趙 慶 吳 彪 劉志鴻 孫秀俊 周麗青 楊?lèi)?ài)國(guó) 張高偉

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；3.水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 上海海洋大學(xué) 上海 201306)

血紅蛋白(Hemoglobin)為呼吸蛋白中的一員，廣 泛存在于脊椎動(dòng)物、部分無(wú)脊椎動(dòng)物以及一些高等植物、少數(shù)真菌和細(xì)菌中(汪青等, 2011)。血紅蛋白的主要功能是參與運(yùn)輸和存儲(chǔ) O2，但隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)不同物種血紅蛋白的結(jié)構(gòu)存在一定差異，尤其是在無(wú)脊椎動(dòng)物中其保守性較低，這為其新功能的獲得提供了基礎(chǔ)(葉水英等, 2008)。報(bào)道顯示，血紅蛋白是一種多功能蛋白，除攜氧功能外，還具有儲(chǔ)存能量、維持滲透壓、維持血壓和抗菌等多種功能(Brittain, 2002； Katoet al, 2017； Wanget al, 2013；齊小瓊等, 2014)。例如，人血紅蛋白可以吸收肺中的NO，釋放到血液中，從而調(diào)節(jié)NO濃度(Dattaet al,2004)，海洋蠕蟲(chóng)(Arenicola marina)的血紅蛋白能參與體液酸堿平衡的調(diào)節(jié)(Toulmond, 1973)。軟體動(dòng)物血紅蛋白的免疫活性也受到重視，王素芳等(2014)純化得到了泥蚶(Tegillarca granosa)的血紅蛋白，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其具有過(guò)氧化物酶活性，還具有抗惡臭假單胞桿菌(Pseudomonas putida)活性；荊昭(2011)研究發(fā)現(xiàn)，毛蚶(Scapharca kagoshimensis)的血紅蛋白能殺滅金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)和四聯(lián)微球菌(Micrococcus tetragenus)等多種細(xì)菌。

魁蚶(Scapharca broughtonii)是我國(guó)重要的大型經(jīng)濟(jì)蚶類(lèi)，生活于潮間帶至數(shù)十米的淺海區(qū)，以軟泥和泥沙質(zhì)海底常見(jiàn)，在我國(guó)主要分布于黃、渤海，東海少見(jiàn)(張素萍, 2008)?？揽鼓嫘暂^強(qiáng)，對(duì)低鹽、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)等脅迫都具有一定的耐受能力(張廣明等, 2017； Zhenget al, 2015)，可能與其血淋巴成分有關(guān)，但相關(guān)方面的研究報(bào)道十分有限。與其他多數(shù)雙殼貝類(lèi)不同，魁蚶血液呈鮮紅色。周麗青等(2013、2014)將魁蚶血細(xì)胞劃分為三類(lèi)，即紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血栓細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞對(duì)病原體有被動(dòng)吞噬和免疫吸附作用。蚶科貝類(lèi)的血紅蛋白基因已經(jīng)在泥蚶(Baoet al, 2013)和毛蚶(荊昭, 2011)中克隆獲得，相關(guān)功能方面的初步研究也已開(kāi)展。

為更好地了解魁蚶血紅蛋白基因結(jié)構(gòu)、時(shí)空分布特征以及在脅迫后的表達(dá)變化，本研究擬克隆獲得魁蚶血紅蛋白基因，并分別研究該基因在 mRNA水平上的變化特征，以期為魁蚶血紅蛋白相關(guān)功能的研究積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與來(lái)源

實(shí)驗(yàn)魁蚶采自山東省萊州海區(qū)，選取殼長(zhǎng)為40 mm左右的活力強(qiáng)的個(gè)體，將其表面的泥沙洗刷干凈，低溫運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，于20℃充氣海水中暫養(yǎng)7 d，每天換水2次，每次換水1/2，每4 h投喂小新月菱形藻(Nitzschia clostertum)等單胞藻1次；實(shí)驗(yàn)幼蟲(chóng)取自山東省萊州育苗場(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)處理及實(shí)驗(yàn)組織獲得

