黃啟震，周 米，常 迪，李 燕，馮 妍，郭 勇，倪和民，周學(xué)軍，丁 進，王相國*

（1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.河北省三河市盛繁商貿(mào)有限公司，河北 三河 065200；3.北京熊特牧業(yè)有限公司，北京 100101）

0 前言

從19世紀60年代國際上就開始對豬凍精進行了研究，起初解凍后精子活力僅僅能達到30%，直至20世紀初，英國Polge家族將精子活力提升至60%，但仍然達不到生產(chǎn)要求，不能應(yīng)用于商品豬生產(chǎn)。我國從1970年開始進行液氮冷凍精液技術(shù)的研究和推廣，1990年以后冷凍精液逐步從顆粒型轉(zhuǎn)變?yōu)榧毠苄汀Ｓ捎谪i精子特殊的生物學(xué)特性，豬精子程序化冷凍和解凍過程中容易受到損傷，與常溫保存精液效果相比仍有很大差距。豬冷凍精液配種后，分娩率僅為40%～70%，較常溫保存精液低20%～30%；窩產(chǎn)仔數(shù)為7～10頭，較常溫精液少2～3頭，豬凍精繁殖效果一直不理想，尚未發(fā)揮積極作用。

國外很多研究報道，在稀釋液中添加糖類、抗氧化物質(zhì)、蛋白質(zhì)等對豬冷凍精液品質(zhì)具有一定的提高作用[1-2]。 國內(nèi)主要集中在冷凍方法和甘油作為冷凍保護劑方面的研究。周佳勃等[3]、李青旺等[4]和索永善等[5]均對冷凍程序、冷凍方法和甘油等抗凍劑的不同添加量對豬精子活力的影響進行了研究，其最終目的都是為了能建立起一套完善的豬精液冷凍體系。試驗對平衡液、冷凍液、稀釋液進行了優(yōu)化，分別加入了X、Y、Z成分，最大程度上減少冷凍、解凍對精子的損傷。同時對解凍溫度和解凍時間進行了優(yōu)化，系統(tǒng)研究了精子密度、精液的用量以及輸精部位對受胎率的影響。試驗成功研制出的豬冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)是養(yǎng)豬業(yè)歷史上一次顛覆性、革命性的變革，它大大提升了公豬的選種強度，使得頂級基因的應(yīng)用真正實現(xiàn)跨區(qū)域、跨國界的運營。

1 方法

1.1 對豬精液的冷凍組合液進行優(yōu)化

降溫平衡液（SF-1)：葡萄糖、乳糖、青霉素、鏈霉素、蛋黃、X成分；

冷凍液（SF-2）：葡萄糖、檸檬酸鈉、氯化鈉、青霉素、甘油、椰油單乙醇酰胺、十二烷基硫酸鈉、三乙醇胺、鹽酸、蒸餾水、Y成分；

稀釋液（SF-3)：無水檸檬酸、咖啡因、三羥甲基氨基甲烷、碳酸氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉、丙酮酸鈉、葡萄糖、Z成分；

注：試驗新研發(fā)的X、Y、Z成分為保密配方成分，專利所有權(quán)歸三河盛繁公司所有。

1.2 冷凍、解凍方法

鮮精離心，棄去上清液，加入SF-1液降溫平衡至2℃進行離心，棄去上清液后，加入適量SF-2液立即灌裝冷凍，冷凍方法是液氮熏蒸冷凍或程序冷凍儀冷凍。解凍方法是用50℃的水16 s解凍至Sf-3液進行稀釋配種。

1.3 指標測定

1）在不同的解凍溫度和解凍時間條件下解凍，檢測各時間、溫度對精液品質(zhì)的影響；

2）檢測使用SF-1對豬精液降溫平衡效果的影響，包括檢測精子活力、畸形率；

3）選用不同的精子密度，進行冷凍處理、解凍，通過對解凍后精液質(zhì)量的判斷，確定最佳冷凍精子密度（凍前精子活力約為0.84）；

4）在已加入常用降溫液的精液中（1，2，3，4），再分別加入含3%甘油的（1，2，3，4），常用降溫液即為傳統(tǒng)冷凍液（5，6，7，8），對已加入SF-1液的精液進行離心去上清液，然后加入適量SF-2液與傳統(tǒng)冷凍液（5，6，7，8）同時進行冷凍，通過測定解凍后精子質(zhì)量，比較各冷凍液之間保護效果；

5）精液解凍后，需要加入一定的稀釋液后方可進行輸精，試驗應(yīng)用相同的冷凍精液，在解凍后加入不同的稀釋液，比較常規(guī)稀釋液與SF-3液對凍后精液的影響；

6）選用法系長白，輸精兩次，采用不同的精子量進行配種，檢測受胎率以及平均窩產(chǎn)仔數(shù)；

7）確定輸精部位，分別在母豬子宮體和子宮角進行輸精；

8） 輸 精 劑 量 為 20 ml、25 ml、30 ml、35 ml、40 ml、45 ml時， 檢 測受胎率和平均窩產(chǎn)仔數(shù)。

1.4 注意事項

1.4.1 解凍條件

1）解凍室室溫為30℃以上；

2）用專用溫度計測定恒溫水浴鍋，溫度計與視線持平觀察，且溫度計處于水位中間位置不可觸碰鍋底。溫度計以百鈞達溫度計為準校正解凍流程中所用的其他溫度計。水浴鍋內(nèi)的水位高為5 cm；

