黃藝寧，陳國平，柯麗娜

（1.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 漳州 363000；2.漳州市農(nóng)業(yè)局種植業(yè)管理站，福建 漳州 363000；3.漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 漳州 363005）

白背毛木耳是一種食藥兼用的食用菌，素有“樹上海蜇皮”之美稱，它不僅營養(yǎng)豐富，且藥用價(jià)值高，其多糖具有抗氧化[1]、抗腫瘤[2-3]等功能。白背毛木耳多糖的提取是其應(yīng)用的基礎(chǔ)，所以高效的提取技術(shù)是白背毛木耳研究熱點(diǎn)之一。目前毛木耳子實(shí)體多糖提取的方法有熱水浸提法、乙醇浸提法、超聲波熱水浸提法以及酸堿浸提法[4]，其它的方法則未見報(bào)道。酶法提取主要是通過破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)后再進(jìn)行提取，具有反應(yīng)條件溫和、選擇性高的特點(diǎn)，且酶的專一性可以避免對底物物質(zhì)的破壞[5]。目前酶法提取已經(jīng)在研究和生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用，使用酶法進(jìn)行降解后提取能減少提取溶劑的用量、縮短提取時(shí)間以及提高提取率[6-8]。目前酶法提取作為一種高效安全的提取方式被運(yùn)用于各類生物活性物質(zhì)，且已經(jīng)應(yīng)用于多個(gè)菌類多糖的提取[9-11]，但至今未應(yīng)用于白背毛木耳子實(shí)體多糖的提取。白背毛木耳子實(shí)體纖維含量高，胞內(nèi)多糖不易溶出，以纖維素酶處理白背毛木耳子實(shí)體能降解毛木耳細(xì)胞壁，促進(jìn)胞內(nèi)的多糖溶出，能縮短提取時(shí)間和提高得率。本文通過對酶法提取工藝條件的摸索將提高多糖得率，為白背毛木耳多糖的綜合利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白背毛木耳43-28，由漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。纖維素酶(20 000 U/g)，食品級，南寧龐博生物工程有限公司；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱KZX-9070 MBE，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；高速多功能粉碎機(jī)Q-250B，上海冰都電器有限公司；電子天平BSA124S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；JH恒溫水浴鍋，上海佳航儀器儀表有限公司；紫外可見分光光度計(jì)UV-1800PC-DS2，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 白背毛木耳多糖的提取

含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13%白背毛木耳粉碎過篩后，稱4 g樣品使用纖維素酶浸提，過濾，濾液用sevage法除蛋白，收集濾液進(jìn)行多糖含量測定。

1.2.2 多糖得率的計(jì)算[12]

多糖得率采用白背毛木耳干品中提取多糖總量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示。采用苯酚-硫酸法測定總糖，采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，具體算法如下：

式中：0.9為單糖折算為葡萄糖的換算系數(shù)。

1.2.3 單因素分析

1、料液比對白背毛木耳子實(shí)體多糖得率的影響。在酶用量為3 000 U/g、pH值為5.0、溫度為50℃、提取時(shí)間為180 min的條件下，考察料液比（g/mL）分別為1 ∶5、1 ∶10、1 ∶20、1∶30、1∶40、1∶50對白背毛木耳多糖得率的影響。

2、酶用量對白背毛木耳子實(shí)體多糖得率的影響。在料液比為1 g：30 mL、pH值為5.0、溫度為50℃、提取時(shí)間為180 min的條件下，考察不同酶用量（1 000、2 000、3 000、4 000、5 000、6 000 U/g）對白背毛木耳多糖得率的影響。

3、pH值對白背毛木耳子實(shí)體多糖得率的影響。在料液比為1 g：30 mL、酶用量為3 000 U/g、溫度為50℃、提取時(shí)間為180 min的條件下，考察不同pH值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）對白背毛木耳多糖得率的影響。

4、提取溫度對白背毛木耳子實(shí)體多糖得率的影響。在料液比為1 g：30 mL、酶用量為3 000 U/g、pH值為5.0、提取時(shí)間為180 min的條件下，考察不同溫度（0、45、50、55、60、65℃）對白背毛木耳多糖得率的影響。