鰻弧菌刺激實(shí)驗(yàn)：將魁蚶隨機(jī)分為鰻弧菌處理組、PBS組和對(duì)照組3組，每組40個(gè)體。鰻弧菌為本實(shí)驗(yàn)室保存的菌種，用2216E培養(yǎng)基復(fù)蘇，離心棄上清液，用PBS稀釋至OD600nm=0.4 (1 OD=5×108cells/ml)。鰻弧菌處理組是向魁蚶閉殼肌中注射50 μl菌懸液，PBS組注射50 μl滅菌PBS，對(duì)照組不進(jìn)行任何處理。分別于0、2、4、8、16、24、32和64 h隨機(jī)選取3個(gè)個(gè)體抽取血淋巴，離心(4℃, 800 r/min, 15 min)收集血細(xì)胞，用于總RNA提取。

低氧脅迫處理：通過(guò)調(diào)節(jié)氮?dú)夂涂諝獾某錃馑俣瓤刂坪Ｋ芙庋?DO)濃度，實(shí)驗(yàn)共設(shè)4個(gè)DO濃度梯度，分別為0.5、2.5、4.5和7.5 mg/L (對(duì)照組)，處理0、2、4、8、16、24、32和64 h后，在每組中隨機(jī)取3個(gè)魁蚶血淋巴，離心收集血細(xì)胞。

取對(duì)照組魁蚶的外套膜、閉殼肌、鰓、肝胰腺、血淋巴和斧足等組織存于液氮中，用于基因克隆和組織表達(dá)分析。為獲得發(fā)育同步性高的魁蚶幼蟲(chóng)，在魁蚶育苗場(chǎng)構(gòu)建5個(gè)魁蚶家系，利用篩絹分別富集0、1、2、3、12、16、18、28 h 及 2、3、5、6、8、9、10、11、12、13、23 d的幼蟲(chóng)，保存于液氮中。

1.3 基因克隆與序列分析

1.3.1 總RNA提取與cDNA合成 RNA提取參照孫杰等(2010)的方法進(jìn)行。主要步驟：將組織樣品在液氮中研磨，Trizol處理10 min，加入氯仿抽提蛋白質(zhì)，然后再利用異丙醇沉淀 RNA，用 75%乙醇洗凈異丙醇后，室溫干燥，DEPC水溶解RNA。采用分光光度計(jì)(A260nm/A280nm)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量、純度和完整性。采用 PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(TaKaRa)，按照說(shuō)明書(shū)操作步驟合成cDNA第一鏈，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)合成cDNA，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)，置于-20℃中備用。

1.3.2SbHbI基因克隆 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列，利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)特異性引物SbHbI-F和SbHbI-R，擴(kuò)增驗(yàn)證SbHbIcDNA的中間片段。使用 RACE試劑盒(Clontech)進(jìn)行RACE擴(kuò)增，拼接擴(kuò)增序列獲得基因cDNA全長(zhǎng)。根據(jù)擴(kuò)增出的中間片段設(shè)計(jì)5'RACE(5Hb-R1和5Hb-R2)和3'RACE(3Hb-F1和3Hb-F2)引物，進(jìn)行巢式擴(kuò)增。第一輪使用試劑盒中的UPM和5Hb-R1與3Hb-F1進(jìn)行擴(kuò)增，以第一輪的擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋30倍為模板，以NUP和5Hb-R2與3Hb-F2進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：94℃ 30 s，72℃ 1 min，5個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 1 min，5 個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，68℃30 s，72℃ 1 min，25個(gè)循環(huán)；4℃保存。所用引物見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列Tab.1 The primers used in this experiment

2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，切膠回收目的條帶，連接T載體并轉(zhuǎn)化至克隆菌，挑取陽(yáng)性單克隆菌株，測(cè)序驗(yàn)證。

