茍知賢，魯利群

1.成都醫(yī)學(xué)院(成都 610500); 2.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 兒科(成都 610500)

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)發(fā)病率在發(fā)達國家為1‰～8‰，發(fā)展中國家則高達26‰[1]。我國每年大約新增4～5萬名HIE患兒[2]。新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是導(dǎo)致新生兒死亡及永久性神經(jīng)功能障礙的主要原因之一，目前尚無十分有效的治療方法。近年約15%～25%HIE患兒死亡，超過25%HIE患兒留下永久性神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，如腦癱、癲癇、精神發(fā)育遲滯和視覺障礙[3]。目前，亞低溫是唯一被循證醫(yī)學(xué)證實的有效治療方法，但只適用于足月中重度HIE患兒，且治療時間窗極短(通常為生后6 h內(nèi)，3 h最佳)。但受亞低溫治療的HIE患兒仍有近一半留下了后遺癥[4]。因此，繼續(xù)尋求安全有效的治療方法一直是新生兒科醫(yī)生努力的方向。近年來，有研究報道褪黑素可通過抗氧化、抗炎和抑制程序性細胞死亡等途徑發(fā)揮較好的神經(jīng)保護作用。褪黑素治療新生兒HIBD的有效性及安全性逐漸受到關(guān)注，其可能是有效治療HIBD的潛在藥物。本文就褪黑素治療HIBD的有效性、安全性及其可能的機制作一綜述。

1 褪黑素

褪黑素(melatonin)是一種主要由松果體分泌的內(nèi)源性吲哚類激素，化學(xué)名為N-乙?；?5甲氧基色胺，于1958年從綿羊松果體分離得到，因其可以改變青蛙膚色而得名[5]。褪黑素在皮膚、視網(wǎng)膜、小腦、腎臟、肝臟、胰腺和卵巢等其他組織器官中也有合成，但合成量通常較少[6]。既往研究[7]認為，褪黑素主要作用于視交叉神經(jīng)上核中的MT1和MT2受體，參與晝夜節(jié)律和季節(jié)節(jié)律的調(diào)節(jié)。但近年研究[8]發(fā)現(xiàn)，褪黑素具有多種生物學(xué)功能，如協(xié)調(diào)能量代謝、增強免疫、延緩衰老、抗氧化應(yīng)激和抗炎功能，甚至可抑制癌癥的進展。因其具有脂溶性高、易于通過血腦屏障和細胞膜、毒性低等優(yōu)點，逐漸被認為是一種有前景的神經(jīng)保護藥物，用于治療各種急性和慢性腦損傷[9]。

2 褪黑素治療HIBD

2.1 有效性

近年來，越來越多的證據(jù)表明褪黑素是有效的神經(jīng)保護劑，可改善HIBD的預(yù)后。Lekic等[10]研究顯示，褪黑素是有效的抗氧化劑，可以降低嬰兒腦出血后精神發(fā)育遲滯和腦癱的發(fā)生率。Husson等[11]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可通過抑制腺苷酸環(huán)化酶保護小鼠腦室周圍白質(zhì)免受興奮性中毒改變，且腹腔注射褪黑素干預(yù)可使鵝膏蕈氨酸誘導(dǎo)的白質(zhì)囊腫(大小)減小82%，提示褪黑素可增強腦白質(zhì)損傷的修復(fù)能力。Pazar等[12]用腹腔注射苯肼鹽酸鹽(PHZ; 75 mg/kg)誘導(dǎo)的溶血性高膽紅素腦病大鼠模型，研究褪黑素的神經(jīng)保護作用，在第1次和第2次腹腔注射PHZ 0.5 h前及第2次腹腔注射PHZ后24 h分別給予生理鹽水或褪黑素(10 mg/kg)治療，實驗結(jié)果顯示，褪黑素治療組與生理鹽水治療組相比，大鼠海馬區(qū) TUNEL染色陽性細胞數(shù)明顯減少，表明褪黑素對溶血和高膽紅素血癥大鼠腦神經(jīng)元有抗凋亡作用。Aly等[13]進行的一項前瞻性研究共納入45名新生兒，其中HIE患兒30名，健康對照新生兒15名。將30名HIE患兒隨機分為亞低溫治療組(n=15，接受72 h亞低溫治療)和褪黑素/亞低溫治療組(n=15，亞低溫治療72 h+褪黑素10 mg/kg·d，連續(xù)5 d)。結(jié)果顯示，兩組患兒血清褪黑素、超氧化物歧化酶(SOD)和一氧化氮(NO)均升高。治療第5天，褪黑素/亞低溫治療組較單獨亞低溫治療組血清褪黑素水平明顯升高(P<0.001)，NO明顯下降(P<0.001)，每兩周隨訪的腦電圖顯示癲癇發(fā)作減少，MRI顯示腦白質(zhì)異常減輕。在6個月時，褪黑素/亞低溫組存活率更高，且無神經(jīng)系統(tǒng)或發(fā)育的異常。這些研究均提示褪黑素可能是治療HIBD的潛在藥物，有望進入臨床。

