黃鎮(zhèn)宇 章 群 盧麗鋒 周 琪 唐楚林

(暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系 廣州 510632)

遺傳多樣性是物種生存與進(jìn)化的物質(zhì)基礎(chǔ)，開展魚類遺傳多樣性研究可以為遺傳育種和種質(zhì)資源保護(hù)提供重要參考(Ward,2000)。動(dòng)物線粒體屬于母系遺傳，無遺傳物質(zhì)的重組，且其進(jìn)化速度比核基因快，較少的樣本就可較好地反映該種群的遺傳結(jié)構(gòu)，是動(dòng)物遺傳多樣性研究中理想的分子標(biāo)記(Xuet al,2014)。而且，動(dòng)物線粒體的COI序列具有一定的進(jìn)化變異，可以較好地反映同種生物的不同群體間的遺傳差異，除了被廣泛應(yīng)用于DNA條形碼的研究中，也適用于遺傳多樣性的分析研究(柳淑芳等, 2016;Changet al, 2016; Xuet al, 2012; 李大命等, 2017)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集、匹配引物、測(cè)序

1.2 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用MEGA 7.0(Kumaret al, 2016)對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行人工校對(duì)，并計(jì)算堿基組成、顛換率。通過DnaSP 5.10計(jì)算單倍型數(shù)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(π) (Libradoet al, 2009)。使用 Network (Bandeltet al,1999)分析單倍型的分布情況，通過Arlequin 3.5進(jìn)行AMOVA 分析、核苷酸錯(cuò)配分析、Tajima’sD和 Fu’sFs中性檢驗(yàn)，計(jì)算群組間的Fst值、SSD值、Rg值、τ值等參數(shù)(Excoffieret al, 2010)。運(yùn)用SAMOVA 2.0進(jìn)行空間分子變異分析。根據(jù)公式[T=(τ/2μk)×代時(shí)]計(jì)算種群擴(kuò)張時(shí)間，其中，τ、μ、k、T依次代表種群擴(kuò)張時(shí)間參數(shù)、序列的變異速率[線粒體COI基因進(jìn)化速率為(1%～3%)/百萬(wàn)年(Wanget al, 2013)]、序列長(zhǎng)度以及種群擴(kuò)張時(shí)間(Rogerset al, 1992)。是屬的代表性魚類，個(gè)體較大，與前鱗的生態(tài)習(xí)性相近，其性成熟需要 2～3年(石瓊等, 2015)。大多數(shù)魚類因性成熟而迎來個(gè)體生長(zhǎng)的停滯(錢國(guó)英, 2000)，同屬的前鱗個(gè)體較小，故其性成熟所需時(shí)間可能短于魚，但目前尚沒有確切時(shí)間的報(bào)道，估算其大概為1～3年，即公式中的代時(shí)取值為1～3。

1.3 中國(guó)前鱗群體劃分

2 結(jié)果與分析

2.1 前鱗線粒體COI序列特征和遺傳多樣性

在全長(zhǎng)為712 bp的序列中，沒有發(fā)現(xiàn)堿基的插入和缺失，堿基A、T、C和G的含量分別為23.5%、29.4%、28.8%和18.3%，A+T含量(52.9%)略高于C+G含量(47.1%)，與其他硬骨魚類COI序列堿基組成特征基本一致。其中，共有 18個(gè)多態(tài)位點(diǎn)、6個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，顛換與轉(zhuǎn)換的比值為 4.7，表明序列的突變尚未達(dá)到飽和，適合進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(Kumar,2005)。此外，還發(fā)現(xiàn)21個(gè)單倍型，總體遺傳多樣性偏低(Hd=0.4840±0.0700，π=0.0010±0.0002)，其中，洞頭群體最高，岱山群體最低，東海群體的遺傳多樣性高于南海群體，具體的遺傳多樣性情況見表1。

單倍型最大簡(jiǎn)約性網(wǎng)絡(luò)圖(圖 1)呈現(xiàn)星狀結(jié)構(gòu)，其中，Hap1的數(shù)量最多(59)，由全部群體共享。Hap3的數(shù)量為3，由東興群體與平潭群體共享。Hap11的數(shù)量為2，由平潭群體與洞頭群體共享，其余均為各個(gè)群體特有的單倍型。也就是說，不同地理來源的個(gè)體相互聚集分布，不同的地區(qū)中存在相同的單倍型，表明前鱗在中國(guó)沿海范圍內(nèi)沒有明顯的地理聚群。

