董麗君 羅 坤 曹家旺 陳寶龍 欒 生 曹寶祥 隋 娟 孟憲紅①

(1.農業(yè)農村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 中國水產科學研究院黃海水產研究所 青島 266071；2.青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產出過程功能實驗室 青島 266071；3.上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306)

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)，俗稱南美白對蝦，原產于太平洋西岸水域秘魯北部至墨西哥桑諾拉一帶，具有營養(yǎng)價值高、生長迅速、抗逆性強等優(yōu)點。自1988年由中科院海洋所的張偉權教授從美國引進中國并突破人工繁育技術，1999年從美國夏威夷海洋研究所引進SPF (無特定病原)親蝦后，其養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖產量逐年擴大(張偉權, 1990； 王興強等,2004)。2016年凡納濱對蝦海水養(yǎng)殖產量達93萬t，較 2015年增長 2%，占我國對蝦海水養(yǎng)殖總產量的70%以上，成為我國對蝦養(yǎng)殖產量最多的種類之一(農業(yè)部漁業(yè)漁政管理局, 2017)。但由于種源受控于其原產地國，國內苗種質量參差不齊，且養(yǎng)殖環(huán)境惡化、各種疾病頻發(fā)，極大地限制了凡納濱對蝦養(yǎng)殖業(yè)健康快速發(fā)展。1992年，白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)在臺灣地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)，然后迅速遍布亞洲、歐洲等全球對蝦養(yǎng)殖區(qū)域，迄今依然是影響對蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要因素(Hassonet al,2006； Nakanoet al, 1994)。WSSV不僅具有高致死率，且感染宿主范圍非常廣，除感染凡納濱對蝦、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)等甲殼類動物(閆冬春, 2007；何培民等, 2016)，還可以寄生在養(yǎng)殖池內的底棲橈足類動物、微藻和輪蟲中，并以此為媒介進行傳播，感染養(yǎng)殖動物(劉萍等, 2000； 戴俊逸等, 2013)，大大增加了預防和控制白斑綜合征的難度，極大限制了對蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

目前，我國進口凡納濱對蝦種源來自如夏威夷海洋研究所、美國邁阿密對蝦改良系統(tǒng)公司(SIS)、正大、普利茂、科拿灣等10余家國外公司(鄧濤等, 2013)。此外，我國科研工作者自主選育且經全國水產原種和良種審定委員會審定的凡納濱對蝦新品種有7個，分別是“科海1號”、“中科1號”、“中興1號”、“桂海1號”、“壬海1號”、“廣泰1號”和“海興農2號”，也分別在國內市場上占有一定份額。但市場上各商業(yè)苗種質量參差不齊，如是否攜帶多種病原、抗WSSV性能及生長狀況等也鮮見報道。

以市場上常見的 6個品牌凡納濱對蝦商業(yè)苗種(分別簡稱為海南Z、海南S、廣州P、廣州Z、黃驊R和東營M)為研究對象，其中的廣州P以其抗病性強而著稱(呂華當, 2016)。首先，對 WSSV、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)、蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)、致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌(Acute hepatopancreatic necrosis disease causing-Vibrio parahaemolyticus, VPAHPND)、桃拉綜合征病毒(Taura syndrome virus, TSV)、黃頭病毒(Yellow head virus, YHV)、傳染性肌肉壞死病毒(Infectious myonecrosis virus, IMNV)以及偷死野田村病毒(Covert mortality nodavirus, CMNV) 8種病原進行檢測，確定對蝦體內是否攜帶病原及攜帶病原種類，從而排除各對蝦苗種體內原有病原對實驗結果的影響。然后，進行 WSSV人工感染實驗，評估凡納濱對蝦各商業(yè)苗種的抗 WSSV性能。本研究可為凡納濱對蝦抗病品種選育提供基礎信息。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2016年 8月，本研究在中國水產科學院黃海水產研究所對蝦性狀測試車間內進行。選購海南Z、海南S、廣州P、廣州Z、黃驊R、東營M共6個品牌凡納濱對蝦商業(yè)苗種的18個家系為實驗材料進行病原檢測。同一來源苗種的不同家系混養(yǎng)后，隨機選若干尾進行WSSV人工感染實驗，其平均體重為(0.49±0.29) g。

1.2 病原檢測

針對6種凡納濱對蝦商業(yè)苗種的18個家系，從每個家系隨機取15尾蝦混成1個樣品。其中，WSSV、IHHNV、TSV、YHV、IMNV和VPAHPND6種病原檢測所用引物和檢測方法參考《水生動物疾病診斷手冊》(世界動物衛(wèi)生組織, 2017)，EHP和CMNV則分別參照Jaroenlak等(2016)、劉珍等(2016)和Zhang等(2014)的方法，引物序列見表1。TSV檢測方法為常規(guī)PCR，而其他7種病原均利用巢式PCR檢測。TSV、YHV、IMNV及CMNV屬于RNA病毒，進行病原檢測前需反轉錄成 cDNA，再進行 PCR檢測(劉飛等,2014)。

