周光姣，黃 翔

(1.安徽中醫(yī)藥科學(xué)院亳州中醫(yī)藥研究所，安徽 亳州 236800；2.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 亳州 236800；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230031)

復(fù)方五花顆粒是在部頒標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》第十冊(cè)WS-3B-1962-95的金菊五花茶顆粒的基礎(chǔ)上，加減而成的中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)方制劑，由葛花、菊花、槐花、白扁豆花和金銀花五味中藥組成.具有清熱化濕、解酒醒脾、降血脂之功效[1-3].臨床主要用于降血脂和醒酒，效果顯著.臨床使用采取簡(jiǎn)單的煎煮得濾液飲服，但工藝不統(tǒng)一、不穩(wěn)定，缺乏科學(xué)性，本課題組通過(guò)系統(tǒng)考察各影響因素，優(yōu)選復(fù)方五花顆粒的最佳提取工藝，為深入開(kāi)發(fā)本方提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 受試藥物

葛花、菊花、槐花、白扁豆花等藥材購(gòu)于亳州三義堂中藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院葉勝名副教授鑒定：金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花；菊花為菊科植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥頭狀花序；葛花為豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi干燥花；白扁豆花為豆科植物扁豆dolichos lablabL.干燥花的炮制加工品；槐花為豆科植物槐Sophora japonicaL.的干燥花及花蕾.

1.2 試劑

蘆丁對(duì)照品(HPLC，純度為 98.94%，批號(hào)：100080-201608，中國(guó)藥品生物制品檢定院)；無(wú)水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉(均為分析純，購(gòu)自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，分析純)；純凈水本實(shí)驗(yàn)室自制.

1.3 儀器

UV752PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海奧析科學(xué)儀器有限公司)；SH2-D(III)循環(huán)水式多用真空泵(河南省予華儀器有限公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；RE-201D升降恒溫水浴鍋(青島華青集團(tuán)有限公司)；FA2204電子天平(常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司)；JC101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海天祥藥械制造廠).

2 方法與結(jié)果

復(fù)方五花顆粒臨床上主要是以湯劑的形式運(yùn)用，且藥材中的主要成分均具有較好的水溶性，綜合考慮制成顆粒劑后的工業(yè)化生產(chǎn)，節(jié)約能耗等問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)用水煎煮法[4]提取.以總黃酮提取率和干浸膏得率的綜合得分為考察指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)選提取工藝.

2.1 復(fù)方五花顆粒總黃酮的含量測(cè)定

2.1.1 總黃酮提取率的測(cè)定方法

取樣品溶液1 mL加0.4 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻，靜置6 min，再加0.4 mL 10%硝酸鋁溶液，混勻靜置6 min.加4%氫氧化鈉溶液4 mL后用70%乙醇定容至10 mL，混勻靜置15 min.在510 nm處測(cè)吸光度，外標(biāo)法計(jì)算總黃酮的濃度[5]，總黃酮提取率=總黃酮的濃度×總稀釋倍數(shù)/藥材重量

2.1.2 蘆丁對(duì)照品溶液的配制

精密稱取蘆丁對(duì)照品10.02 mg，加70%乙醇定容至50 mL，搖勻，即得濃度為0.2004 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液[6].

2.1.3 樣品溶液的制備

按處方比例稱取各藥材共50 g，浸泡30 min，加20倍量的水煎煮0.9 h，濾過(guò)，濾渣加15倍量水第二次煎煮，合并兩次煎煮濾液，濃縮至相對(duì)密度為1.15-1.35，減壓干燥得樣品干膏[7-8].取0.2 g干浸膏，70%乙醇溶解并定容至50 mL，得樣品溶液.

2.1.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

分別吸取一定量的樣品和對(duì)照品溶液，使用硝酸鋁顯色法，顯色，在200～700 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描.結(jié)果表明兩者均在510 nm的波長(zhǎng)處有最大吸收峰，陰性溶液和背景溶液無(wú)干擾，因此本課題組選用510 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng).

2.1.5 線性關(guān)系考察

用移液槍分別精密移取蘆丁對(duì)照品溶液0.2、0.5、1、1.5、2.0、2.5 mL，分別加 5% 亞硝酸鈉溶液0.4 mL，混勻，靜置6 min，再加10%硝酸鋁溶液0.4 mL，混勻，靜置6 min，最后加4%氫氧化鈉溶液4 mL，70%乙醇定容至10 mL，混勻，靜置15 min[9-10].在510 nm處測(cè)吸光度，以濃度對(duì)吸光度，線性回歸，得回歸方程為Y=0.0128X-0.002(r=0.9999)，說(shuō)明在4.08～50.10 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好.