在AMOVA分析(表2)中，按照上文的群體劃分進(jìn)行分析：東興、平潭、閘坡、廣東、洞頭等5個(gè)群體間的Fst=-0.0221～0.0141(P>0.05)，組間的遺傳變異比例達(dá)-0.26%。東海群體與南海群體間的Fst= 0.0020(P>0.05)，組間的遺傳變異比例達(dá) 0.46%。東興、廣東、東海3個(gè)群體間的Fst= -0.0159～0.0141 (P>0.05)，組間的遺傳變異比例為-0.6%。上述各類劃分中，群體間的Fst值皆小于 0.05，均表現(xiàn)出不顯著水平(P>0.05)，且組間的遺傳變異比例均屬于極低水平，表明中國(guó)前鱗群體在各個(gè)地區(qū)、海域、海峽間沒有明顯的遺傳分化，遺傳變異主要集中在群體中的個(gè)體間。而 SAMOVA分析(表 2)中，82條序列被軟件自動(dòng)劃分為2組，即洞頭群體獨(dú)立歸為1組，其余群體為1組，測(cè)得組間的變異比例只有2.87%，同樣表明組間分化程度很低，與Fst及AMOVA分析的結(jié)果相吻合。

表1 中國(guó)沿海前鱗群體的遺傳多樣性Tab.1 Genetic diversity statistics of Liza affinis in coastal waters of China

群體所處的地理位置Region of population數(shù)量Size變異位點(diǎn)數(shù)Variable site單倍型數(shù)量Nh單倍型多樣性Hd核苷酸多樣性π岱山 Daishan 10 2 5 0.2000±0.1540 0.0006±0.0004洞頭 Dongtou 13 9 12 0.8080±0.1130 0.0021±0.0006平潭 Pingtan 23 8 10 0.5850±0.1220 0.0013±0.0004吳川,閘坡 Wuchua, Zhapo 10 3 6 0.3780±0.1810 0.0008±0.0005東興 Dongxing 26 4 10 0.3510±0.1170 0.0005±0.0002東海 East China Sea 46 15 23 0.5790±0.0890 0.0014±0.0003南海 South China Sea 36 6 13 0.3540±0.1020 0.0006±0.0002總體 Total 82 18 32 0.4840±0.0700 0.0010±0.0002

圖1 前鱗單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Parsimony network of Liza affinis COIhaplotypes

2.2 前鱗的種群歷史動(dòng)態(tài)

中性檢驗(yàn)的分析結(jié)果(表 3)如下：Tajima’sD方面，洞頭、平潭、廣東、東興4個(gè)群體均為顯著性負(fù)值，其余為非顯著性負(fù)值。Fu’sFs方面，洞頭、廣東、東興3個(gè)群體均呈顯著性負(fù)值，總體也是顯著性負(fù)值(FS=-20.3900，P=0)。Ramos-Onsins ＆ Rozas’sR2檢驗(yàn)的分析顯示(表 3)：R2的范圍是 0.1610～0.1620(P<0.05)，SSD 值(0.0010～0.0220)和Rg值(0.0500～0.7200)均較小，且多數(shù)呈不顯著性(P>0.05)，表明中國(guó)前鱗群體沒有顯著偏離擴(kuò)張模型。此外，核苷酸錯(cuò)配圖(圖 2)呈現(xiàn)明顯單峰、單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(圖 1)的星狀結(jié)構(gòu)與Fu’sFs的顯著性負(fù)值均表明中國(guó)前鱗在近期經(jīng)歷過快速擴(kuò)張，其擴(kuò)張時(shí)間參數(shù)τ為0.6370，計(jì)算出中國(guó)前鱗種群擴(kuò)張大約發(fā)生在13.4199～1.4911萬(wàn)年前，處于晚更新世時(shí)期(劉嘉麒等,1997)。

3 討論

3.1 中國(guó)前鱗的遺傳多樣性

某物種的遺傳多樣性豐富與否和該物種所反映的單倍型多樣性(Hd)及核苷酸多樣性(π)密切相關(guān)(Boninet al, 2010)。該研究中，中國(guó)前鱗的遺傳多樣性(Hd=0.4840±0.0700，π=0.0010±0.0002)呈現(xiàn)出以洞頭(Hd=0.8080±0.1130，π=0.0021±0.0006)為中心向南北逐漸減少的趨勢(shì)，與許則灘(2015)報(bào)道的浙江前鱗遺傳多樣性由南向北遞減的趨勢(shì)相符。但該研究中洞頭群體和岱山群體的遺傳多樣性有別于許則灘(2015)的研究結(jié)果(溫州：Hd=0.6170±0.1350，π=0.0014±0.0004；岱山：Hd=0.3950±0.1280，π=0.0007±0.0003)，可能是由于二者分析的序列長(zhǎng)度及群體中個(gè)體數(shù)量的不同而致[許則灘(2015)研究所采用的序列長(zhǎng)度為623 bp，群體數(shù)量為溫州16，岱山23]。與其他同樣分布在日本南部及中國(guó)臺(tái)灣海域等的魚類基于COI序列的遺傳多樣性相比，中國(guó)前鱗的遺傳多樣性處于較低水平：魚(Miichthys miiuy) (Hd=0.7310±0.0470,π=0.0028±0.0019) (Xuet al, 2014)，黃姑魚 (Nibea albiflora) (Hd=0.6970±0.0023,π=0.0017±0.0002)(Changet al, 2016)，銀鯧(Pampus argenteus)(Hd=0.8010,π=0.0040) (Xuet al, 2012)。此外，東海前

