李 婧

(西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041)

替諾福韋(Tenofovir，PMPA)是一種新型核苷酸類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，可與天然脫氧核糖底物競爭性的結(jié)合抑制病毒聚合酶，可插入病毒DNA使病毒復(fù)制終止，可有效控制多種病毒[1-2]，PMPA可作為慢性乙型肝炎(CHB)及HIV的一線用藥.PMPA有磷酸結(jié)構(gòu)，主要以二價陰離子形式在體內(nèi)PH環(huán)境下存在，由于其極性較強難以通過生物膜，口服吸收性較差，可以通過將其制成前藥提高生物利用度降低副作用[3-6].2001年美國FDA批準其前藥替諾福韋二吡呋酯上市，作為第一個用于治療艾滋病的核苷酸類似物.目前已有100多個國家批準其用于HIV的聯(lián)合治療，被多國治療指南推薦作為抗HIV一線藥物[7-11].美國FDA于2016年批準替諾福韋艾拉酚胺(Vemlidy)上市，作為治療成人慢性乙型肝炎的新藥，該藥是繼馬酸替諾福韋二吡呋酯后FDA批準上市的另一個兼具抗HIV與抗乙型肝炎病毒和的PMPA前體藥[12-15].富馬酸替諾福韋雙特戊酯(TDF)因在替諾福韋中引入2個特戊酰氧甲酯到磷酸基團，使其極性減弱，生物利用度提高.本文研究了對富馬酸替諾福韋雙特戊酯灌胃給藥后，其活性成分替諾福韋在大鼠體內(nèi)組織分布況，為TDF的應(yīng)用及開發(fā)提供參考.

1 實驗材料

1.1 試劑與試藥

TDF對照品(含量：98.5%，本?；瘜W(xué)與環(huán)境保護工程學(xué)院提供)，替諾福韋對照品(含量98.0%，加拿大TRC標(biāo)準品公司提供)；阿昔洛韋對照品(含量99.8%，內(nèi)標(biāo)，批號140630-201403，中國藥品生物制品檢定所提供)；甲酸及甲醇均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純.

1.2 儀器

圖1 PMPA及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectra of PMPA and internal standard

Waters2695 HPLC系統(tǒng)；Waters ZQ2000型質(zhì)譜儀；賽多利斯BSA224S萬分之一電子天平(德國賽多利斯公司)；超低溫冰箱(海爾股份有限公司)；TG16-WS型離心機(湘儀離心機儀器有限公司)；H-1型漩渦混合器(上海青浦滬西儀器廠).

1.3 實驗動物

SD大鼠(SPF級，成都達碩生物科技有限公司提供)，雌雄各半，體重160～200 g，于實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)3天.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱采用Agilent Poroshell 120 SB-C18柱(2.7 μm，4.6×100 mm)；采用甲醇-0.3%甲酸(2：98) 為流動相；流速為0.2 ml·min-1；柱溫為30℃.

2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧電離源(ESI)；正離子檢測，選擇離子監(jiān)測(SIR)模式，監(jiān)測離子：PMPA m/z 288.1[M+H]+，內(nèi)標(biāo) m/z 226.2[M+H]+；錐孔電壓為30 V；毛細管電壓為0.8 KV；離子源溫度為120℃；脫溶劑氣溫度為350℃；脫溶劑氣流量為800 L·H-1.質(zhì)譜圖見圖1.

2.3 對照品溶液配制

精密稱取PMPA對照品適量，用水稀釋，配制成含PMPA 1 mg·mL-1的溶液，作為對照品儲備液，于4℃儲存，臨用前用水稀釋成標(biāo)準工作液.內(nèi)標(biāo)液配制：精密稱取阿昔洛韋對照品(內(nèi)標(biāo))適量，用水稀釋，制成含阿昔洛韋2.5 mg·mL-1的溶液，作為內(nèi)標(biāo)儲備液，臨用時用水稀釋成2.5 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液.

2.4 生物樣品的制備及處理

取SD大鼠15只，實驗前禁食12 h，隨機分為3組，每組5只，雌雄均有.分別經(jīng)口灌服TDF混懸液20 mg·kg-1，給藥后于0.083、0.5 及6.0 h 時取血，斷髓處死，再取腦、心、肝、脾、腎、肺、胃、腸、肌肉、脂肪及生殖腺(睪丸或卵巢)等組織，用生理鹽水清洗后用濾紙吸干，稱重.取組織適量置于勻漿器中，加蒸餾水5 ml勻漿，離心10 min(3 000 rpm)后取勻漿上清液，置與-70℃冰箱，保存待測.

取組織勻漿或血漿0.1 ml，置2 ml EP管中，加內(nèi)標(biāo)工作液20 μL，加水 20 μL，漩渦混勻后，再加入甲醇0.4 ml，混勻，于10 000 rpm離心10 min，取0.4 mL上清液，40℃下用氮氣吹干，殘渣用200 μL水溶解并過濾，取濾液10 μL，進樣并記錄色譜圖.

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1 專屬性考察

取0.1mL大鼠空白組織勻漿，按照“2.4”項下的方法操作，得到空白組織樣品色譜圖；于空白生物樣品中加入一定濃度的 PMPA及內(nèi)標(biāo)對照溶液，照“2.4”項下的方法操作，得到PMPA+內(nèi)標(biāo)+空白組織樣品色譜圖.典型色譜圖如圖2.結(jié)果表明 ，PMPA及內(nèi)標(biāo)保留時間分別為4.2 min及7.1 min，內(nèi)源性物質(zhì)對PMPA及內(nèi)標(biāo)的測定無干擾.