1.3 材料暫養(yǎng)

將6個商業(yè)苗種共計717個個體分別置于81 cm×59 cm×51 cm的整理箱中，不斷充氣，暫養(yǎng)4 d，每個苗種設置3個平行組和1個對照組。每天早、中、晚各投喂 1次人工配合飼料，投喂量為對蝦體重的3%～5%，排污換水各1次/天，換水量為30%～50%。養(yǎng)殖用水為砂濾自然海水，鹽度為 30±1，實驗期間水溫維持在(27±2)℃。

1.4 制備毒餌

取感染 WSSV的瀕死對蝦的肌肉，放入組織勻漿機中打碎；利用實時熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測肌肉組織中的 WSSV病毒拷貝數(shù)，測得病毒載量為1×107copies/ng。參照孟憲紅等(2013)的方法制備毒餌，將制好的毒餌放入-80℃冰箱保存待用。

1.5 WSSV感染

本研究采用單尾定量口飼感染 WSSV的方法(馮亞萍等, 2017)，感染前2 h不投喂，實驗組每尾蝦投喂約 10 mg毒餌，觀察其完全攝食后放回原整理箱。對照組正常投喂配合飼料，不感染W(wǎng)SSV。感染結束后，每天正常投喂、吸污和換水并觀察對蝦死亡情況。從出現(xiàn)第1尾因感染W(wǎng)SSV死亡的個體開始，每隔2 h撈取死蝦，并分別記錄死亡時間和體重，直至第10天實驗結束。

表1 病原檢測所用引物序列Tab.1 Sequences of PCR primers for pathogen detection

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007和Origin 9.0統(tǒng)計凡納濱對蝦各商業(yè)苗種感染 WSSV后的平均存活時間，并做累積死亡率折線圖。采用SPSS 19.0軟件對平均存活時間做單因素方差分析(One-way ANOVA)，對有顯著性差異的苗種再作Tukey HSD多重比較分析。

2 結果

2.1 病原檢測

本研究對6個對蝦商業(yè)苗種的8種病原檢測結果見表2。各品牌的商業(yè)苗種都不攜帶WSSV、IHHNV、TSV、VPAHPND、YHV、IMNV這 6種病原，但在黃驊R、廣州Z和海南Z的所有家系以及廣州P的F13、F14、F16家系中均檢測出 EHP，東營 M、海南 S、黃驊R和廣州Z的部分家系中檢測出CMNV。

2.2 存活時間比較

6個品牌凡納濱對蝦商業(yè)苗種未感染W(wǎng)SSV的對照組存活率接近100%，感染W(wǎng)SSV的實驗組存活時間如表3所示。東營M在感染W(wǎng)SSV后第12小時首先出現(xiàn)死亡個體，廣州Z和黃驊R在感染后第22小時開始死亡，而海南Z在感染后第68小時才開始死亡，比東營M整整晚了56 h。比較各商業(yè)苗種感染W(wǎng)SSV后的平均存活時間發(fā)現(xiàn)，海南Z平均存活時間最長(150.18±25.92) h，其次是廣州 P(122.32±43.59) h，平均存活時間最短的是東營M(71.70±23.79) h。6個品牌凡納濱對蝦商業(yè)苗種感染 WSSV后存活時間的差異顯著性見表4。海南Z顯著高于其他5個苗種，廣州P顯著低于海南Z、但極顯著高于其他4個苗種，東營M極顯著低于其他5個苗種，廣州Z、海南S、黃驊R三者間無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 累積死亡率和存活率比較

統(tǒng)計 6個品牌凡納濱對蝦商業(yè)苗種感染 WSSV后不同時間點的累積死亡率(圖 1)。東營 M 從感染W(wǎng)SSV后第1天死亡率就急劇上升，并在第4天到達死亡高峰，直至第6天死亡速度開始減緩。海南Z在感染W(wǎng)SSV后前4 d死亡率一直維持在低水平，直至第6天累積死亡率迅速增加，第6～7天為死亡高峰期，到第8天時，累積死亡率基本不變，死亡速度減緩。海南 Z感染 WSSV后的死亡高峰期比東營 M晚了2～3 d。感染 WSSV后的第 5天，海南 Z、海南 S、廣州P、廣州Z、黃驊R、東營M累積死亡率分別為1.7%、23.9%、11.8%、25.6%、46.0%和 57.7%，第10天(實驗結束)的累積死亡率依次為27.5%、31.6%、27.5%、30.8%、61.3%和 60.4%。實驗結束后，海南Z、海南S、廣州P、廣州Z、黃驊R、東營M的存活率分別為 72.5%、68.4%、72.5%、69.2%、38.7%和39.6%、。其中，廣州P和海南Z的存活率最高，黃驊R和東營M存活率最低。

