0.05)，D3組顯著高于D1組(P＜0.05)，與其他4組間無顯著性差異(P＞0.05)；Mg含量呈上升趨勢，D1組顯著低于其他組(P<0.05)；Fe含量呈先升后降趨勢，D5、D6組顯著低于其他組(P＜0.05)，D5、D6組間無顯著性差異(P＞0.05)；Mn含量呈下降趨勢，但各組間差異不顯著(P>0.05)(表4)。

2.3 維生素D3對仿刺參幼參腸道抗氧化酶活力的影響

隨著飼料維生素 D3含量的增加，仿刺參腸道AKP及T-SOD活力均呈先上升后下降的趨勢，AKP活力在 D4組達到最高值，D1組顯著低于其他各組(P＜0.05)；D1、D6組T-SOD活力顯著低于其他各組(P＜0.05)，D1、D6組間無顯著性差異(P＞0.05)，D5組達到最高值。MDA含量隨著飼料維生素D3含量的增加呈下降趨勢；CAT活力及T-AOC受飼料維生素D3含量的影響不顯著(P＞0.05)(表5)。

表2 飼料維生素D3對仿刺參幼參生長性能及形體指標的影響Tab.2 Effects of dietary vitamin D3 on growth performance and physical indices of juvenile sea cucumber A.japonicus

表3 飼料維生素D3對仿刺參幼參體壁基本成分的影響Tab.3 Effects of dietary vitamin D3 on body wall composition of juvenile sea cucumber A.japonicus

表4 飼料維生素D3對仿刺參體壁礦物元素含量的影響Tab.4 Effects of dietary vitamin D3 on mineral contents of the body wall of A.japonicus

表5 飼料維生素D3對仿刺參腸道抗氧化酶活力的影響Tab.5 Effects of dietary vitamin D3 on antioxidant enzyme activities of intestine of juvenile sea cucumber A. japonicus

3 討論

3.1 飼料中添加維生素D3對仿刺參幼參生長性能的影響

關于維生素 D3促進動物生長的研究報道已有很多，維生素 D3可從激素、細胞及分子水平上影響動物的生長和 Ca結合蛋白的形成(Maalouf, 2008)，適量添加可促進動物生長，但過量添加會抑制動物的生長，甚至產(chǎn)生毒性。本研究中，隨著飼料中維生素D3含量的增加，各組仿刺參 SR沒有顯著性差異，WGR和SGR呈先升后降的趨勢，D4組達到最高值，當飼料維生素D3含量為3000 IU/kg時，仿刺參WGR和SGR明顯下降，與在中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)(孫新瑾, 2009)、凡納濱對蝦(Penaeus monodon)(Heet al, 1992)、皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai) (周歧存等, 2004)研究結果一致。仿刺參體腔液中Ca含量比較豐富，適量的維生素 D3能夠促進甲狀腺激素的分泌，進而提高仿刺參的生長速度(張璐等, 2016)；而高水平的維生素D3對維生素A和維生素E的吸收有拮抗作用，這在一定程度上會降低動物的生長速度(陳娟等, 2010)。隨著飼料維生素D3含量的增加，仿刺參的IWR呈先升后降趨勢，說明適量的維生素D3能夠促進腸道的發(fā)育，提高仿刺參的生長性能。以WGR為評價指標時，經(jīng)一元二次回歸分析得出，仿刺參幼參對維生素D3的最適需求量為1587.5 IU/kg。

