張彥燕，趙 爽，付凌云，何 麗，冉 新，李佳川，徐旖旎，沈祥春

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)臨床藥學(xué)教研室，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；3.西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041)

研究表明，氧自由基參與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程，血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷為動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)的重要病理生理過程[1-2]，動脈粥樣硬化斑塊形成學(xué)說也與之有著密切的聯(lián)系[3].因此，以氧化應(yīng)激損傷為切入點(diǎn)，尋找能夠調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞功能穩(wěn)態(tài)的民族藥物，對特色民族藥物防治動脈粥樣硬化的臨床治療具有積極意義[4].

艷山姜(AlpiniazerumbetPers.Burttet Smith)是姜科山姜屬植物的干燥成熟果實(shí)[5]，艷山姜揮發(fā)油(Essential Oil from FructusAlpiniaZerumbet，EOFAZ) 具有抗炎，鎮(zhèn)痛，抗氧化，抗動脈粥樣硬化等藥理作用[6].前期研究表明，艷山姜揮發(fā)油可通過抑制核因子NF-κB的磷酸化入核，而抑制脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷[7]及抑制自發(fā)性高血壓大鼠胸主動脈血管纖維化重塑，研究表明其為具有心血管活性的民族藥物.但艷山姜揮發(fā)油是否對TGF-β1誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用，目前未見相關(guān)報(bào)道.因此，本研究采用TGF-β1誘導(dǎo)建立內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，分析其對核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)蛋白表達(dá)的影響，以期分析艷山姜揮發(fā)油對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，為艷山姜防治心血管疾病的臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

艷山姜藥材果實(shí)采自貴州省貞豐縣連環(huán)鄉(xiāng)，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定為姜科山姜屬植物的干燥成熟果實(shí)，水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，收得率為1.3%.

1.2 細(xì)胞株

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)購于美國 Sciencell公司.

1.3 試劑

內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基購于美國Sciencell公司(批號：1001)，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)購于 Princeton business park公司(批號：0716209-1)，胰蛋白酶購于GIBCO公司，四氮唑鹽(MTT)購于Solarbio公司(批號：804W059)，BCA蛋白定量試劑盒(批號：P0010)、活性氧檢測試劑盒均購于碧云天生物技術(shù)研究所(批號：S0033)，Immobilon western化學(xué)發(fā)光試劑購于Millpore公司(批號：1707901)，Nrf2抗體購于 Santa Cruz公司(批號：16396-I-AP)，抗兔二抗和抗小鼠二抗的抗體購于武漢博士生物技術(shù)有限公司.

1.4 儀器

XDS-1B倒置顯微鏡，日本尼康公司，ELX800型酶聯(lián)免疫檢測儀，美國GE公司，CFX型凝膠成像系統(tǒng)儀，美國BIO-RAD公司，5810R型冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司.

1.5 方法

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)

按常規(guī)方法復(fù)蘇HUVECs，加入10%血清的完全培養(yǎng)基置于37℃，濕度飽和，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長密度進(jìn)行換液和傳代培養(yǎng).取對數(shù)生長期的細(xì)胞約2×105個/mL接種到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，待其生長狀態(tài)達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求后進(jìn)行分組給藥.

1.5.2 分組給藥

實(shí)驗(yàn)分為4個組：(1)正常對照組：正常細(xì)胞培養(yǎng)(Control，10%ECM)；(2) 模型組(Model，TGF-β1，10 ng/mL)；(3)EOFAZ 高劑量組(EOFAZ-H，4 μg/L)；(4)EOFAZ 低劑量組(EOFAZ-L，1 μg/L).預(yù)先加入艷山姜揮發(fā)油干預(yù)作用2 h，再加入TGF-β1共同孵育6 h，建立內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型.

1.5.3 細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)(MTT)

采用MTT比色法測定細(xì)胞存活率.取對數(shù)生長期細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，約1×105個/mL接種于96孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁生長至75% ～85%的覆蓋密度，按1.5.2項(xiàng)下方法給藥處理.到達(dá)觀測終點(diǎn)時每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，4 h后吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO溶液，搖床震蕩15 min，在490 nm波長處測定光密度值(OD).每組設(shè)6個平行復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.計(jì)算公式：細(xì)胞存活率(%)=給藥組OD值/正常組OD值×100%.