表2 前鱗 種群結(jié)構(gòu)的分子方差分析及SAMOVA分析Tab.2 AMOVA and SAMOVA analysis of Liza affinis

表2 前鱗 種群結(jié)構(gòu)的分子方差分析及SAMOVA分析Tab.2 AMOVA and SAMOVA analysis of Liza affinis

分析方法Method of analysis分組方式Method of grouping 分析參數(shù)Parameter of analysis群組間Among groups群組中群體間Among populations within groups群體內(nèi)部Within populations總體Total AMOVA Group (5個(gè)群體5 populations)自由度 df 4.0000 77.0000 81.0000平方和 Sum of squares 1.4280 28.6450 30.0730變異組成 Variance components 0.0010 0.3720 0.3710 Group1(東海East China Sea)Group2 (南海South China Sea) 變異比例 Percentage of variation 0.4600 –0.5500 100.0900自由度 df 2.0000 2.0000 77.0000 81.0000平方和 Sum of squares 0.6640 0.7640 28.6450 30.0730變異組成 Variance components –0.0022 0.0007 0.3720 0.3704變異比例 Percentage of variation –0.2600 100.2600自由度 df 1.0000 3.0000 77.0000 81.0000平方和 Sum of squares 0.4000 1.0270 28.6450 30.0730變異組成 Variance components 0.0017 0.0021 0.3720 0.3717 SAMOVA Group1(洞頭 Dongtou)Group2(其余4個(gè)群體Other 4 populations)Group1(東興 Dongxing)Group2(吳川 Wuchua閘坡Zhapo) Group3(東海East China Sea) 變異比例 Percentage of variation –0.6000 0.1800 100.4100自由度 df 1.0000 3.0000 77.0000 81.0000平方和 Sum of squares 0.5430 0.8850 28.6450 30.0730變異組成 Variance components 0.0109 –0.0048 0.3720 0.3781變異比例 Percentage of variation 2.8700 –1.2600 98.3800

表3 前鱗的中性檢驗(yàn)、核苷酸不配對(duì)分析Tab.3 Neutrality tests and mismatch analysis of Liza affinis

表3 前鱗的中性檢驗(yàn)、核苷酸不配對(duì)分析Tab.3 Neutrality tests and mismatch analysis of Liza affinis

分析范圍Range analysis群體所處的地理位置Region of population Tajima’s D值(P值)Fu’s Fs值(P值) R2值(P值) SSD值(P值) Rg值(P值)南海South China Sea 東興 Dongxing –1.7070(0.0220) –3.4830(0.0000) 0.1610(0.0000)0.0030(0.3200) 0.1940(0.3800)總體 Total –2.3250(0.0000) –20.3900(0.0000)0.1620(0.0000) 0.0010(0.8600) 0.0840(0.8800)東海East China Sea 平潭 Pingtan –1.8480(0.0110) –6.5790(0.0000) 0.1620(0.0000) 0.0020(0.7500) 0.0500(0.9000)吳川, 閘坡Wuchua, Zhapo –1.5600(0.0400) –0.4590(0.1580) 0.1620(0.0000)0.0040(0.7000) 0.2220(0.7300)岱山 Daishan –1.4000(0.0880) 0.5860(0.4240) 0.1620(0.0000)0.0220(0.0180) 0.7200(0.7200)洞頭 Dongtou –1.8670(0.0090) –4.7410(0.0010) 0.1620(0.0000)0.0070(0.6000) 0.0830(0.5900)

圖 2 前鱗核苷酸錯(cuò)配分析圖Fig.2 Nucleotide mismatch distribution of Liza affinis

3.2 前鱗魚類的遺傳結(jié)構(gòu)和歷史動(dòng)態(tài)

