魯玉杰 袁 園 劉鳳杰 王爭艷 何向楠

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院；河南省小麥儲藏協(xié)同創(chuàng)新中心 ，鄭州 450001)

小麥粉中害蟲碎片的數(shù)量是面粉質(zhì)量等級的劃分的重要指標(biāo)。在國際貿(mào)易中銷售的不同等級的小麥粉中害蟲碎片的含量在各個國家有不同的規(guī)定，加拿大健康保護(hù)協(xié)會規(guī)定每50 g小麥粉樣品中含有少于20個大于0.2 mm的昆蟲碎片[1]。而美國食品和藥物管理局規(guī)定禁售程度為每50 g小麥粉中含有75個或更多的昆蟲碎片[2]。在歐洲，對小麥粉中害蟲碎片的量也有一些限制。近年來，夏季面粉廠最頭疼的是面粉蟲害問題[3]。小麥粉生蟲還嚴(yán)重影響面粉的質(zhì)量和出口貿(mào)易[4]。目前害蟲數(shù)量的檢測方法沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。染色法[3]、近紅外光譜檢測法[5]、磷鎢酸檢測尿酸法[6]、浮選法[7]、酶聯(lián)免疫吸附測定法[8]、高效液相色譜法[9]等是近幾年研究的熱點，但目前還沒有一種快速準(zhǔn)確的方法并在實際中得到推廣。DNA(脫氧核糖核酸)是細(xì)胞染色體中的遺傳基因，其分子各個片段就代表各個遺傳信息[10]。由于DNA指紋圖譜直接反映DNA水平上的差異，它成為當(dāng)今應(yīng)用廣泛的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)。目前，DNA指紋技術(shù)在昆蟲領(lǐng)域的應(yīng)用主要集中在系統(tǒng)演化及分類鑒定兩方面[11-12]。Balasubramanian等[13]利用DNA指紋技術(shù)能夠檢測小麥粉中赤擬谷盜和雜擬谷盜成蟲的碎片，其靈敏度為小麥粉中1.0%的害蟲感染水平。本研究為開發(fā)小麥粉中快速有效的檢測害蟲的技術(shù)，利用了昆蟲的延長因子基因EF1為目的基因的DNA分子指紋圖譜技術(shù)對小麥粉中的常見的赤擬谷盜Triboliumcastaneum、雜擬谷盜Triboliumconfusum和鋸谷盜Oryzaephilussurinamensis的碎片、幼蟲和卵進(jìn)行了檢測，并抽取了面粉廠中樣品對其幼蟲含量進(jìn)行了靈敏度和準(zhǔn)確率的驗證。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 蟲源

試蟲赤擬谷盜Triboliumcastaneum，雜擬谷盜Triboliumconfusum和鋸谷盜Oryzaephilussurinamensis采自河南省鄭州市，在河南工業(yè)大學(xué)儲糧生態(tài)實驗室培養(yǎng)數(shù)代后備用。選用蟲齡、生理狀態(tài)一致的赤擬谷盜、雜擬谷盜、鋸谷盜(成蟲、幼蟲和蟲卵)。赤擬谷盜和雜擬谷盜的飼料為全麥粉∶碎麥?！媒湍?9∶3∶1)；鋸谷盜的飼料配比為：全麥粉∶碎麥?！醚帑溒媒湍?5∶3∶3∶1)。在溫度(30±2) ℃，濕度(70±5)%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 供試小麥粉

選用無蟲且品質(zhì)較好的小麥，將其除去雜質(zhì)后用自來水洗干凈，放入烘箱中60 ℃烘2～3 h，將小麥的含水量調(diào)至(14±0.5)%。將小麥取出冷卻至室溫，用實驗室小麥磨粉機(jī)磨成小麥粉。小麥粉經(jīng)過80目篩子，篩去大于80目篩孔的小麥粉或面團(tuán)，篩下物即為所需的小麥粉樣品。一部分小麥粉用于所需蟲源的飼料，一部分作為DNA提取時所需的小麥粉樣品。

1.2 方法

1.2.1 兼并引物設(shè)計

以鞘翅目模式昆蟲赤擬谷盜的延長因子(GB：HM156722.1 ；GI：299152241)基因序列為模板，在NCBI中找到赤擬谷盜的基因序列，找出其編碼序列。將基因的編碼序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對，在比對結(jié)果中挑選不同的昆蟲的序列。利用Clustalx軟件選取出相同的基因序列，兼并引物的設(shè)計在18～22個堿基，同一列不同的堿基用其他的字母代替，不同的引物組合如表1所示。