表2 凡納濱對蝦病原檢測結果Tab.2 Results of pathogen detection of L.vannamei

表3 凡納濱對蝦感染W(wǎng)SSV后的存活時間Tab.3 Survival time of L.vannamei after infected by WSSV

表4 凡納濱對蝦存活時間的差異顯著性Tab.4 Significant differences on survival time of L.vannamei

圖1 凡納濱對蝦感染W(wǎng)SSV后累積死亡率Fig.1 Cumulative mortality of L.vannamei after infected by WSSV

3 討論

本研究利用巢式 PCR與普通 PCR相結合的方法，對世界動物衛(wèi)生組織(OIE)指定的 8種病原進行檢測。結果顯示，6個商業(yè)苗種都不攜帶WSSV，從而確保了抗 WSSV性狀測試結果的可信度。但除東營M外，其他5個來源苗種的EHP均檢測為陽性。EHP能夠限制對蝦的生長速度，導致對蝦大小參差不齊，養(yǎng)殖中可通過控制養(yǎng)殖密度和鹽度來抵御該病原體(Tanget al, 2015； 劉雅梅等, 2017)。在東營M、黃驊R、廣州Z、海南S的部分家系中檢測到CMNV。CMNV是一種可引發(fā)對蝦“偷死病”的病原，其潛伏周期長且發(fā)病緩慢。發(fā)病前期對蝦僅有少量死亡，無明顯癥狀，后期死亡數(shù)量隨養(yǎng)殖時間緩慢增多，所以，在養(yǎng)殖過程中要時刻注意及時撈取死蝦避免污染水質(Pooljunet al, 2016)。雖然，6個苗種的部分家系中檢測出EHP和CMNV，但根據(jù)對照組的死亡情況推測，它們仍處于潛伏期不會影響 WSSV感染實驗結果(Zhanget al, 2017)。目前，由于養(yǎng)殖環(huán)境惡化，水體內有害病原種類繁多，對蝦發(fā)病不再是由單一病原引起，導致疾病防治更加困難(黃志堅等, 2016)。故選育抗病性強的對蝦新品種，是防治有害病原蔓延和減少養(yǎng)殖戶經濟損失的有效辦法之一。

自1993年對蝦養(yǎng)殖業(yè)遭受WSSV暴發(fā)性流行侵襲以來，很多科研團隊陸續(xù)開展了對蝦抗 WSSV家系選育工作。孔杰等(2012)以生長速度、抗WSSV能力和養(yǎng)殖存活率為目標性狀，選育的中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)新品種“黃海2號”已于2009年通過全國水產原良種委員會審定。美國PRIMO公司(2016)培育的高抗病凡納濱對蝦蝦苗“普利茂”，于2015年進入中國市場，目前市場反響良好。黃永春等(2013)發(fā)現(xiàn)，經過連續(xù)多代凡納濱對蝦抗WSSV家系選育，對蝦抗病性狀逐代增強，這充分證明了家系選育的可行性。王成桂等(2015)綜合分析了5個抗WSSV家系的生長、耐鹽、耐氨氮、亞硝酸鹽以及抗 WSSV性狀的差異，并篩選出綜合性狀比較突出的家系作為以后抗WSSV家系選擇的基礎群體。本研究則在已有研究成果的基礎上，設計實驗篩選抗WSSV性能好的凡納濱對蝦商業(yè)苗種，為凡納濱對蝦抗病選育提供基礎數(shù)據(jù)。

目前，國內市場上的對蝦商業(yè)苗種質量良莠不齊，因此，對新苗種進行性能測定與評估具有重要意義。柴展等(2015)評估了8個中國的凡納濱對蝦群體家系間出肉率的差異，魏琳等(2016)比較了在低氧條件下 2個凡納濱對蝦品系的線粒體超微結構，Li等(2015)對凡納濱對蝦各家系的耐低溫性狀遺傳參數(shù)進行了評估。本研究通過對6種凡納濱對蝦商業(yè)苗種喂食相同劑量(1×107copies/ng)的WSSV，并比較分析其感染 WSSV后的平均存活時間和累積死亡率，來評估 6個凡納濱對蝦商業(yè)苗種的抗WSSV性能。結果顯示，海南Z和廣州P的WSSV抗性在6個苗種中最強。其中，廣州P是經過多年抗病選育出來的新苗種，與呂華當(2016)的研究結果是一致的?？剐赃x擇育種是一個復雜的工程，本研究僅對6個商業(yè)苗種的某一子代進行選育，只能為進一步開展凡納濱對蝦抗病品種選育提供基礎數(shù)據(jù)。培育抗病新品種還需要進一步深入開展多代選育，并了解其遺傳背景及綜合評估與生長、繁殖等性狀的相關性。