賈冬麗，方麗麗，司曉輝，王遠菊

子宮內(nèi)膜癌約占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的三分之一，且發(fā)病率呈上升趨勢[1-2]，嚴重威脅女性健康。該病發(fā)生涉及多基因、多步驟、多信號通路。黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)作為非受體蛋白酪氨酸激酶超家族成員，參與調(diào)控細胞增殖、生長、分化過程[3-4]，近年來研究發(fā)現(xiàn)[5]，F(xiàn)AK在多種惡性腫瘤組織中表達升高，且參與了腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移、增殖、凋亡過程。本研究利用小分子干擾RNA(small interference RNA，siRNA)技術(shù)下調(diào)FAK基因表達，觀察對人子宮內(nèi)膜癌細胞HEC-1A增殖、遷移和侵襲能力的影響。

1 資料與方法

本研究起止時間為2016年8月3日至2017年1月16日。

1.1主要試劑和設(shè)備人子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細胞購自中科院上海生命科學(xué)研究院，胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、胰酶均購自美國Gibco公司，總RNA提取試劑盒(Trizol法)和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒由美國Invitrogen公司提供，逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒均購自武漢凌飛生物有限公司，F(xiàn)AK及內(nèi)參引物均由上海生工生物公司設(shè)計合成，F(xiàn)AK干擾序列(siRNA-FAK)、陰性對照序列均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成，MTT液購自上海將來實業(yè)股份公司，Transwell小室購自美國Corning公司，RIPA裂解液購自碧云天生物公司，磷酸酶抑制劑購自美國Sigma公司，兔抗FAK多克隆抗體購自武漢博士德公司，兔抗Akt單克隆抗體購自美國CST公司，兔抗磷酸肌醇3激酶(PI3K)單克隆抗體、兔抗磷酸化(p)-Akt多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司，兔抗哺乳動物雷帕霉素(mTOR)靶蛋白、p-mTOR多克隆抗體購自美國Cell signaling公司，StepOnePlus實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及處理 將細胞放于DMEM/F12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中，培養(yǎng)于含5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱。細胞融合度>70%時，傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，按試劑盒說明對細胞分組轉(zhuǎn)染：1siRNA-FAK組，轉(zhuǎn)染FAK特異性siRNA序列正義鏈為5’-CGCGTCGTAATACTCGCTCCATTGCACCTTGATATCCGGGTGCAATGGAGCGAGTATTATTTTTT-CCAAC-3’，反義鏈為5’-GCGGTGGACCCGGTCATAATAAAGTTCTGCTATTATGACCGGGTCCACC-AAAAAACAGCTGTTCGA-3’；2siRNA-陰性對照組，轉(zhuǎn)染siRNA-陰性對照序列正義鏈為5’-CGCGTCG-CCACTTACGATAGCTCCATTCTTGATATCCGGAAT-GGAGCTATCGTAAGTGGTTTTTTCCAAC-3’，反義鏈為5’-GATCCCCACCTGGGCCAGTATTATTTCAAGACGATAATACTGGCCCAGGTGGTTTTTTGTCGACA-3’；3空白對照組，不作任何處理。

1.2.2實時熒光定量PCR技術(shù)檢測細胞中FAK基因表達 各轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，按照用Trizol法提取試劑盒說明提取總RNA，檢測純度。逆轉(zhuǎn)錄為模板單鏈cDNA，以cDNA為模板行PCR。引物序列：FAK上游為5’-TCCTAATGTTG ATGCCTGCC-3’，下游為5’-CCTTGAAAAGGCTTCACACC-3’；GAPDH上游為5’-TCCGGGTGATGCTTTTCCTAG-3’，下游為5’-TTTGCGGTGGAAATGTCCTTTTC-3’。反應(yīng)條件：92 ℃ 1 min，92 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，75 ℃ 30 s。循環(huán)38次，均設(shè)平行復(fù)孔3個。FAK基因相對表達量計算采用2-△△Ct法[6]。

1.2.3MTT法檢測細胞增殖能力 將各組細胞離心后，重懸細胞，于96孔板接種(密度5×104個/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)，于12 h、24 h、48 h、72 h、96 h時，向各孔加入MTT液(5 mg/mL)20 μL，孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心的將孔內(nèi)上清液吸棄，將150 μL二甲基亞砜加入各孔，振蕩15 min，待結(jié)晶物完全溶解后，利用酶標儀檢測各孔在570 nm波長處的吸光度A值。重復(fù)實驗6次[7-8]。

1.2.4Transwell法檢測細胞遷移能力 各組細胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，離心，留沉淀，用無血清培養(yǎng)基重懸，加入到Transwell小室上室(密度為1×105個/孔)，下室加入含有15%胎牛血清的培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)24 h，取出小室，將散落的細胞去除，PBS沖洗3次，固定，結(jié)晶紫染色，用倒置顯微鏡觀察，隨機取5個視野對細胞計數(shù)，每組細胞設(shè)置3個平行復(fù)孔，重復(fù)實驗6次[9]。