5、提取時(shí)間對白背毛木耳子實(shí)體多糖得率的影響。在料液比為1g：30 mL、酶用量為3 000 U/g、pH值為5.0、提取溫度為50℃的條件下，考察不同提取時(shí)間（30、60、90、120、150、180 min）對白背毛木耳多糖提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)曲面法優(yōu)化酶法提取工藝

1、響應(yīng)曲面法優(yōu)化酶法提取工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酶用量、提取pH、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素為變量，以白背毛木耳子實(shí)體多糖的得率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken法對多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最佳的提取效果。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果制定因素組合設(shè)計(jì)編碼水平，見表1。

表1 多糖得率Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)編碼水平

2、響應(yīng)曲面法優(yōu)化工藝參數(shù)驗(yàn)證。以優(yōu)化后的最佳工藝條件進(jìn)行平行提取3次，與模型預(yù)測值進(jìn)行比較。將酶法提取工藝與微波輔助提取工藝[1]進(jìn)行比較，評價(jià)該方法的優(yōu)劣。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素分析

2.1.1 料液比對白背毛木耳子實(shí)體多糖得率的影響

由圖1可知，料液比大于1 g∶30 mL時(shí)，白背毛木耳子實(shí)體多糖的得率隨著提取溶劑的增加而顯著增大。當(dāng)料液比小于1 g∶30 mL時(shí)，白背毛木耳子實(shí)體多糖的提取率并沒有隨著提取溶劑比例的增加而顯著提升，這是由于在設(shè)定的條件下當(dāng)料液為1 g∶30 mL時(shí)多糖已經(jīng)基本溶于溶劑中。為了減輕后續(xù)的濃縮步驟的工作量考慮，將提取時(shí)的料液比定為1 g∶30 mL。

圖1 料液比對多糖得率的影響

2.1.2 酶用量對白背毛木耳子實(shí)體多糖得率的影響

由圖2可知，在設(shè)定的條件下，酶用量在小于3 000 U/g時(shí)，隨著用量的增加得率有顯著的提升。當(dāng)大于3 000 U/g時(shí)，得率的提升不明顯。這是因?yàn)樵谠O(shè)定的條件下當(dāng)酶用量達(dá)到3 000 U/g時(shí)已經(jīng)能夠使胞內(nèi)的多糖完全溶出。因此，酶用量宜在3 000 U/g。

圖2 酶用量對多糖得率的影響

2.1.3 pH值對白背毛木耳子實(shí)體多糖得率的影響

由圖3可知，在設(shè)定的條件下，當(dāng)pH值為5.0時(shí)得率最大。纖維素酶酶解需要適合的pH值，當(dāng)大于或者小于最佳pH時(shí)得率隨之減少。因此，提取時(shí)的pH值宜設(shè)定在5。

圖3 pH值對多糖得率的影響

2.1.4 提取溫度對白背毛木耳子實(shí)體多糖得率的影響

由圖4可知，當(dāng)提取溫度低于50℃時(shí)，隨著溫度的升高白背毛木耳子實(shí)體的得率也顯著增加。而當(dāng)溫度超過50℃時(shí)，多糖的得率隨著溫度的升高有所下降。這是由于過高的溫度容易引起酶變性而使酶失活導(dǎo)致的。因此，提取溫度選擇在50℃左右。

圖4 提取溫度對多糖得率的影響

2.1.5 提取時(shí)間對白背毛木耳子實(shí)體多糖得率的影響

由圖5可知，白背毛木耳多糖得率是隨著提取時(shí)間的延長而提高。而提取時(shí)間在30～120 min內(nèi)，提取率是隨著時(shí)間的延長而顯著提高。而提取時(shí)間大于120 min時(shí)，隨著時(shí)間的延長，提取率略有提高。所以，提取時(shí)間宜選在120 min左右。

圖5 提取時(shí)間對多糖得率的影響

2.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化酶法提取工藝

2.2.1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以白背毛木耳子實(shí)體多糖得率(Y)為響應(yīng)值，酶用量(A)、pH(B)、提取溫度(℃)、提取時(shí)間(D)為變量，經(jīng)過Design-Expert10軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)結(jié)果和分析如表2、表3所示。

