丁小潔，劉 艷，陳 燕，王 理，熊 芬

川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 皮膚科(南充 637000)

黑色素瘤是一種常發(fā)生于皮膚的惡性腫瘤，白種人較有色人種多見。我國黑色素瘤發(fā)病率較低，但近年來黑色素瘤發(fā)病率也逐漸升高[1]。組蛋白去乙酰化酶抑制劑：辛二酰-雙羥肟酸(suberoyl bis-hydroxamic acid, SBHA)能夠抑制細胞中組蛋白酶去乙?；?，可選擇性抑制腫瘤細胞的生長而對正常細胞無效[2]。本實驗研究SBHA對黑色素瘤B16細胞增殖及對細胞內(nèi)Akt、p-Akt、PTEN 3種蛋白表達的影響，并探討SBHA的抗腫瘤機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與藥品

高速冷凍離心機：美國Eppendorf公司；CO2培養(yǎng)箱：日本Sanyo公司；培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、6孔培養(yǎng)板：美國Corming公司；胰蛋白酶：美國AMERSCO公司；MTT：武漢生命技術(shù)有限公司；胎牛血清：進口分裝，美國Thermo Fisher scientific 公司；二甲基亞砜(DMSO)：美國Sigma公司；PBS緩沖液：自配；青霉素和鏈霉素均購自東北制藥股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 黑色素瘤B16細胞來源于ATCC(美國國立細胞庫)。將小鼠黑色素瘤B16細胞接種于培養(yǎng)瓶中，使用含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 U/mL的RPMI-1640培養(yǎng)液，放置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱，濕度相對飽和的條件下培養(yǎng)[3]。B16細胞屬于單純貼壁生長類細胞，換液2 d/次，等到細胞長至瓶壁面積85%左右，用胰酶消化后傳代，大約3 d傳代1次。取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 藥物處理 SBHA以二甲基亞砜(DMSO)溶解后儲存于-20 ℃冰箱，儲存濃度為10 mmol/L。最終用于細胞的工作濃度中DMSO濃度<0.05%。

1.2.3 MTT法測定細胞增殖能力 采用MTT法檢測黑色素瘤B16細胞的增殖能力和細胞活性。黑色素瘤B16細胞種植于96孔板中培養(yǎng)24 h。再分別加入0(空白對照)、20、40、100、200 μmol/L SBHA和等體積的DMSO溶液，然后用培養(yǎng)液調(diào)整體積至100 μL， 設(shè)置3個重復(fù)孔。培養(yǎng)48、72 h后于各孔細胞中分別加入30 μL MTT溶液(5 mg/mL)，吸棄各組細胞的培養(yǎng)液并加入10 μL DMSO進行溶解。在450 nm波長下用全波長酶標儀測定光密度(OD)值，繪制增殖曲線。

1.2.4 Western Blot法分析SBHA對B16細胞Akt、p-Akt、PTEN蛋白表達的影響 收集各組B16細胞，裂解細胞提取蛋白，根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量制備不同濃度的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣量50 g，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗及相應(yīng)二抗(稀釋度1∶500)37 ℃孵育1 h，NBT/BCIP顯色30 min。圖像經(jīng)Uyp rdb-it lmage軟件采集，Gel works ID advanced V4d軟件測定條帶的A值，取其與β-actin的比值為相對A值。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度SBHA對B16細胞增殖能力的影響

SBHA作用48 h后，細胞活力隨著SBHA濃度增加而下降(P<0.05)；與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SBHA作用72 h后，對細胞活力的抑制作用明顯比48 h抑制作用增強，在給藥72 h藥物濃度為200 μmol/L時抑制作用達到最大(P<0.05)，IC50值為 (43.50±0.98)μmol/L(表1)。

表1 不同濃度SBHA對B16細胞增殖能力的影響

注：與0 μmol/L(對照)比較，#P<0.05

2.2 不同濃度SBHA對B16細胞Akt、p-Akt、PTEN蛋白表達的影響

不同濃度的SBHA均對B16細胞Akt的表達具有抑制作用，與對照組比較，B16細胞Akt的表達量隨著SBHA濃度的增加而呈現(xiàn)下降趨勢，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。72 h后B16細胞Akt的表達量下降趨勢較48 h后更為明顯(P<0.05)。不同濃度的SBHA均對B16細胞PTEN的表達具有促進作用。與對照組比較，B16細胞PTEN的表達量隨著SBHA濃度的增加而呈現(xiàn)增長趨勢，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且72 h后B16細胞PTEN表達量的增長趨勢較48h后更為明顯。不同濃度的SBHA均對B16細胞p-Akt的表達具有抑制作用，B16細胞p-Akt的表達量隨著SBHA濃度的增加而呈現(xiàn)下降趨勢，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。72 h后B16細胞p-Akt的表達量下降趨勢較48 h后更明顯(表2)。