1.3.3 序列分析 用 DNAstar軟件對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行拼接，獲得完整cDNA序列，查找ORF并翻譯成氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量及等電點(diǎn)；利用Interproscan和 Smart 在 線軟件(http：//www.ebi.ac.uk/interpro/和http：//smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)編碼蛋白的功能域；用 TMHMM、SingalP3.0Server (http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/和 http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)等在線軟件分析蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)信號(hào)肽。經(jīng)Blast(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查找同源序列，利用ClustalX和DNAman軟件進(jìn)行多序列同源比對(duì)，利用Mega 6.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)中的Poisson model模型構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4 qRT-PCR分析

設(shè)計(jì)特異性引物qHb-F和qHb-R，以稀釋15倍的cDNA為模板進(jìn)行定量擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)用β-actin作為內(nèi)參基因(引物序列見(jiàn)表1)。反應(yīng)體系：Taq酶10 μl，正反向引物各 0.8 μl，ROX Reference DyeⅡ0.4 μl，模板 2 μl，ddH2O 6 μl。反應(yīng)程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40 個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃15 s。每個(gè)樣品設(shè)置 3個(gè)重復(fù)，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)和 Duncan多重比較(P＜0.05)。利用GraphPad prism軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 基因cDNA序列分析

將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接、比對(duì)，最終得到血紅蛋白基因的cDNA全長(zhǎng)序列(命名為SbHbI，GenBank登錄號(hào)為MF370202)，序列信息如圖1所示?；騝DNA全長(zhǎng)為867 bp，包括177 bp的 5'-UTR、206 bp的3'-UTR和483 bp的ORF，ORF編碼160個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)蛋白分子量為17.5 kDa，理論等電點(diǎn)為9.68。3'-UTR近poly A附近具有加尾信號(hào)序列(AATAAA)。軟件預(yù)測(cè)SbHbI編碼的蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽，但存在血紅素結(jié)合位點(diǎn)，位點(diǎn)分別在第61、62、80、83、84、108、111、112、117、121、122 和 125氨基酸處。

2.2 SbHbI的同源性分析

NCBI在線比對(duì)結(jié)果顯示，SbHbI編碼的氨基酸序列與其他物種血紅蛋白編碼氨基酸序列具有不同程度的相似度，其中，與毛蚶相似度為93%，與泥蚶的相似度為84%，與人血紅蛋白的相似度為70%，氨基酸序列比對(duì)信息如圖2所示。

在 GenBank上搜索選取了具有代表性物種的血紅蛋白序列，使用Mega 6.0構(gòu)建的NJ進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，屬于古菌域的產(chǎn)氣莢膜梭菌(Halophilic archaeon)、植物中的馬鈴薯(Rattus norvegicus)和棘皮動(dòng)物中的近輻蛇尾(Ophiactis simplex)產(chǎn)生分支，與其他物種距離較遠(yuǎn)。之后主要分為兩大支，脊索動(dòng)物聚為一支，無(wú)脊索動(dòng)物、真菌和細(xì)菌聚為一支。本研究中的魁蚶先與毛蚶聚為一支，再依次與不等殼毛蚶(S.inaequivalvis)、泥蚶聚在一起。

2.3 SbHbI組織表達(dá)分析

圖1 SbHbI核苷酸序列及編碼氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of SbHbI

通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)SbHbI基因在鰓、血淋巴、外套膜、斧足、閉殼肌和肝胰腺等6個(gè)組織中的表達(dá)情況(圖4)。從圖4可以看出，在6個(gè)組織中均能檢測(cè)到SbHbI基因的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)。SbHbI在血淋巴中的表達(dá)量最高，與其他5個(gè)組織存在顯著差異(P＜0.05)，而這5個(gè)組織中SbHbI的表達(dá)量差異不顯著(P＞0.05)。

2.4 SbHbI在幼蟲(chóng)不同發(fā)育階段的表達(dá)分析

SbHbI在幼蟲(chóng)不同發(fā)育階段的表達(dá)特征見(jiàn)圖5。從圖5可知，卵細(xì)胞至發(fā)育11 d時(shí)，幼蟲(chóng)的SbHbI表達(dá)量雖有變化，但差異不顯著；幼蟲(chóng)發(fā)育2 d以后，SbHbI有上調(diào)趨勢(shì)，幼蟲(chóng)發(fā)育至12 d時(shí)，其表達(dá)量顯著高于1/2 d時(shí)的參照值(P＜0.05)，同時(shí)也達(dá)到了所有檢測(cè)階段的最高值，為對(duì)照組的200多倍。12～13 d時(shí)，SbHbI表達(dá)量沒(méi)有顯著差異。相對(duì)于12～13 d時(shí)的表達(dá)量，22 d幼蟲(chóng)體內(nèi)SbHbI的表達(dá)量顯著下降，約為參照值的161倍(P＜0.05)。在整個(gè)檢測(cè)階段中，SbHbI的表達(dá)量呈先升高再降低的趨勢(shì)。