1.2.2 不同的昆蟲基因組的提取

從赤擬谷盜、雜擬谷盜和鋸谷盜中提取的基因組，采用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒[生工生物(上海)有限公司生產(chǎn)]說明書，其方法步驟略。

1.2.3 PCR反應(yīng)條件

不同昆蟲PCR反應(yīng)的條件按照梯度PCR進(jìn)行條件的設(shè)定，然后得到一個確定的反應(yīng)條件赤擬谷盜不同蟲態(tài)的反應(yīng)條件為：94 ℃，預(yù)變性5 min；94 ℃，變性30 s和56 ℃退火45 s；72 ℃延伸30 s的35個循環(huán)；72 ℃，延伸10 min；16 ℃保溫1 h之內(nèi)放入4 ℃的冰箱保存或者進(jìn)行下一步實驗。雜擬谷盜、鋸谷盜不同蟲態(tài)的PCR反應(yīng)條件與赤擬谷盜條件基本一致，改良PCR反應(yīng)條件將退火溫度分別為改為48和50 ℃。

1.2.4 簡并引物的篩選

從培養(yǎng)的雜擬谷盜和鋸谷盜試蟲中分別挑選數(shù)頭成蟲、幼蟲和蟲卵放入干凈的培養(yǎng)皿內(nèi)。成蟲和幼蟲清水洗凈放入吸水紙吸干；往放有蟲卵的培養(yǎng)皿內(nèi)加入少量乙醇潤濕，再加入適量稀硫酸(1∶19=V∶V)蓋上培養(yǎng)皿，放置于水浴鍋上蒸汽浴8 min，蟲卵表面的面粉被去掉，用布氏漏斗低壓抽濾，室溫晾干。用天平稱取50 mg小麥粉和占50 mg小麥粉總量的20%、10%、5%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%和0.05%的不同昆蟲蟲態(tài)。稱量的昆蟲放入1.5 mL的無菌離心管中，離心管蓋上蓋子放入盛有液氮的小容器內(nèi)，放置3～5 min使之冷卻。然后取出離心管并打開蓋子使用組織研磨器進(jìn)行研磨至粉末狀，最后往離心管內(nèi)加入稱取的50 mg小麥粉混勻，每種處理重復(fù)3次。

1.2.5 不同質(zhì)量比例的目的基因條帶亮度值

以50 mg小麥粉為準(zhǔn)，分別將占20%、10%、5%、3%、1%、0.5%、0.1%和0.05%等的不同比例且不同蟲態(tài)的害蟲添加入小麥粉中，提取害蟲的目的基因并且進(jìn)行PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳。利用Tanon-2500凝膠成像分析儀和GIS-1D圖像分析軟件計算電泳圖中目的基因條帶的灰度值作為條帶亮度的定量值，計算出害蟲含量與條帶亮度的關(guān)系曲線。

1.2.6 DNA指紋檢測方法在面粉廠隨機(jī)抽樣檢驗

在鄭州金苑面粉有限公司的倉庫隨機(jī)抽取幾袋小麥粉，每一袋小麥粉中抽取500 g放在實驗室里，共抽取7份，每份樣品從抽取的面粉放在溫度(30±2) ℃，濕度(70±5)%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d后再分成兩份，一份進(jìn)行DNA指紋圖譜方法面粉蟲蟲卵的檢測，另一份利用篩選法對面粉中的幼蟲進(jìn)

表1 赤擬谷盜延伸因子十對兼并引物的序列

注：M：DNA Marker，DL1000 1-12：分別以赤擬谷盜、雜擬谷盜和鋸谷盜為模板表示50～60 ℃的3溫度梯度。圖1 不同引物組合在不同溫度下的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖

行檢測得到實際的檢測數(shù)量。對比DNA指紋圖譜方法的害蟲含量與條帶亮度的關(guān)系方程計算理論的檢測量與時間的檢測數(shù)量進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種害蟲延長因子基因片段擴(kuò)增引物的篩選

10對引物相互組合后按照梯度PCR的方法優(yōu)化對三種小麥粉中主要害蟲赤擬谷盜、雜擬谷盜和鋸谷盜延長因子基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出引物EFS319和EFA758組合的PCR產(chǎn)物中，每個退火溫度的擴(kuò)增條帶都非常清晰，條帶大小符合目的片段且?guī)缀鯖]有引物二聚體和非特異性擴(kuò)增，說明EFS319和EFA758這對引物可以有效擴(kuò)增出來特異性條帶，可以用于后續(xù)實驗。因此確定本研究延長因子的正向引物EFS319：5′CGT GA(A/G) CGT GGT ATC ACC AT(T/C)G3′。反向引物EFA758：5′CCC TTG AAC CA(T/G) GGC AT(T/C) TTG 3′