該研究中 AMOVA分析所得的組間變異比例(–0.6%～0.46%)與許則灘(2015)對(duì)浙江沿岸前鱗的研究結(jié)果(0.25%)相似，均屬極低水平。結(jié)合單倍型網(wǎng)絡(luò)圖、群體間Fst值及SAMOVA的分析結(jié)果，可知中國(guó)前鱗群體在各個(gè)地區(qū)、海域、海峽間無明顯的遺傳分化，推測(cè)該現(xiàn)象的形成可能與以下因素有關(guān)：1)頻繁的基因交流。前鱗屬洄游性魚類，可在湖泊和江河索餌場(chǎng)洄游到海中產(chǎn)卵場(chǎng)進(jìn)行繁殖(陸忠康,1985)，所產(chǎn)魚卵主要漂浮在中國(guó)沿岸淺海處，隨洋流漂流。已知冬季黑潮會(huì)把海洋有機(jī)物從菲律賓經(jīng)東海送至中國(guó)大陸沿海，再結(jié)合中國(guó)南海的夏季暖流流向浙江近海，且目前暫無關(guān)于東海及南海的前鱗群體間在繁殖習(xí)性上存在差異的報(bào)道。故中國(guó)前鱗可能受到洄游產(chǎn)卵和海洋洋流的共同影響(Nakajimaet al,2014)，導(dǎo)致分布在不同地理位置的群體間有著頻繁的基因交流，沒有足夠時(shí)間來積累遺傳變異。2)近期種群擴(kuò)張事件。中國(guó)前鱗的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖、Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗(yàn)、核苷酸錯(cuò)配分析等結(jié)果都表明中國(guó)前鱗整體在近期經(jīng)歷過種群的快速擴(kuò)張，估算出其擴(kuò)張大約發(fā)生在13.4199～1.4911萬(wàn)年前，處于晚更新世時(shí)期(劉嘉麒等, 1997)。這一時(shí)期，冰期中海平面的升降造成大部分近海魚類都發(fā)生過種群的快速擴(kuò)張(Niet al, 2014)，推測(cè)中國(guó)前鱗的快速擴(kuò)張可能也與海平面的變化有關(guān)。在距今13.4199～1.4911萬(wàn)年的時(shí)間跨度中，北半球經(jīng)歷了2次冰期及1次間冰期(Stirlinget al, 1995; Winogradet al, 1997)，其交替過程如下：距今約13.4199～13.2000萬(wàn)年前，北半球處于冰期，而在13.2000～11.5000萬(wàn)年前，北半球處于末次間冰期，至11.5000～1.5000萬(wàn)年前，北半球處于末次冰期。冰期中的氣溫很低，中國(guó)大陸出現(xiàn)了大量冰原，中國(guó)沿海的海平面出現(xiàn)明顯的下降(下降幅度最大可達(dá)150 m)，中國(guó)沿海大陸骨架大面積露出(Wang, 1999)，大大壓縮了前鱗的生活空間。而末次間冰期是近15萬(wàn)年來全球最暖的時(shí)期，大陸的冰川開始消退，海平面逐漸上升，使前鱗的生活空間得以擴(kuò)大，故前鱗較強(qiáng)的魚卵擴(kuò)散能力及活動(dòng)能力伴隨海侵導(dǎo)致種群發(fā)生快速擴(kuò)張。資料顯示，冰期中海平面下降時(shí)，孑遺的物種會(huì)集中于避難所中形成隨機(jī)交配的祖先群體，故在冰期后經(jīng)種群擴(kuò)張至不同地理位置的群體間的遺傳分化不明顯(李雙, 2015)。該研究中中國(guó)前鱗的擴(kuò)張時(shí)間與之吻合，滿足共同祖先假說。

3.3 中國(guó)前鱗的種質(zhì)資源保護(hù)

魚類作為水生生態(tài)系統(tǒng)的高級(jí)消費(fèi)者，處于食物鏈的較高位置，是生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)的重要參與者，與水生環(huán)境有著密切的聯(lián)系，故各種水體污染和不適當(dāng)?shù)娜祟惢顒?dòng)都可能對(duì)魚類的生存產(chǎn)生不利的影響。而正常的生態(tài)系統(tǒng)功能的維持，需要制定相關(guān)的種質(zhì)資源保護(hù)方案。僅就該研究中，中國(guó)前鱗沒有形成明顯的地理聚群，且各地理群體間的分化程度較低，可以將其視作一個(gè)進(jìn)化顯著單位。但各地區(qū)群體的遺傳多樣性差異較大，其中，洞頭群體的遺傳多樣性(Hd=0.8080±0.1130,π=0.0021±0.0006)明顯高于其他地理群體，建議優(yōu)先對(duì)其進(jìn)行保護(hù)。由于采樣限制，該研究只涉及中國(guó)前鱗部分群體，且線粒體COI基因的進(jìn)化速度不及線粒體控制區(qū)序列，不一定能如后者那樣反映中國(guó)前鱗群體間可能存在的細(xì)微分化。另外，線粒體僅為母系遺傳，也可能沒有體現(xiàn)雙親遺傳的核基因所能反映的遺傳信息。因而在日后的工作中，需要結(jié)合測(cè)序控制區(qū)序列和基于核基因的多樣性分析技術(shù)，補(bǔ)充更多地理群體，以全面了解中國(guó)前鱗的遺傳背景及其基因流通道的分布，為種質(zhì)資源的保護(hù)和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。