1.5.4 ROS含量檢測

細(xì)胞傳代處理后，將細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到70% ～80%時，按1.5.2項(xiàng)下方法分組處理之后，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育6 h，用PBS清洗之后，向6孔培養(yǎng)板內(nèi)加入10 μΜ的DCFH-DA，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 min，用無血清ECM清洗3-4次，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照.

1.5.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞生長至傳代密度后，進(jìn)行傳代和鋪板操作.消化離心細(xì)胞后，加入培養(yǎng)基重懸，將懸液約1×104個/孔接種于24孔培養(yǎng)板中，按上述方法分組給藥處理.觀察細(xì)胞密度達(dá)80%左右即可進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)操作.用20μL的槍頭在細(xì)胞生長中央?yún)^(qū)域劃線，之后用PBS清洗脫落的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng).于劃痕后0 h和6 h兩個時間點(diǎn)拍照，隨機(jī)選擇4-6個標(biāo)記點(diǎn)，進(jìn)行數(shù)據(jù)測定并計(jì)算遷移率.計(jì)算公式如下：遷移率=(0 h劃痕距離平均值-6 h劃痕距離平均值)/0 h劃痕距離平均值.

1.5.6 Western blotting檢測

采用蛋白免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá).將不同給藥組細(xì)胞用預(yù)冷的PBS清洗三次，加入新鮮配置的細(xì)胞裂解液(PMSF：RIPA=1：99)，于搖床上裂解(冰浴)20 min.裂解后將細(xì)胞刮取下來收集到1.5 mL EP管內(nèi)，冷凍離心20 min后采用BCA法進(jìn)行蛋白定量.凝膠制備好后，每個泳道內(nèi)加入20 μL分裝好的蛋白樣品，于90V電壓下進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，待跑至下層膠時調(diào)節(jié)電壓至120V.電泳結(jié)束后在恒流300 mA條件下，濕轉(zhuǎn)1.5 h至偏氟乙烯膜(PVDF膜)，采用5%脫脂牛奶(PBS/TBST配制)于搖床上室溫封閉2 h.洗滌液清洗三遍后加入一抗(1：1000稀釋)于4℃孵育過夜，第二天拿出洗滌后加入辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗(1：7000)，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液暗室顯影.應(yīng)用Image Pro Plus 6.0軟件分析灰度值，以Nrf2/β-actin的比值分析蛋白相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.5.7 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用多個樣本均數(shù)比較的單因素方法分析(one-way ANOVA).以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 MTT法分析細(xì)胞存活率

MTT法是常用的分析細(xì)胞損傷程度的指標(biāo)之一.與正常對照組比較，TGF-β1作用6 h后，模型組細(xì)胞存活率顯著降低(P＜0.01)，預(yù)先給予EOFAZ后，EOFAZ高低劑量組細(xì)胞存活率明顯升高(P＜0.05)，結(jié)果見表1.

表1 MTT法分析艷山姜揮發(fā)油的保護(hù)作用(±s，n=6)Table 1 The protective effect of EOFAZ through MTT(±s，n=6)

與正常對照組比較，**P＜0.01；與 TGF-β1模型組比較，*P＜0.05，**P ＜0.01

組別 給藥濃度(μg/L)OD(490nm)存活率(%)Control 0.598±0.55 100 TGF-β1 0.396 ±0.50** 66**EOFAZ-H 4 0.527±0.034* 88*EOFAZ-L 1 0.497±0.033 83*

2.2 活性氧試劑盒檢測ROS的表達(dá)情況

與正常對照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)ROS呈高表達(dá)水平，EOFAZ高低劑量干預(yù)作用后可不同程度降低ROS水平，結(jié)果見圖1.

圖1 HUVECs細(xì)胞中ROS水平的變化(200×)Fig 1 Changes of ROS level in HUVECs

2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞遷移能力

采用劃痕實(shí)驗(yàn)判斷細(xì)胞的生長遷移能力.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常對照組、模型組、EOFAZ-H組、EOFAZ-L組的遷移率分別為：(21.7±15.3)%、(71.9±1.2)%、(47.7±2.1)%、(53.5±5.8)%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 TGF-β1作用后細(xì)胞遷移能力顯著增加(P＜0.01)，EOFAZ干預(yù)保護(hù)作用后，EOFAZ高、低劑量組可不同程度降低細(xì)胞遷移能力(P＜0.01).見表2.