2.2 DNA指紋技術(shù)檢測小麥粉中三種害蟲成蟲碎片的最低檢出限

小麥粉中分別加入不同含量的赤擬谷盜、雜擬谷盜和鋸谷盜成蟲碎片、幼蟲和卵。DNA指紋技術(shù)檢測后的電泳圖如圖2所示。

注：M為DL1000 Marker，其條帶片段長度分別為：1 000、700、500、400、300、200和100 bp；1泳道為其目的基因片段；2～7依次是昆蟲碎片含量為20%、10%、5%、3%、2%和1%；8是小麥粉的基因片段；CK為空白對照，是在PCR體系中以無菌水代替目的基因的對照組，主要用作排除底物污染的確定。B和C為優(yōu)化PCR反應(yīng)條件后雜擬谷盜和鋸谷盜的檢測結(jié)果圖圖2 小麥粉中含赤擬谷盜(A)、雜擬谷盜(B)、鋸谷盜(C)碎片DNA檢測靈敏度

由圖2可知，當(dāng)成蟲碎片含量占20%時能檢測到，直到碎片含量占2%時仍能檢測，但當(dāng)赤擬谷盜碎片含量為1%時凝膠成像圖中沒有條帶。對PCR條件優(yōu)化后可以檢測雜擬谷盜、鋸谷盜碎片含量的最低檢測限為1%。

2.3 DNA指紋技術(shù)檢測小麥粉中三種害蟲幼蟲的最低檢出限

在小麥粉中分別加入不同含量的赤擬谷盜、雜擬谷盜和鋸谷盜幼蟲。DNA指紋技術(shù)檢測后的電泳圖如圖3所示。從圖3可以看出赤擬谷盜幼蟲含量最低檢測限是1%。對PCR條件優(yōu)化后可以檢測出雜擬谷盜、鋸谷盜的幼蟲含量最低達(dá)到0.05%。說明了DNA指紋檢測技術(shù)可以準(zhǔn)確判斷小麥粉中幼蟲的發(fā)生情況。

注：M為DL1000 Marker；1泳道為其目的基因片段；A中2～8依次為赤擬谷盜幼蟲含量為20%、10%、5%、3%、1%、0.5%，9為小麥粉的目的基因；B和C中2～10依次是幼蟲含量20%、10%、5%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%和0.05%， B和C為優(yōu)化PCR反應(yīng)條件的檢測結(jié)果；11為小麥粉的目的基因；CK為空白對照。圖3 小麥粉中含赤擬谷盜(A)、雜擬谷盜(B)、鋸谷盜(C)幼蟲DNA檢測結(jié)果

2.4 DNA指紋技術(shù)檢測小麥粉中三種害蟲蟲卵的最低檢出限

在小麥粉中分別加入不同含量的赤擬谷盜、雜擬谷盜和鋸谷盜蟲卵。DNA指紋技術(shù)檢測結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出赤擬谷盜蟲卵含量最低檢測限是1%。對PCR條件優(yōu)化后可以檢測出來雜擬谷盜和鋸谷盜的卵最低的可以達(dá)到0.05%。說明了DNA指紋檢測技術(shù)可以準(zhǔn)確判斷小麥粉中蟲卵的發(fā)生情況。

注：M為DL1000 Marker；1泳道為其目的基因片段；A中2～7依次為赤擬谷盜卵的含量為20%、10%、5%、3%、1%、0.5%，8為小麥粉的目的基因；B和C中2～10依次為的雜擬谷盜和鋸谷盜卵含量20%、10%、5%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%和0.05%(PCR優(yōu)化條件后檢測結(jié)果)；11為小麥粉的目的基因；CK為空白對照。圖4 小麥粉中含赤擬谷盜(A)、雜擬谷盜(B)、鋸谷盜(C)卵DNA檢測靈敏度

2.5 DNA指紋圖譜亮度與小麥粉中不同害蟲碎片含量的相關(guān)性

將占50 mg小麥粉中含有不同含量的害蟲碎片進(jìn)行DNA檢測，檢驗后的電泳條帶進(jìn)行亮度分析，得出害蟲碎片含量與電泳條帶亮度的線性關(guān)系如圖5所示。

圖5 小麥粉害蟲碎片含量與DNA電泳條帶亮度的關(guān)系

由圖5可知，DNA電泳條帶亮度(Y)與害蟲碎片含量(X)呈良好的相關(guān)關(guān)系。回歸方程為：Y=858.36X+74.540(r=0.961 9)。說明可以根據(jù)目的基因的瓊脂糖凝膠電泳條帶亮度預(yù)測小麥粉中成蟲的數(shù)量。