2.1.6 精密度考察

精密移取蘆丁對(duì)照品溶液1.0 mL，按“2.1.1”項(xiàng)方法，重復(fù)6次測(cè)定溶液的吸光度，RSD=0.42%，表明設(shè)備精密性良好.

2.1.7 穩(wěn)定性考察

精密移量取同一批次樣品溶液 1.0 mL，按“2.1.1”項(xiàng)方法，分別于 0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、18 h、36 h后測(cè)定吸光度，RSD=0.62%(n=6)，表明36h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性較好.

2.1.8 重復(fù)性考察

精密量取6份1 mL的樣品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)方法，測(cè)定吸光度，RSD=1.15%(n=6)，表明重復(fù)性良好.

2.1.9 加樣回收考察

量取0.5 mL供試品溶液共6份，每份加入0.5 mL蘆丁對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)方法測(cè)混合溶液的吸光度，計(jì)算加樣回收率.平均回收率98.73%，RSD=1.34%(n=6)，加樣回收率符合要求.

2.2 干膏得率的測(cè)定

精密稱定每份原藥材重量記W1，提取、濃縮干燥后干膏重量記 W2，按公式干膏得率 =W2×100%/W1，計(jì)算即得.

2.3 水提工藝單因素實(shí)驗(yàn)

設(shè)定其它工藝參數(shù)條件不變，分別探究液料比、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)對(duì)五花浸膏中總黃酮含量和干浸膏得率綜合評(píng)分的影響.將綜合評(píng)分滿分設(shè)為100分，總黃酮含量及干浸膏得率的權(quán)重比分別為60、40，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行加權(quán)評(píng)分.綜合評(píng)分=總黃酮提取率×0.6/最大總黃酮得率+干膏得率×0.4/最大干膏得率[11]，見(jiàn)表1.

表1 單因素變化條件Table 1 Single factor variation conditions

2.3.1 液料比對(duì)綜合評(píng)分的影響

按照“表1”中動(dòng)態(tài)條件試驗(yàn)，并計(jì)算出試驗(yàn)結(jié)果的綜合評(píng)分，繪制液料比對(duì)綜合評(píng)分曲線圖，見(jiàn)圖1(A).復(fù)方五花提取液綜合評(píng)分隨液料比呈現(xiàn)峰形，當(dāng)液料比為20∶1時(shí)處于峰頂，兩側(cè)逐漸下降.推測(cè)，液料比的增加，會(huì)令更多競(jìng)爭(zhēng)性雜質(zhì)溶出，降低總黃酮提取率.且較大的液料比，會(huì)為后面的濃縮帶來(lái)困難.因此，分別擇優(yōu)選擇15∶1、20∶1、25∶1 的液料比作為響應(yīng)面法的三個(gè)因素水平.

2.3.2 煎煮時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分的影響

按照“表1”中動(dòng)態(tài)條件試驗(yàn)，并計(jì)算出試驗(yàn)結(jié)果的綜合評(píng)分，繪制煎煮時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分曲線圖，見(jiàn)圖1(B).復(fù)方五花提取液綜合評(píng)分隨著時(shí)間的增大而提高，當(dāng)煎煮時(shí)間為1 h時(shí)，綜合評(píng)分最高，之后開(kāi)始下降.推測(cè)，本實(shí)驗(yàn)使用煎煮法提取，并且花類藥材易揮發(fā)，藥液中的總黃酮隨著煎煮時(shí)間增加，會(huì)逐漸分解.綜合考慮，煎煮時(shí)間分別選擇0.5、1、1.5 h作為響應(yīng)面法的三個(gè)因素水平.

2.3.3 提取次數(shù)對(duì)綜合評(píng)分的影響

按照“表1”中動(dòng)態(tài)條件試驗(yàn)，并計(jì)算出試驗(yàn)結(jié)果的綜合評(píng)分，繪制提取次數(shù)對(duì)綜合評(píng)分曲線圖，見(jiàn)圖1(C).煎煮次數(shù)在2次時(shí)，綜合評(píng)分提高較快，之后隨提取次數(shù)增加綜合評(píng)分差別不大.所以綜合考慮節(jié)約資源，分選擇1、2、3次作為響應(yīng)面法的三個(gè)因素水平.

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.4.1 響應(yīng)曲面優(yōu)選分析

據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇液料比、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)三個(gè)因素，每個(gè)因素三水平(見(jiàn)表2)，以總黃酮提取率和干浸膏得率的綜合評(píng)分為為響應(yīng)值，使用Design-Expert8.05b軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken響應(yīng)面，并進(jìn)行相關(guān)的數(shù)據(jù)分析設(shè)計(jì).