表2 劃痕實(shí)驗(yàn)觀察EOFAZ對TGF-β1誘導(dǎo)HUVECs的遷移能力的影響(±s，n=4)Table 2 The effect of EOFAZ on the migration of HUVECs induced by TGF-β1 using Scratch test(±s，n=4)

表2 劃痕實(shí)驗(yàn)觀察EOFAZ對TGF-β1誘導(dǎo)HUVECs的遷移能力的影響(±s，n=4)Table 2 The effect of EOFAZ on the migration of HUVECs induced by TGF-β1 using Scratch test(±s，n=4)

與正常對照組比較，**P＜0.01；與TGF-β1模型組比較，**P＜0.01

Control 0.977±0.021 0.767±0.125 21.7±15.3 1.10±0.082 0.307±0.009 71.9±1.2**EOFAZ-H 4 1.003±0.078 0.523±0.017 47.7±2.1**EOFAZ-L 1 1.003±0.078 0.467±0.047 53.5±5.8**TGF-β1

2.4 EOFAZ對內(nèi)皮細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)的影響

采用Western Blot法檢測調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子Nrf2蛋白的表達(dá)情況.結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組內(nèi)皮細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05)，EOFAZ高劑量組與模型組比較，Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.01)，低劑量組無明顯差異.如圖2所示.

圖2 用Western Blot檢測EOFAZ對TGF-β1誘導(dǎo)HUVECs中Nrf2蛋白表達(dá)情況的影響Fig.2 The effect of EOFAZ on the expression of Nrf2 in TGF-β1-induced HUVECs by Western blot

3 討論與結(jié)論

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是引起炎癥、衰老和一系列慢性疾病的主要因素之一，當(dāng)機(jī)體受到各種內(nèi)外環(huán)境因素刺激時，體內(nèi)產(chǎn)生大量高活性分子活性氧和活性氮，從而造成組織損傷.研究表明，活性氧在血管壁的富集可引起血管收縮，破壞血管結(jié)構(gòu)和功能，其中血小板的大量聚集可引起內(nèi)皮細(xì)胞黏附和血栓形成，從而觸發(fā)動脈粥樣硬化斑塊的形成[8].已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷為動脈粥樣硬化的關(guān)鍵病理生理過程，其可造成動脈內(nèi)膜脂質(zhì)粥樣斑塊的形成[9].TGF-β來自于轉(zhuǎn)化生長因子超家族，可與細(xì)胞表面的 II型受體(TβRII)結(jié)合后活化 I型受體(TβRI)，因其功能多樣性可激活下游系列信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及胞外基質(zhì)合成的生物效應(yīng)，并參與動脈粥樣硬化的病理生理過程，其亞型之一TGF-β1是組織纖維化發(fā)生異常最重要的引發(fā)因子.核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor-erythroid 2 related factor 2，Nrf2)是協(xié)調(diào)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)重要的轉(zhuǎn)錄因子，其最主要的功能是促進(jìn)一系列抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)，從而激活細(xì)胞的抗氧化反應(yīng)，減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激的損傷[10].當(dāng)ROS、親電子物質(zhì)或其他有害物質(zhì)引起氧化應(yīng)激時，Nrf2的泛素化與Keap1解偶聯(lián)，游離的Nrf2與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，激活Ⅱ抗氧化酶基因和解毒酶相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高抗氧化應(yīng)激的能力[11-12].因此，以抗氧化應(yīng)激為切入點(diǎn)，探討TGF-β1誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制，在防治動脈粥樣硬化和其他心血管疾病的過程中意義突出.

艷山姜揮發(fā)油具有抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化等藥理作用，因此本研究觀察EOFAZ對TGF-β1誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，并進(jìn)一步分析其作用機(jī)制.研究結(jié)果表明10 ng/mL TGF-β1作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞6 h可成功復(fù)制內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，細(xì)胞形態(tài)由正常的鵝卵石狀變?yōu)殚L梭形，細(xì)胞間隙變大，存活率顯著降低，ROS水平明顯升高，內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力增強(qiáng).而經(jīng)艷山姜揮發(fā)油高低劑量干預(yù)處理細(xì)胞后，可明顯提高HUVECs的存活率，降低ROS的表達(dá)水平及內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力.蛋白免疫印跡結(jié)果表明，TGF-β1能夠誘導(dǎo)Nrf2蛋白的表達(dá)下降，而EOFAZ高劑量組可上調(diào)Nrf2蛋白的表達(dá)水平.本研究報(bào)道了艷山姜揮發(fā)油對TGF-β1誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與EOFAZ調(diào)控Nrf2信號有關(guān)，其相關(guān)信號的精密調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究.