3）凍精取出暴露在空氣中時間不可超過3 s，應(yīng)迅速放入水中解凍。確保凍精放入水中，不起霜，不粘連，不漂浮；

4）1ml精液解凍時保證水浴鍋總水量控制在2/3以上，在水浴鍋解凍過程中精液會有下沉情況，不要讓精液沉到水浴鍋鐵板上，可在水浴鍋底部放置兩支溫度計起到支撐作用，或用手捏住細管封口端，同時保證含有精液的部分放置在水面以下進行解凍；

5）精液細管在解凍時，眼觀無明顯裂口破損現(xiàn)象，解凍過程中出現(xiàn)空氣端進水，解凍后請不要晃動精液細管，避免水分與精液混合，應(yīng)立即用剪刀剪掉進水部分，保證含有水分的部分不能對稀釋液進行稀釋，即不會影響產(chǎn)品質(zhì)量；

6）取精液，放水中，按秒表需一氣呵成。

1.4.2 精液稀釋條件

1）將冷凍的稀釋液提前40 min放在36℃恒溫水浴鍋內(nèi)預(yù)溫。精液需稀釋到相應(yīng)品種的稀釋液中，保證稀釋液液面與水位面等高；

2）將解凍后精液細管表面的水分擦干，在36℃稀釋液內(nèi)稀釋搖勻。搖勻精液時，精液不可露出水面，且用力輕柔，不可劇烈搖晃，以免過多起沫。

1.4.3 精液鏡檢要求

在室溫30℃以上的條件下，取20ul稀釋并搖勻后的精液放在38℃恒溫板上的已恒溫的載玻片上，蓋上已恒溫的蓋玻片鏡檢。稀釋后的精液需在平均3～10 min內(nèi)鏡檢，鏡檢工作要迅速，避免細小環(huán)節(jié)造成的精子溫差休克；大白、長白精液解凍后可直接取樣放在顯微鏡下，緩3～5 min即可檢測活力；杜洛克精液解凍后在水浴鍋內(nèi)復(fù)蘇8～10 min，再取樣放在已恒溫的載玻片上緩1～2 min即可檢測活力（檢測活力：需顯微鏡調(diào)為白色柔光，顯示屏右下角放大倍數(shù)為0，微微轉(zhuǎn)動顯微鏡粗細調(diào)，將載玻片最上面一層精子調(diào)至最清晰，目測活力）。

2 結(jié)果

2.1 降溫平衡液對豬精液的影響

在相同條件下，SF-1液與BTSS、Schonow、萄-檸-EDTA、ZO等四種降溫平衡液相比，精子活力達到0.78，差異顯著（P＜0.05）。在精子畸形率方面，SF-1組顯著低于其他四組，差異顯著（P＜0.05），見表1。

2.2 SF-2液與傳統(tǒng)冷凍液對冷凍效果的影響

SF-2液與編號為5，6，7，8的冷凍稀釋液相比，精子活力、質(zhì)膜完整率以及頂體完整率顯著高于對照組，而畸形率降低到22%左右（P＜0.05），差異顯著，見表2。

2.3 SF-3液與常規(guī)稀釋液對受胎率的影響

相同條件下，研究常規(guī)稀釋液與SF-3對精子的影響，由表3可知，經(jīng)過SF-3稀釋液處理后精子活力達到0.74，與常規(guī)稀釋液相比提高了9個百分點。在受胎率方面達到90%，顯著高于常規(guī)稀釋液。

表1 降溫平衡液對豬精液的影響

表2 SF-2液與傳統(tǒng)冷凍液對冷凍效果的影響

表3 SF-3液與常規(guī)稀釋液受胎率的影響

2.4 解凍的溫度和時間對精液品質(zhì)的影響

解凍的溫度與時間對精液品質(zhì)有著至關(guān)重要的作用，試驗對0.5 ml的種豬冷凍精液進行了研究，發(fā)現(xiàn)在50℃條件下解凍16 s對精子活力、質(zhì)膜完整率、頂體完整率影響最小，精子畸形率也保持在20.2%左右的水平，見表4。

表4 解凍的溫度和時間對精液品質(zhì)的影響

2.5 精子密度對豬精液冷凍效果的影響

對不同精子密度的豬精液進行冷凍、解凍，然后檢測精液質(zhì)量，由表5可知，精子密度在4×109/mL時，精子活力、質(zhì)膜完整率、頂體完整率均顯著高于其他組，畸形率顯著低于其他組。當精子密度越來越高時，精子質(zhì)量越差。