2.2 安全性

人體研究[13]已證明褪黑素的毒性非常低，且副作用可忽略不計，可用于治療兒童學(xué)習(xí)障礙、注意力不集中/多動障礙、慢性睡眠障礙及新生兒呼吸窘迫綜合癥等疾病。動物實驗[14]亦表明，即使從孕鼠妊娠6～19 d每天均給予其高劑量的褪黑素(200 mg/ kg·d)干預(yù)，對新生大鼠也無任何致畸等副作用。新生仔豬發(fā)生HIBD 6h后立即給予褪黑激素30 mg/kg(其為治療兒童睡眠紊亂劑量的100倍)，仔豬心率、血壓等生理指標也無明顯改變[15]。然而，有部分學(xué)者對褪黑素抑制前列腺素合成及內(nèi)分泌功能等方面仍有顧慮，且有一項關(guān)于接受褪黑素治療神經(jīng)損傷時癲癇發(fā)作閾值降低的報道[16]。目前，研究中涉及的新生兒數(shù)量很少，其治療HIBD的安全性仍需更多大樣本隨機對照實驗進一步驗證[13]。

3 褪黑素治療新生兒HIBD可能的機制

3.1 抗氧化應(yīng)激

缺氧缺血可導(dǎo)致神經(jīng)元線粒體內(nèi)膜受損，鈣通過受體調(diào)節(jié)通道和電壓門控通道流入神經(jīng)元增多，從而激活脂肪酶、蛋白酶，尤其是花生四烯酸的激活可導(dǎo)致游離脂肪酸的釋放，引起還加氧酶激活和前列腺素生成，最后導(dǎo)致超氧自由基的產(chǎn)生[17]。而自由基具有高反應(yīng)性，且通常引發(fā)連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致廣泛的分子損傷，如脂質(zhì)過氧化，蛋白質(zhì)片段化及DNA結(jié)構(gòu)破環(huán)等，特別是新生兒不成熟的大腦更易受到自由基的損傷[18]。這可能是HIBD后遲發(fā)性細胞死亡的重要原因。