2.5.2 線性及范圍

量取0.1 mL各種不同的組織勻漿于EP管，分別加入20μL PMPA對照工作系列溶液，配制成不同含PMPA濃度的質(zhì)控樣品.以 PMPA的濃度 C(ng·mL-1)作為橫坐標(biāo)，以PMPA峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比(As/Ais)作縱坐標(biāo)，加權(quán)回歸.結(jié)果表明，各成分在其線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)及回歸方程見表1.

2.5.3 精密度和準確度

量取200 μL組織勻漿，照“2.4”項方法，分別配制PMPA高、中、低3個濃度的質(zhì)控樣品，同一濃度平行測定5次，連續(xù)3天測定.每批制作隨行標(biāo)準曲線，以此計算質(zhì)控樣品PMPA濃度，同法求算批內(nèi)、批間的精密度及準確度.結(jié)果見表2(以肝臟為例).方法回收率平均為90.12% ～105.72%，結(jié)果批內(nèi)、批間精密度(RSD)均小于15%.結(jié)果可見，本方法的準確度符合生物樣品測定的要求.

表1 大鼠組織中PMPA的線性關(guān)系Table 1 Regression equation and linear range of PMPA in different matrices

表2 方法的準確度，精密度，提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Precision，accuracy，recovery and matrix effect of the method(n=5)

2.5.4 穩(wěn)定性

按“2.5.3”項下的方法，取空的白組織勻漿，分別配制成含PMPA高、中、低3個濃度質(zhì)控樣品溶液.在-80℃冷凍條件下反復(fù)凍融3次，考察樣品凍融穩(wěn)定性；在室溫下放置 0、2、4、8 h，考察樣品室溫穩(wěn)定性；在-80℃條件下分別冷凍3、7、10、15天，考察樣品長期穩(wěn)定性；處理樣品在進樣池中放置15 h，考樣品穩(wěn)定性.結(jié)果3反復(fù)次凍融后回收率87.25%～102.56%，室溫放置8 h后回收率為90.54%～99.32%，-80℃下放置15天回收率為90.66%～103.48%，樣品經(jīng)處理后在進樣室內(nèi)15 h回收率為94.41%～105.58%，RSD小于10.75%，其穩(wěn)定性良好.

2.5.5 基質(zhì)效應(yīng)和萃取回收率

按“2.5.3”項下的方法，制成含PMPA高、中、低3個濃度的質(zhì)控樣品，進樣，得色譜峰面積為A1.另取適量空白組織勻漿，用同體積水代替內(nèi)標(biāo)溶液，按“2.4”項下方法，蛋白沉淀后，以上層水液為基質(zhì)液，用PMPA和內(nèi)標(biāo)對照品溶液配制成高、中、低3個濃度的樣品液，按“2.4”項下方法進樣，得色譜峰面積為A2；再取相應(yīng)濃度的PMPA及內(nèi)標(biāo)對照品溶液進樣，得色譜峰面積為A3.質(zhì)控樣品峰面積與A3的比值為萃取回收率，A2與A3的比值為基質(zhì)效應(yīng).測定結(jié)果如表2，結(jié)果表明，基質(zhì)對PMPA無明顯影響.本提取方法從生物基質(zhì)中提取PMPA效果較好.

2.6 組織分布實驗

取各種組織樣品適量，照“2.4”項下方法操作，進樣色譜峰面積，計算灌胃后PMPA在大鼠組織中的濃度，以每1 g組織中含PMPA量(ng)表示結(jié)果，結(jié)果如圖3.結(jié)果表明，大鼠灌服替諾福韋前藥(BP0018)后PMPA在大鼠體內(nèi)組織及器官中分布較廣，在腸、胃、肝臟及腎臟中濃度較高.

圖3 大鼠口服BP0018后PMPA組織分布圖(n=5)Fig.3 The mean tissue concentration of PMPA after oral administration of BP0018(n=5)

3 結(jié)論

本研究建立了HPLC-MS法測定大鼠血漿及組織中代謝產(chǎn)物PMPA的方法，本方法快速、簡便、靈敏度高、準確性好.在實驗中，由于PMPA極性大，因此我們采用了甲醇直接除蛋白的方法處理組織勻漿，用氮氣吹干上清液，用水溶解殘渣再進樣分析，采用此方法可以提高分析靈敏度.

用20 mg/kg富馬酸替諾福韋雙特戊酯灌胃大鼠后5 min后，在大鼠的心、腦、肺、肝、腎、脾、胃、腸、肌肉、脂肪等組織中均可檢出PMPA，說明富馬酸替諾福韋雙特戊酯能較快的在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為PMPA并迅速分布到器官組織中去，且在體內(nèi)分布廣泛.富馬酸替諾福韋雙特戊酯是前藥，它在胃腸道透膜吸收的過程中，被胃腸道中的酶代謝.通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，給藥后0.083～0.5 h，藥物主要停留在胃部排空，所以在胃部含量較高.本實驗中，灌胃5 min時，PMPA胃中濃度最高，小腸次之.灌胃30 min時，PMPA在小腸中濃度最高.該現(xiàn)象提示，富馬酸替諾福韋雙特戊酯可在吸收的過程中轉(zhuǎn)化為PMPA，胃及小腸為主要吸收部位.同時，PMPA在肝、腎、脂肪等器官中也具有高的濃度，提示肝可能為其靶器官，濃度較高則有利于發(fā)揮藥效，PMPA可能經(jīng)進行腎排泄.