表2 不同濃度SBHA對B16細胞Akt 、p-Akt、PTEN蛋白表達的影響

注：與0 μmol/L(對照)比較，#P<0.05

3 討論

黑色素瘤在臨床上較為常見，主要好發(fā)于皮膚與黏膜。近年來其發(fā)病率增長較快，年增長率3%～5%[4]。據(jù)統(tǒng)計2010年全球黑色素瘤新發(fā)病例近20萬，死亡例數(shù)近5萬例。以往我國黑色素瘤發(fā)病率并不高，但是近年來每年新發(fā)病例約2萬例，發(fā)病率成倍增長，不得不引起我們的重視[5]。一般認為黑色素瘤的發(fā)病機制與長時間暴露于日光中的紫外線有關(guān)，太陽光中的UVA與UVB可誘導(dǎo)黑色素細胞中的某種基因突變，導(dǎo)致發(fā)病。也有研究[6]表明，UVA也可以殺傷免疫細胞，降低人體的免疫功能，從而導(dǎo)致腫瘤的加速形成。但也有很多臨床患者，發(fā)病部位在平時不能夠接受紫外線照射的地方。因此，目前黑色素瘤發(fā)病機制尚不明確。

腫瘤從發(fā)生、發(fā)展到轉(zhuǎn)移整個過程均是多基因、多步驟的調(diào)控結(jié)果。當細胞中的原癌基因和抑癌基因表達平衡被打亂時，就可能導(dǎo)致細胞過度增殖或細胞凋亡減少。SBHA作為一種組蛋白乙?；敢种苿軌蛟谡婧思毎虻霓D(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要的作用，多項研究[7-9]均表明，SBHA對腫瘤的生長具有抑制作用。一項研究[10]發(fā)現(xiàn)，不同濃度的SBHA均對細胞的生長有抑制作用，且其能夠誘導(dǎo)白血病細胞的凋亡，下調(diào)相關(guān)凋亡蛋白的表達，抑制白血病細胞的增殖，從而達到抑制腫瘤的目的。楊新苗等[11]在另一項研究中發(fā)現(xiàn)，不同濃度的SBHA均能抑制人乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，引起比周期G0-G1期阻滯，說明SBHA能夠?qū)Π籽　⑷橄侔┑饶[瘤細胞發(fā)揮作用，抑制細胞的增殖，促進細胞的凋亡，但對于SBHA對黑色素細胞作用的相關(guān)研究目前較少。

因此，本實驗研究了不同濃度SBHA對細胞的增殖及Akt、p-Akt、PTEN蛋白表達的影響。Akt是PI3K下游的關(guān)鍵效應(yīng)分子，能夠調(diào)控細胞周期、激活端粒酶活性、促進血管生成等，在很多腫瘤細胞中均發(fā)現(xiàn)了Akt的過度表達，而本次研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的SBHA對黑色素B16細胞Akt的表達均有一定的抑制作用，且與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；除Akt外，黑色素B16細胞中P-Akt的表達含量也有所減少，可能是由于細胞中表達的Akt含量大幅度減少后，所以發(fā)生磷酸化的Akt也隨之相應(yīng)減少。PTEN是一種均有磷酸酶活性的抑癌基因，其不僅能夠參與凋亡，還具有生長抑制功能，能夠促進PIP3去磷酸化，來減弱其信號，從而達到抑制Akt的功能。本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著SBHA濃度的增加，黑色素B16細胞中PTEN的表達含量也隨之增加，且與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述， SBHA能夠有效抑制細胞增殖，其機制可能是通過上調(diào)PTEN蛋白的表達并抑制Akt、p-Akt蛋白的表達實現(xiàn)的。但本研究對SBHA是否對細胞增殖抑制具有特異性、敏感性和抑制程度等尚沒有詳細的研究，因此需要更深層次研究證實，希望通過更多多中心研究尋找效果最優(yōu)、危害最小的抑癌細胞生長藥物。