褪黑素被歸類為線粒體靶向抗氧化劑，可作為對抗自由基的“防火墻”[19]。且其代謝產(chǎn)物，如5-甲氧基色胺(5-MT)、環(huán)狀3-羥基褪黑素(c3OHM)、N1-乙?；?N2-甲?；?5-甲氧基喹啉 (AFMK)和N1-乙?；?5-甲氧基喹啉(AMK)及直接前體N-乙酰血清素(NAS)均可單獨發(fā)揮抗氧化作用[20]。因此，褪黑素及其代謝產(chǎn)物對氧化損傷的保護是連續(xù)、良性的過程，可以使多種氧化劑失活，其抗氧化作用可能會隨著代謝而增強和多樣化。它們主要通過以下途徑發(fā)揮抗氧化作用：1)通過電子轉(zhuǎn)移、氫轉(zhuǎn)移、自由基加合物形成等途徑與自由基直接反應(yīng)，產(chǎn)生較少的活性物質(zhì)，避免自由基的連鎖反應(yīng)；2)通過螯合不同的金屬離子起到羥基自由基配體失活作用，并顯著減少了 Cu(Ⅱ)、Fe(Ⅱ)、 Zn(Ⅱ)、Al(Ⅲ)、 Mn(Ⅱ) 和 β-淀粉樣肽相互作用產(chǎn)生的自由基，也可抑制Cu介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化及Cu(Ⅱ)/H2O2誘導(dǎo)的蛋白損傷；3)通過電子轉(zhuǎn)移再生谷胱甘肽、抗壞血酸等抗氧化物，也可通過電子轉(zhuǎn)移途徑將尿苷自由基轉(zhuǎn)移至鳥苷，修復(fù)氧化的DNA；4)激活抗氧化酶，抑制促氧化酶，增強DNA的修復(fù)[6]。

3.2 抗炎

小膠質(zhì)細胞是大腦中的常駐免疫細胞，缺氧缺血可導(dǎo)致其激活，并釋放促炎因子、促炎介質(zhì)和趨化因子，這些細胞因子可吸引白細胞至損傷區(qū)域，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[21]。Balduini等[22]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可抑制HIBD大鼠小膠質(zhì)細胞激活，減少大腦皮質(zhì)中炎癥細胞募集。Radogna等[23]指出，褪黑素可抑制磷脂酶A2(PLA2)、脂氧合酶(LOX)和環(huán)氧合酶1(COX-1)等炎癥衍生物的激活，從而減輕神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)。另外，Deng等[24]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素及其代謝產(chǎn)物(如AFMK、AMK等)均具有抗炎作用，可下調(diào)TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子，并抑制環(huán)氧合酶和前列腺素的表達。

NO是由一氧化氮合酶(NOS)催化產(chǎn)生的自由基。NOS分內(nèi)皮型(eNOS)、誘導(dǎo)型(iNOS)和神經(jīng)型(nNOS)3種。在缺氧缺血早期階段，再灌注/復(fù)氧可激活eNOS和nNOS，從而促進NO的釋放。在晚期階段，小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞和中性粒細胞中的iNOS上調(diào)，導(dǎo)致NO持續(xù)產(chǎn)生[25]。而 NO在炎癥過程中發(fā)揮了重要作用。研究[26]表明，在阻斷大腦中動脈造成的大腦缺血模型中，褪黑素可下調(diào) nNOS 和iNOS水平、上調(diào)eNOS 水平，并減少大腦的梗死體積。在肝臟缺血/再灌注損傷小鼠模型中，褪黑素亦能下調(diào)iNOS表達水平及NO產(chǎn)生，降低 TNF-α水平[27]。

3.3 抑制程序性細胞死亡

3.3.1 抑制凋亡 細胞凋亡參與新生兒腦損傷，并在遲發(fā)性神經(jīng)元死亡中發(fā)揮重要作用。細胞凋亡從缺氧缺血早期開始，可持續(xù)數(shù)天至數(shù)周。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)在細胞凋亡中具有中心作用，而caspase-3在缺氧缺血后成高表達狀態(tài)。Aridas等[28]在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，缺氧后處理及臍帶血細胞治療可通過抑制Caspase-3的活性來抑制神經(jīng)元凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。研究[29]顯示，褪黑素亦可抑制Caspase-3的激活，下調(diào)B細胞淋巴瘤2相關(guān)的啟動子(Bad)和B細胞淋巴瘤2相關(guān)的X蛋白(BaX)等促凋亡蛋白，并減少了TUNEL染色陽性神經(jīng)元數(shù)量，從而通過抗凋亡途徑發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