由表3的數(shù)據(jù)可知，回歸模型P＜0.0001，說(shuō)明此模型極其具有顯著性.且R2=0.9862，表示實(shí)驗(yàn)所得值與預(yù)測(cè)值有較好的擬合度，失擬項(xiàng)P＞0.05不具有顯著性，說(shuō)明方程模擬較好，采用此方法進(jìn)行復(fù)方五花顆粒的提取工藝的預(yù)測(cè)和分析具有可行性.所得出的二次多元回歸方程：

Y=96.08-1.48A-4.29B+1.25C+1.05AB-1.25AC-1.54BC-3.45A2-12.78B2-4.75C2.

從回歸方程顯著性表明：一次項(xiàng)回歸方程中，A、B、C都具有極其顯著性，對(duì)綜合評(píng)分影響較大.在交互項(xiàng)中，BC具有顯著性，其他兩個(gè)交互項(xiàng)無(wú)顯著性.在二次項(xiàng)中，A2、B2、C2都具有極強(qiáng)的顯著性.綜上所述，3個(gè)因素水平中對(duì)復(fù)方五花顆粒提取工藝影響結(jié)果依次為：B＞C＞A.結(jié)果見(jiàn)表3～表4.

圖1 各提取因素對(duì)綜合評(píng)分結(jié)果的影響Fig.1 Influence of extraction factors on the comprehensive rating results

表2 實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 2 Experimental factors and levels

表3 提取工藝響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Experimental design and result of response surface of extraction process

(續(xù)表3)

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

2.4.2 響應(yīng)面圖譜與分析

根據(jù)數(shù)據(jù)和模型，繪制響應(yīng)曲面圖，見(jiàn)圖2.從圖2可以直觀的看出3因素和兩兩因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響.提取時(shí)間的曲面陡峭，說(shuō)明提取時(shí)間對(duì)提取工藝影響較顯著.液料比較平緩，說(shuō)明液料比對(duì)提取工藝影響不如提取時(shí)間大；提取次數(shù)和液料比的曲面陡峭，說(shuō)明提取次數(shù)和液料比對(duì)提取工藝影響較顯著；提取次數(shù)和提取時(shí)間的曲面陡峭，說(shuō)明提取次數(shù)和提取時(shí)間對(duì)提取工藝影響較顯著.

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)和二次回歸模型的綜合分析，采用Design-Expert8.05b軟件計(jì)算，優(yōu)化過(guò)后的最佳提取工藝條件為：液料比18.60∶1，提取時(shí)間0.90 h，提取次數(shù)2.20次，在此條件下，綜合評(píng)分最大值為96.8234.同時(shí)，考慮操作的方便，將五花提取工藝參數(shù)的最優(yōu)項(xiàng)調(diào)整為：液料比20∶1，提取時(shí)間0.9 h，提 取2次.

圖2 因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響的響應(yīng)曲面圖Fig.2 Dependent variable relative to the effect of the variable surface three-dimensional chart

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析

2.5.1 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對(duì)最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證，從而進(jìn)一步考察響應(yīng)面法的可靠性.分別依照比例稱取藥材3份，每份共10 kg，按照所選的最佳提取工藝∶液料比20∶1，提取時(shí)間0.9 h，提取2次，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)定總黃酮提取率和干浸膏得率.驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，每個(gè)批次的干膏得率和總黃酮得率都接近響應(yīng)面法最優(yōu)數(shù)據(jù)的理論值，因此采用響應(yīng)面法優(yōu)選的無(wú)糖型復(fù)方五花顆粒的提取工藝切實(shí)可行，結(jié)果見(jiàn)表5.

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)(n=3)Table 5 Verification tests(n=3)

3 討論

提取工藝優(yōu)化，通常采用均勻試驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)等常用的方法，這些方法雖然避免了大量重復(fù)性的實(shí)驗(yàn)，但客觀存在著精密性差，適用范圍有限等缺陷.而響應(yīng)面法采用多元二次回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，是把各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系用函數(shù)來(lái)表示，將數(shù)據(jù)系統(tǒng)分析，以有限點(diǎn)估面，軟件自動(dòng)生成連續(xù)變量的曲面模型，優(yōu)選出最佳組合因素[12-13].該方法試驗(yàn)次數(shù)少、試驗(yàn)周期短，求得的回歸方程精度高且能夠研究幾種因素間的交互作用.因此，響應(yīng)面法比傳統(tǒng)優(yōu)化方法能更直觀、準(zhǔn)確得到最優(yōu)組合.

本實(shí)驗(yàn)過(guò)程由于處方藥材中富含黃酮類成分，高溫不穩(wěn)定，為了避免有效成分被破壞，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索，提取過(guò)程控制溫度在80～85℃，并選擇減壓濃縮、干燥，控溫在80℃左右.