3.2 飼料中添加維生素D3對仿刺參幼參體成分的影響

養(yǎng)殖動物的體成分隨配合飼料組成的不同而發(fā)生變化，包括粗蛋白、粗脂肪、水分、粗灰分等。本研究中，仿刺參體壁水分含量不受飼料維生素 D3含量的影響，這與蔣明等(2009)對草魚的研究結果一致，表明不同含量的維生素 D3對仿刺參體壁干物質的積累程度無顯著影響；仿刺參的生長性能及體壁粗蛋白含量與飼料蛋白水平有關(王慶吉等, 2014； 趙斌等,2016)，而本研究各組仿刺參體壁粗蛋白含量差異不顯著，表明當飼料中蛋白質含量一致時，體壁粗蛋白含量并不能真實的反映仿刺參的生長情況。隨著維生素 D3含量的增加，各組仿刺參體壁粗脂肪含量無顯著性差異，這與虹鱒(Oncorhynchus mykiss) (Barnettet al, 1982)及皺紋盤鮑(周歧存等, 2004)的研究結果不一致，仿刺參自身對脂肪的需求量與魚類相比較低，因此維生素 D3對仿刺參的脂肪代謝可能影響不大。羥脯氨酸是膠原蛋白的主要成分之一，是反映膠原蛋白數(shù)量的常見指標。本研究中，隨著飼料維生素D3含量的增加，仿刺參體壁中羥脯氨酸含量呈先降后升的趨勢，D4組為最低值。骨骼的主要成分為骨鹽(鈣鹽和磷酸鹽)和有機基質(I型膠原)，從仿刺參體壁中提取的膠原蛋白氨基酸組成與I型膠原蛋白的氨基酸組成相似(崔鳳霞等, 2006)，當攝食飼料中維生素 D3缺乏和過多時，會導致仿刺參體壁骨鹽減少、I型膠原含量上升，從而使體壁中羥脯氨酸含量升高；仿刺參體壁中維生素D3的沉積量隨著飼料維生素D3含量的增加呈先升后降的趨勢，說明維生素 D3在促進動物生長的同時增加了自身在機體內(nèi)的沉積量。

維生素D3對骨骼礦化以及Ca、P的沉積作用是濃度依賴型，在適宜濃度范圍內(nèi)，維生素 D3含量的增加能夠促進骨骼礦化和Ca、P沉積，過高或過低均會導致骨骼礦化異常。本研究發(fā)現(xiàn)，飼料維生素 D3含量顯著影響了仿刺參體壁粗灰分及Ca、P含量，當含量為 1000、2000 IU/kg時，仿刺參體壁粗灰分、Ca、P含量顯著高于D1組，添加量為3000 IU/kg時，粗灰分及Ca含量呈下降趨勢，但P含量趨于穩(wěn)定。仿刺參生活在含Ca豐富的海水中，可以從海水中吸收Ca滿足機體的生理代謝需要。飼料中適量的維生素D3能夠促進礦物質在體壁中的積累，粗灰分及Ca含量上升；但過量的補充維生素 D3則抑制礦物質沉積(Graffet al, 2015)，粗灰分及Ca含量下降；而海水中P含量較低，體壁中的P主要來源于飼料，因此，飼料維生素D3含量過高時，同樣能夠促進P的吸收；Mg在細胞代謝及骨骼發(fā)育過程中起著重要的作用，在體內(nèi)，Mg與 Ca的代謝密切相關，本研究仿刺參體壁 Mg含量隨飼料維生素 D3含量的增加而增加，D1組顯著低于其他組，Ca與Mg結構相似，在一定范圍內(nèi)，維生素D3能夠促進Mg的吸收。Fe是各種動物必需的礦物元素，是動物營養(yǎng)中最重要的微量元素之一，是生物機體生長發(fā)育不可缺少的條件(張佳明, 2007)，隨著維生素D3含量的增加，仿刺參體壁Fe含量呈先升后降趨勢，說明機體在維生素D3促進Fe2+吸收的同時受其他陽離子的影響。Mn是骨正常形成所必需的元素，機體對Mn的吸收利用受很多因素的影響(王秋梅, 2007)，本研究隨著維生素D3含量的增加，各組仿刺參體壁Mn含量無顯著性差異，表明機體對 Mn的吸收不受維生素 D3含量的影響，與在肉雞上的研究結果不一致(張淑云等, 2010)，可能與養(yǎng)殖對象的種類有關。