3.3.2 抑制自噬 自噬是一種自我降解過程，包括去除錯誤折疊的蛋白質(zhì)，清除受損的細胞器和病原體。其對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的細胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。然而，過度的自噬可誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡和壞死。LC3是自噬的特異性標志物，其在HIBD模型皮質(zhì)神經(jīng)元胞質(zhì)中高表達，而褪黑素治療可顯著減少LC3表達陽性神經(jīng)元的數(shù)量。通過免疫印跡技術(shù)進一步分析發(fā)現(xiàn)，褪黑素顯著抑制了LC3-Ⅰ 向 LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化過程[30]。P62是通過自噬-溶酶體途徑降解的特異性底物，細胞內(nèi)P62水平的降低可作為自噬通量的指示。研究[30-31]表明，神經(jīng)元P62在缺氧缺血12 h后明顯降低，而褪黑素可以有效逆轉(zhuǎn)這種降低。這些結(jié)果提示缺氧缺血可誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)生自噬，而褪黑素可以通過抑制自噬發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

3.3.3 抑制焦亡 NLRP3炎性小體是由多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體，通過調(diào)節(jié)Caspase-1活化，促進pro-IL-1β和pro-IL-18切割成熟，繼而引起細胞焦亡。近年的研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎性小體在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起到關(guān)鍵的作用。研究[32]報道，腦缺氧缺血可使NLRP3 表達上調(diào)，并激活 NLRP3 炎癥體，發(fā)生炎性過程。通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)，NLRP3、 Caspase-1的表達在 HIBD 后升高，且 Caspase-1 抑制劑能阻遏神經(jīng)元死亡，減輕神經(jīng)系統(tǒng)損傷。Ortiz等[33]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可抑制NLRP3炎癥小體的激活，從而對輻射誘導(dǎo)的小鼠口腔黏膜損傷產(chǎn)生良好的治療效果。此外，Zhang 等[34]在高脂飲食誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，褪黑素可通過MEG3/miR-223/NLRP3信號通路抑制血管內(nèi)皮細胞焦亡，對動脈粥樣硬化發(fā)揮了良好的治療作用。

3.3.4 其他 褪黑素可通過調(diào)節(jié)水腫相關(guān)蛋白(如AQP4、ZO-1和Occludin)減輕HIBD后腦和外周組織的水腫[35]。另外，褪黑素可通過PLC/ IP3/ Ca2+信號通路促進腦源性神經(jīng)生長因子的釋放，從而發(fā)揮腦保護作用[36]。

4 總結(jié)與展望

隨著圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，新生兒窒息的發(fā)生率已明顯下降，但因重度窒息而導(dǎo)致的HIBD仍是新生兒死亡及小兒致殘的主要原因之一，給患兒家庭和社會帶來了嚴重的精神及經(jīng)濟負擔(dān)。但HIBD的發(fā)病機制十分復(fù)雜，可能是能量耗竭、氧化應(yīng)激和炎癥激活等多種因素相互作用的結(jié)果，這也是導(dǎo)致HIBD治療策略發(fā)展緩慢的重要原因。近年來，褪黑素以較好的抗氧化、抗炎、抑制程序性細胞死亡及低毒性等多種優(yōu)良性能逐漸受到廣大研究者的關(guān)注。此時，進一步研究褪黑素治療HIBD的有效性、安全性及具體作用機制意義重大。

綜上所述，褪黑素可通過抗氧化、抗炎和抑制神經(jīng)元死亡等多種途徑發(fā)揮良好的神經(jīng)保護作用。但目前關(guān)于褪黑素與HIBD的研究結(jié)果大多來自實驗室，且具體機制仍不十分清楚。對褪黑素抗凋亡、自噬及焦亡等神經(jīng)元死亡機制的進一步深入研究，有可能為治療HIBD提供新的靶點，同時也為褪黑素進入臨床實驗提供更多的理論基礎(chǔ)。