2.5 SbHbI在低氧脅迫和鰻弧菌刺激后的表達(dá)分析

低氧脅迫和鰻弧菌刺激后，SbHbI的表達(dá)變化見(jiàn)圖6。圖6A顯示，在DO值為7.5 mg/L的對(duì)照組中，SbHbI的表達(dá)比較穩(wěn)定，沒(méi)有顯著變化。低氧脅迫使各處理組SbHbI具有相似的變化趨勢(shì)，基本表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢(shì)。低氧脅迫2 h時(shí)，4.5、2.5和0.5 mg/L 3個(gè)處理組血淋巴中的SbHbI出現(xiàn)下降，均低于0 h的表達(dá)量，但未到達(dá)顯著水平。低氧脅迫8 h時(shí)，3個(gè)處理組SbHbI表達(dá)量顯著高于2 h。低氧脅迫16 h時(shí)，各組均急劇升高達(dá)到峰值，4.5、2.5和 0.5 mg/L組的表達(dá)量分別是 7.5 mg/L組的11.1倍、7倍和6.45倍，且與其他相同處理組所有時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量存在顯著差異(P＜0.05)。低氧脅迫24 h時(shí)，SbHbI表達(dá)量開(kāi)始下降，至32 h時(shí)基本恢復(fù)至對(duì)照組水平。鰻弧菌刺激后，SbHbI在血細(xì)胞中的表達(dá)變化趨勢(shì)基本與低氧脅迫一致，也是在16 h時(shí)急劇上升，之后顯著下降(圖6B)。

3 討論

圖2 不同物種血紅蛋白氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Multiple sequence alignment of SbHbIwith other hemoglobin amino acid sequences

圖3 NJ法構(gòu)建的血紅蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 The phylogenetic tree based on the sequences of different hemoglobin family members

圖4 SbHbImRNA在不同組織中的表達(dá)水平Fig.4 Relative expression level of SbHbImRNA in different tissues of S.broughtonii

圖5 SbHbImRNA在幼蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)間的表達(dá)水平Fig.5 Relative expression level of SbHbImRNA in different developmental time of larvae

魁蚶血液呈紅色是一種十分有趣的現(xiàn)象，其原因是血細(xì)胞中含有紅細(xì)胞。Zhou等(2017)報(bào)道，魁蚶紅細(xì)胞具有被動(dòng)吞噬作用和免疫吸附作用，在魁蚶免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。這對(duì)于主要依靠非特異性免疫進(jìn)行機(jī)體免疫保護(hù)的魁蚶來(lái)說(shuō)有重要意義，這也可能是魁蚶具有較強(qiáng)抗逆能力的原因之一。而在紅細(xì)胞中，其主要的功能蛋白是血紅蛋白。在泥蚶、毛蚶等蚶類(lèi)中已克隆獲得血紅蛋白基因，且在同一物種中通常具有多個(gè)類(lèi)型，同時(shí)，免疫相關(guān)的功能研究也已經(jīng)開(kāi)展(Baoet al, 2013)。本研究通過(guò)PCR和RACE技術(shù)克隆獲得了全長(zhǎng)為867 bp的cDNA序列，序列分析和同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)，編碼160個(gè)氨基酸殘基，存在多個(gè)血紅素結(jié)合位點(diǎn)，具有血紅蛋白的特征序列；且與其他物種，尤其毛蚶、泥蚶等近緣物種的血紅蛋白序列具有較高相似度，從而在分子水平上證實(shí)魁蚶中也含有血紅蛋白基因。Bao等(2013)報(bào)道泥蚶血紅蛋白的3個(gè)亞基的基因Tg-HbI、Tg-HbⅡA和Tg-HbⅡB，魁蚶血紅蛋白基因多態(tài)性有待進(jìn)一步研究。