表2 得率影響因素的Box-Behnken試驗(yàn)方案及結(jié)果

續(xù)表2

表3 不同因素對多糖得率影響的方差分析

運(yùn)用Design-Expert10軟件對表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合得到白背毛木耳子實(shí)體多糖得率影響因素的回歸方程：提取率=15.24+0.42*A-0.13*B+0.22*C+0.38*D-0.040*AB++0.068*AC-0.095*AD+0.00025*BC-0.098*BD-0.43*CD-0.25*A2-0.51*B2-0.87*C2-0.32*D2。白背毛木耳子實(shí)體多糖得率二次多項(xiàng)回歸模型方差分析結(jié)果見表3。

由表3的方差分析數(shù)據(jù)可知，應(yīng)用Design-Expert10軟件得到的數(shù)據(jù)模型是極顯著（P＜0.000 01）,而失擬項(xiàng)不顯著（P=0.0612＞0.05），這說明本試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)模型的回歸方程擬合度良好，試驗(yàn)結(jié)果可靠。

2.2.2 響應(yīng)面分析

利用數(shù)據(jù)模型做的響應(yīng)曲面可以反映因素或因素之間的交互作用對白背毛木耳子實(shí)體多糖得率影響的強(qiáng)弱，響應(yīng)曲面的陡峭程度越大，則對提取率的影響也越大。由圖6可知，在響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，各個(gè)因素中酶解溫度對白背毛木耳子實(shí)體多糖提取率的影響最大，提取時(shí)間的影響次之，酶用量影響第三，pH的影響均較?。唤换プ饔弥?，pH值與提取溫度的交互作用對白背毛木耳子實(shí)體多糖的提取率影響最大，提取時(shí)間與提取溫度的交互作用的影響次之，pH值與提取時(shí)間的交互作用的影響最小，這與表3的方差分析結(jié)果一致。

圖6 基于響應(yīng)曲面法不同因素對多糖提取率的影響

2.2.3 酶法提取白背毛木耳子實(shí)體多糖的最佳工藝

經(jīng)過Design-Expert10軟件分析，得到酶法提取白背毛木耳子實(shí)體多糖的最佳工藝條件為：纖維素酶3 774 U/g、pH值為4.9、提取溫度50.2℃、提取時(shí)間135 min。在該工藝條件下白背毛木耳子實(shí)體多糖的理論得率為15.52%。這說明了利用Box-Behnken建立的模型是合理的。采用響應(yīng)面分析得到的最佳工藝條件進(jìn)行白背毛木耳子實(shí)體多糖的提取，提取率為15.47%，與模型預(yù)測的理論值15.52%僅有0.323%的誤差。這說明該模型得到的結(jié)果是可靠的。

2.2.4 響應(yīng)曲面法優(yōu)化工藝參數(shù)驗(yàn)證

如圖7所示，用得到的酶法提取的最佳工藝條件進(jìn)行提取的得率為15.47%，比微波輔助提取白背毛木耳多糖[1]的得率14.03%要高10.26%。這說明用酶法提取白背毛木耳子實(shí)體多糖能提高多糖的得率。

圖7 酶法與微波法提取多糖對比

3 討論與結(jié)論

通過響應(yīng)面法對酶法提取白背毛木耳子實(shí)體多糖進(jìn)行建模分析，優(yōu)化酶法提取白背毛木耳子實(shí)體多糖的工藝提取條件。結(jié)果表明：在纖維素酶用量3 774 U/g、提取溫度50.2℃、pH=4.9、提取時(shí)間135 min的條件下，白背毛木耳子實(shí)體多糖的得率為15.47%，與模型預(yù)測值15.52%的相對誤差僅為0.323%。通過與微波輔助提取法的對比，得率提高了10.26%。在對比的過程中，使用微波輔助法的多糖提取率與楊申明[1]的提取率有較大的差別，這可能是由于白背毛木耳品種不一樣的原因。在本研究中雖然確定了用酶法提取白背毛木耳子實(shí)體多糖的最佳工藝，獲得了較高的得率，但對于提取到的多糖功能還未進(jìn)行驗(yàn)證，這需要后續(xù)進(jìn)一步的深入工作。