2.6 DNA指紋檢測方法在面粉廠成蟲檢測中應(yīng)用

為了檢驗DNA分子指紋圖譜檢測害蟲的準(zhǔn)確性，在面粉廠隨機(jī)取了7份小麥粉，用DNA指紋技術(shù)測定成蟲碎片的含量的檢測，根據(jù)實際害蟲發(fā)生的情況，利用害蟲含量與條帶亮度的關(guān)系進(jìn)行了預(yù)測，檢測值和預(yù)測值的結(jié)果比較如表2所示。

從表2可以看出：當(dāng)成蟲數(shù)量大于12以上才能檢測出條帶亮度。隨機(jī)取樣的小麥粉中害蟲的數(shù)量多，條帶亮度值越高；而且條帶亮度值隨著實際害蟲的數(shù)量增加而增加，說明了通過檢測目的基因的條帶亮度可以初步推測樣品中害蟲的感染程度。利用DNA指紋技術(shù)測定7份小麥粉樣品的害蟲含量與實際發(fā)生量相比，準(zhǔn)確率均在66.67%～80.56%。結(jié)果說明了利用DNA指紋技術(shù)測定的小麥粉害蟲含量可以預(yù)測小麥粉中害蟲的感染程度，但是檢測的準(zhǔn)確率有待提高。

表2 隨機(jī)7份小麥粉30 d后DNA指紋技術(shù)檢測和

注：表中“-”表示沒有檢測結(jié)果。

3 討論

Bennett[14]利用DNA指紋技術(shù)檢測水稻抗病蟲害的結(jié)果說明DNA指紋技術(shù)已經(jīng)提供了關(guān)于昆蟲和病原菌群體結(jié)構(gòu)獨特的信息。因此可以利用儲糧昆蟲具有基因結(jié)構(gòu)的獨特性，采用DNA指紋技術(shù)進(jìn)行害蟲的檢測。Balasubramanian等[13]設(shè)計了兩對不同的兼并引物，用DNA指紋技術(shù)研究了小麥粉中赤擬谷盜和雜擬谷盜的碎片，其結(jié)果為害蟲碎片的最低檢出限為1%。本研究采用一對通用引物可檢測小麥粉中三種不同的害蟲，實驗操作簡單、成本低廉。且幼蟲和蟲卵的檢測靈敏度顯著高于成蟲碎片的檢測。在檢測小麥粉中赤擬谷盜成蟲、幼蟲和卵時應(yīng)用的PCR擴(kuò)增條件的退火溫度是56 ℃，在檢測小麥粉中的雜擬谷盜和鋸谷盜時改良的PCR擴(kuò)增時的退火溫度分別為48和50 ℃，因此檢測出赤擬谷盜成蟲碎片時的最低檢出限為2%，而對雜擬谷盜和鋸谷盜的最低檢出限為1%。而且改良后的PCR條件可以提高幼蟲和卵的檢出限。說明了在DNA指紋技術(shù)檢測時PCR擴(kuò)增的條件優(yōu)化非常關(guān)鍵。

本研究還發(fā)現(xiàn)不同害蟲碎片含量與DNA片段電泳條帶亮度成正相關(guān)。對隨機(jī)取樣的面粉檢測結(jié)果與實際結(jié)果準(zhǔn)確率最高可達(dá)80.56%。說明DNA指紋圖譜技術(shù)可以預(yù)測小麥粉中三種害蟲感染程度，但是檢測的準(zhǔn)確率有待提高。在以后的研究中DNA指紋技術(shù)不僅可用于定性還可以提高定量的準(zhǔn)確性。在應(yīng)用中可以開發(fā)一種快速檢測的試劑盒，對于快速檢測成品糧中害蟲的發(fā)生具有重要的指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

利用DNA分子指紋圖譜技術(shù)檢測成蟲碎片、幼蟲和蟲卵檢測限分別為1%、 0.05%和1%。說明此方法可以檢測成蟲碎片、幼蟲和卵。根據(jù)不同害蟲碎片含量(X)檢測出來DNA片段電泳條帶亮度(Y)之間的關(guān)系Y=858.36X+74.540(r=0.961 9)，說明兩者存在明顯的相關(guān)性。利用DNA檢測技術(shù)檢測從面粉廠隨機(jī)抽取的樣品，發(fā)現(xiàn)實際結(jié)果和DNA檢測結(jié)果準(zhǔn)確率可達(dá)80.56%。說明可以利用DNA分子指紋圖譜技術(shù)預(yù)測小麥粉中害蟲的感染程度。