表5 精子密度對豬精液冷凍效果的影響

2.6 冷凍精液配種最適精子量

品種均選擇法系長白，對母豬進行兩次輸精，統(tǒng)計受胎率和產(chǎn)仔數(shù)。輸精在4億精子以下時受胎率最高只能達到31%，產(chǎn)仔數(shù)僅為7頭。當輸精精子數(shù)升高至8億到12億之間時受胎率能達到90%以上，平均窩產(chǎn)仔數(shù)也在11頭以上。隨著輸精精子數(shù)的升高，受胎率和平均窩產(chǎn)仔數(shù)略有下降，見表6。

表6 冷凍精液配種最適精子量

2.7 鮮精與冷凍精液子宮體與子宮角輸精效果比較

在一次輸精40 mL、8億精子數(shù)的條件下，鮮精在子宮角或子宮體輸精在受胎率和窩產(chǎn)仔數(shù)上沒有顯著差異，但冷凍精液子宮體輸精的受胎率顯著高于在子宮角，見表7。

3 討論

冷休克是指精子在迅速冷卻時會失去活力，一般發(fā)生在精液采集后迅速至15℃、5℃或0℃時[6]。徐振軍等[7]以葡萄糖、乳糖作為基礎(chǔ)液發(fā)現(xiàn)精子存活率極顯著高于蔗糖和乳糖組，頂體完整率顯著高于其他組。金一等[8]研究表明海藻糖能抑制精子內(nèi)活性氧的發(fā)生。胡建宏等[9]發(fā)現(xiàn)添加25%的海藻糖可以明顯抑制精子獲能，當與甘油共同作用時能更加有效地保護精子。還有研究表明，在稀釋液中添加10mg/L維生素C、0.05%可溶性N-乙?；?D-葡糖胺、類透明質(zhì)酸、安鈉咖、海膽色素、2-丙羥基-β-環(huán)式糊精等可提高精子頂體完整率和質(zhì)膜完整性，保護精子活力。冰晶的形成會造成精子不可逆的傷害[10]。在冷凍保存過程中，冷凍保護劑非常重要。保護劑可以通過在細胞內(nèi)外維持一定的摩爾濃度，降低細胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細胞免受損傷[11]。甘油是目前應(yīng)用較廣泛的一種冷凍保護劑，很多研究顯示在添加2%～4%時，其解凍后精子活力和頂體完整率較高[12]。試驗使用的降溫平衡液SF-1對豬精液的降溫平衡效果有著顯著促進作用，其中含有葡萄糖、乳糖、青霉素、鏈霉素、蛋黃、X成分；冷凍液（SF-2）含有葡萄糖、檸檬酸鈉、氯化鈉、青霉素、甘油、椰油單乙醇酰胺、十二烷基硫酸鈉、三乙醇胺、鹽酸、蒸餾水、Y成分；稀釋液（SF-3)含有無水檸檬酸、咖啡因、三羥甲基氨基甲烷、碳酸氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉、丙酮酸鈉、葡萄糖、Z成分；在這些成分中，試驗添加的X、Y、Z成分對精子活力、質(zhì)膜完整率、頂體完整率、受胎率相比其他配方均起到了更明顯的促進效果，降低了精子畸形率。

表7 鮮精與冷凍精液子宮體與子宮角輸精比較

解凍的溫度和時間在冷凍精液中也尤為重要。Watson[13]發(fā)現(xiàn)精液解凍溫度與精子對“冷凍-解凍”溫度驟變的敏感性有關(guān)。鄭筱峰等[14]的研究表明，37℃水浴30 s解凍法與室溫20 s后于37℃水浴10 s解凍法相比對精子的損害程度更低。試驗研究表明， 0.5 mL的種豬冷凍精液，在16 s解凍條件下，使用50℃的解凍溫度效果最好。

精子密度對精子的活力有較大影響，生產(chǎn)中要控制精子密度。輸精量可在有限范圍內(nèi)波動，但過多的輸精量會增加成本，所以每次輸精精子數(shù)控制在8億～12億之間最佳。夏天等[15-16]研究表明，采用深部輸精技術(shù)可以使精液快速、大量地進入母豬子宮角，提高窩均產(chǎn)活仔數(shù)1.36頭。使用鮮精和冷凍精液分別進行試驗，研究發(fā)現(xiàn)鮮精在子宮角或子宮體輸精差異不顯著；但當使用冷凍精液時，在子宮體的受胎率和窩產(chǎn)仔數(shù)顯著提高。雖然輸精時采取了各種預(yù)防消毒措施，子宮角輸精還是容易造成子宮感染，導(dǎo)致母豬不孕，曾有報道子宮角輸精時導(dǎo)致的子宮炎癥高達20%。因此，輸精時選用子宮體輸精最佳。

4 結(jié)論

試驗通過新研發(fā)的豬精液稀釋液配方，豬精液冷凍、解凍程序，大幅度提高了冷凍精液的活力，降低了畸形率。確定了最適精子密度、單次輸精量以及最佳輸精部位，有效地增加了受胎率和平均窩產(chǎn)仔數(shù)，放大了頂級基因的遺傳效益，降低了公豬引種和飼養(yǎng)成本，杜絕了多種疫病的垂直傳播，為加快育種進程提供了堅實的技術(shù)支持。