3.3 飼料中添加維生素D3對仿刺參幼參腸道抗氧化酶活力的影響

仿刺參缺乏特異性的免疫系統(tǒng)，只有體壁和體內(nèi)防御機制共同組成的非特異性免疫體系(白陽等,2016)。仿刺參體內(nèi)的免疫主要分為細胞免疫和體液免疫，二者之間密切相關，相輔相成。仿刺參腸道免疫及抗氧化酶活力的高低可以間接地反應機體的健康狀況(常杰等, 2011)。

堿性磷酸酶(AKP)是一種含 Zn對底物專一性較低的磷酸單脂水解酶，在體內(nèi)直接參與磷酸基團的轉移和代謝，與機體的Ca、P代謝有關(Haussleret al,1970； Normanet al, 1970)。本研究中，隨著飼料維生素D3含量的增加，仿刺參腸道AKP活力呈先上升后下降的趨勢，D4組達到最高值，與斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)研究結果一致(Shiauet al, 1994)。AKP存在于骨、腸道等組織中，在生理劑量范圍內(nèi)，維生素D3促進了腸道對Ca、P的吸收，AKP活力上升，當維生素D3含量過高時，抑制了腸道對Ca、P的吸收，AKP活力下降。實驗結果顯示，維生素 D3與 AKP活力存在良好的相關性。

抗氧化物酶系統(tǒng)被認為是免疫系統(tǒng)的一部分，是細胞抵御氧化損傷的主要武器?？偝趸锲缁?T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)和總抗氧化能力(T-AOC)等組成的抗氧化酶系統(tǒng)可以清除過多的自由基，保護機體免受活性氧基團(ROS)的損傷。T-SOD和 CAT活力的高低間接地反應了機體清除氧自由基的能力。本研究中，隨著飼料維生素D3含量的增加，腸道T-SOD活力呈先上升后下降的趨勢，并在D5組達到最高值，表明維生素D3對T-SOD的生成有較強的誘導能力，增強機體的抗氧化能力。CAT具有重要的生理功能，在細胞內(nèi)與產(chǎn)生 H2O2的需氧脫氫酶類同時存在，可以催化H2O2分解為H2O和O2，和SOD協(xié)同完成細胞內(nèi)的抗氧化作用。本研究仿刺參腸道CAT活力受飼料中維生素D3含量影響不顯著，這與在黃顙魚(段鳴鳴等, 2014)的研究結果不一致，仿刺參是無脊椎動物，缺少脊椎動物所具有的特異性免疫器官，與SOD相比，較高含量的維生素D3才能最大限度地提高CAT活力?？偪寡趸芰?T-AOC)可以反映機體的抗應激能力(Rengpipatet al, 2000)，隨著維生素D3含量的增加，各實驗組腸道T-AOC無顯著性差異，而張淑云等(2010)研究發(fā)現(xiàn)，隨飼糧維生素D3含量的增加，肉雞血清和肝臟中T-AOC呈上升趨勢，與本研究結果不一致，這與動物種類及實驗條件不同有關(Mourenteet al, 2002)。丙二醛(MDA)是脂質過氧化反應鏈式終止階段產(chǎn)生的小分子產(chǎn)物，其含量可以間接反映自由基的產(chǎn)生情況和機體組織細胞的脂質過氧化程度(Onderciet al, 2003)。本研究，隨著飼料維生素 D3含量的增加，腸道中 MDA的含量呈下降趨勢，添加量為3000 IU/kg時，MDA含量最低。與在肉雞(陳娟等, 2010)和蛋雛鴨(解俊美等, 2012)上研究結果一致，說明維生素 D3在提高仿刺參抗氧化能力方面具有一定的積極作用。

4 結論

以WGR為評價指標，經(jīng)一元二次線性回歸分析可知，初始體重為15.43 g的仿刺參對飼料中維生素D3的最適需求量為1587.5 IU/kg。飼料中適量的添加維生素D3能夠提高仿刺參的生長性能，對仿刺參體壁體組成產(chǎn)生一定的影響。飼料維生素D3含量對仿刺參腸道蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶活力無顯著性影響，但是適量的維生素D3能夠提高機體的抗氧化能力。