1.2.5Transwell法檢測細胞侵襲能力 將 Martrigel基質(zhì)膠稀釋后鋪于小室上室，過夜風(fēng)干。其余步驟同1.2.4。

1.2.6蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測細胞中FAK、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達 各組細胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，用預(yù)冷的RIPA裂解液和磷酸酶抑制劑分別提取總蛋白并檢測純度。取總蛋白30 μL，進行10%聚丙烯胺凝膠電泳，電至PVDF膜上，用3%牛血清白蛋白室溫下封閉60 min，TBST沖洗3次，加入一抗FAK、PI3K、p-Akt、p-mTOR(稀釋比例1∶1 000、1∶800、1∶1 200、1∶500)，4 ℃過夜孵育，TBST沖洗3次，將二抗加入，37 ℃孵育60 min，用TBST沖洗3次，暗室下用ECL反應(yīng)15 min，用Image J軟件分析，計算細胞中FAK、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達量[10]。

表1 各組細胞增殖能力(A值)比較/±s

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與siRNA-陰性對照組比較，bP<0.05

2 結(jié)果

2.1FAK基因在各組細胞中表達FAK mRNA在siRNA-FAK組細胞中相對表達量為(1.31±0.15)，顯著低于siRNA-陰性對照組和空白對照組，分別為(2.06±0.18)和(2.11±0.20)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=53.294，P<0.001)。

2.2細胞增殖能力siRNA-FAK組、siRNA-陰性對照組和空白對照組12 h時細胞吸光度A值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.626)。siRNA-FAK組、siRNA-陰性對照組和空白對照組24 h、48 h、72 h和96 h時細胞吸光度A值均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.005)；與siRNA-陰性對照組和空白對照組比較，siRNA-FAK組24 h、48 h、72 h、96 h時細胞吸光度A值均降低，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1和圖1。

圖1 各組細胞增殖能力比較

組別平行復(fù)孔數(shù)遷移細胞數(shù)侵襲細胞數(shù)空白對照組3123.6±15.4140.2±14.3siRNA-陰性對照組3119.5±14.8137.8±13.5siRNA-FAK組379.6±11.7ab91.5±10.6abF值20.31219.517P值<0.001<0.001

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與siRNA-陰性對照組比較，bP<0.05

2.3細胞遷移和侵襲能力siRNA-FAK組、siRNA-陰性對照組和空白對照組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；與siRNA-陰性對照組和空白對照組比較，siRNA-FAK組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均減少，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.005)，詳見表2、圖2、圖3。

2.4細胞中FAK、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達siRNA-FAK組、siRNA-陰性對照組和空白對照組FAK、PI3K、AKT、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白相對表達量均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；siRNA-陰性對照組與空白對照組FAK、PI3K、AKT、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白相對表達量均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.694、0.262、0.623、0.541、0.645、0.731)；與siRNA-陰性對照組和空白對照組比較，siRNA-FAK組細胞中FAK、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達相對表達量均降低(P<0.005)，而Akt和mTOR蛋白相對表達量均升高(P<0.005)，詳見表3和圖4。

表3 各組細胞中FAK、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達比較/±s

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與siRNA-陰性對照組比較，bP<0.05

圖4 各組細胞中FAK、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達

3 討論

子宮內(nèi)膜癌好發(fā)于絕經(jīng)后女性，但近年來出現(xiàn)年輕化趨勢[11]，雖然現(xiàn)在子宮內(nèi)膜癌病人生存時間得到延長，但其高復(fù)發(fā)率、高病死率仍嚴重威脅病人預(yù)后[12-13]。研究表明[14]，腫瘤發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移、侵襲涉及諸多基因、步驟和通路。FAK作為一種廣泛存在于細胞質(zhì)內(nèi)的非受體蛋白酪氨酸激酶，是整合素信號家族中重要的信號因子[15]，與多種細胞生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[16]。研究表明[17]，F(xiàn)AK高表達于多種惡性腫瘤組織中，參與了腫瘤發(fā)生、進展、侵襲過程。Zhou等[18]指出，F(xiàn)AK在子宮內(nèi)膜癌組織中呈高表達，且與病人總生存期降低顯著相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，siRNA-FAK組細胞中FAK mRNA和蛋白相對表達量均降低，提示利用siRNA技術(shù)可成功將HEC-1A細胞中FAK基因表達抑制。

MTT實驗結(jié)果顯示，與siRNA-陰性對照組和空白對照組比較，siRNA-FAK組24 h、48 h、72 h、96 h時細胞吸光度A值降低，說明沉默F(xiàn)AK基因細胞增殖活力被抑制，提示該基因與細胞增殖過程密切相關(guān)。本研究顯示，與siRNA-陰性對照組和空白對照組比較，siRNA-FAK組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)減少，說明在沉默F(xiàn)AK基因表達后細胞遷移和侵襲能力被抑制，提示該基因可能與細胞遷移和侵襲過程關(guān)系密切[19]。PI3K/Akt/mTOR作為與腫瘤增殖、侵襲轉(zhuǎn)染密切相關(guān)的信號通路，在多種惡性腫瘤組織中表達異常[20]，有研究指出[21]，PI3K/Akt/mTOR信號通路異?；罨梢种颇[瘤細胞凋亡，促進細胞增殖，加快細胞侵襲、轉(zhuǎn)移過程。本研究顯示，在抑制FAK基因表達后，siRNA-FAK組細胞中PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達相對表達量均降低，說明特異性抑制HEC-1A細胞中FAK基因可顯著抑制PI3K/Akt/mTOR信號活化，提示FAK基因可能通過PI3K/Akt/mTOR信號而參與子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、遷移及侵襲過程。

綜上所述，沉默F(xiàn)AK基因可減少HEC-1A細胞增殖，抑制細胞遷移及侵襲，其機制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號有關(guān)，有望為子宮內(nèi)膜癌基因治療提供潛在的靶位。

(本文圖2，3見插圖1-2)