圖6 SbHbImRNA在低氧脅迫和鰻弧菌刺激后的表達(dá)水平Fig.6 Relative expression level of SbHbImRNA in haemocytes after hypoxia stress and V.anguillarum stimulation

本研究中，在所收集的鰓、肝胰腺、斧足、外套膜、閉殼肌和血淋巴6個(gè)組織中均檢測(cè)到了血紅蛋白的轉(zhuǎn)錄本，但血淋巴中的表達(dá)量顯著高于其他5個(gè)組織，是閉殼肌中的160多倍，且其他5個(gè)組織之間表達(dá)量沒(méi)有顯著差異。汪青等(2012)發(fā)現(xiàn)，泥蚶血紅蛋白基因Tg-HbⅡ也在血液中表達(dá)量最高，其他組織相對(duì)較低。所以，在5個(gè)表達(dá)量較低的組織中檢測(cè)到的血紅蛋白，或許是由于魁蚶開(kāi)放式循環(huán)方式而導(dǎo)致的血淋巴“污染”。在幼蟲(chóng)不同發(fā)育階段的表達(dá)結(jié)果表明，SbHbI在mRNA水平上具有母源傳遞特性，而且可能在擔(dān)輪幼蟲(chóng)期開(kāi)始自身合成，在殼頂幼蟲(chóng)期(本研究中12 d時(shí))其合成系統(tǒng)相對(duì)完善，合成能力顯著提升。這與吳彪等(2017)、岳峰(2013)分別報(bào)道的魁蚶大防御素和扇貝的幾種免疫分子的母源傳遞及免疫因子合成規(guī)律相似。

本研究中，低氧脅迫后，3個(gè)處理水平組的血淋巴中SbHbI的表達(dá)模式基本一致，呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)，16 h表達(dá)量最高。在機(jī)體缺氧時(shí)，血紅蛋白能夠釋放所結(jié)合的氧氣供組織生命活動(dòng)所需，而缺氧時(shí)，機(jī)體對(duì)氧氣的需求有賴(lài)于紅細(xì)胞數(shù)量的增加。這說(shuō)明在機(jī)體感受低氧環(huán)境后，SbHbI的上調(diào)表達(dá)可能是紅細(xì)胞需求增加的體現(xiàn)。而在多數(shù)的同一時(shí)間點(diǎn)，4.5 mg/L組SbHbI的響應(yīng)要比其他2個(gè)處理組更靈敏，這可能是因?yàn)檫^(guò)低的溶氧已對(duì)魁蚶的正常生理活動(dòng)產(chǎn)生較大影響。結(jié)合鰻弧菌刺激后SbHbI的表達(dá)看，發(fā)現(xiàn)SbHbI的表達(dá)變化趨勢(shì)與鄭利兵等(2015)、黃永歡等(2016)和沈淑芳等(2018)報(bào)道的半乳糖凝集素、過(guò)氧化氫酶和C型凝集素免疫因子經(jīng)鰻弧菌刺激后的變化趨勢(shì)相近。因此，推斷SbHbI在免疫反應(yīng)過(guò)程中也發(fā)揮作用，為一種免疫相關(guān)因子。

目前，魁蚶免疫因子基因克隆及功能的相關(guān)研究已經(jīng)有大防御素(Liet al, 2012)、錳超氧化物歧化酶(Zhenget al, 2015)和鐵蛋白(Zhenget al, 2016)等多個(gè)報(bào)道。而血紅蛋白作為魁蚶血淋巴中極為重要的成分，在機(jī)體的生命活動(dòng)中發(fā)揮重要生物學(xué)功能，仍需深入研究。本研究初步揭示了魁蚶血紅蛋白I基因的結(jié)構(gòu)特征和表達(dá)模式，為魁蚶血紅蛋白后續(xù)的功能研究提供了參考資料。