趙文娜，惠 先，董旺青，謝人明，張愛軍，王清暉*

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，西安 710004；2.西北大學(xué)陜西省生物醫(yī)藥重點實驗室，西安 710069)

化生平合劑由黃芪、丹參、虎杖、桃仁、莪術(shù)、雞內(nèi)金、白花蛇舌草、三七和白芨等十二味中藥制成，具有補氣活血、清熱解毒的功效，對慢性淺表胃炎、慢性萎縮性胃炎、胃腸腺化生及不典型增生等癥療效確切。對其藥理及臨床療效的研究已有相關(guān)報道[1-2]，為了進一步探索其藥理作用機制，本文采用幽門結(jié)扎法[3-4]建立大鼠急性胃損傷模型，探討化生平合劑對其胃液量、胃酸排出量、胃泌素(GAS)和白介素-8(IL-8)的影響及胃黏膜損傷修復(fù)的作用，為臨床研究提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 小動物麻醉機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；TGL 16G型離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Leitz 1512型旋轉(zhuǎn)式切片機(德國LEITZ 公司)；Sartorius BT 25S型精密分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；DW-26L262型低溫保存箱 (青島海爾股份有限公司)；Olympus DP-71型顯微鏡 (日本Olympus公司)。

1.2試藥 化生平合劑 (西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，批號170418)；西咪替丁片(山西同達藥業(yè)有限公司，批號160904)；吸入用七氟烷(上海恒瑞醫(yī)藥有限公司，批號17071731)；生理鹽水 (四川科倫藥業(yè)股份有限公司)；甲醛 (分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司)；大鼠胃泌素(GAS)和白介素-8(IL-8)放免試劑盒 (北京華英生物技術(shù)有限公司)。

1.3動物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自西安交通大學(xué)實驗動物中心。動物許可證號：SCXK(陜)2012-003。

2 方法

2.1動物分組及給藥 50只雄性SD大鼠適用性喂養(yǎng)1周后隨機分成5組，化生平合劑高、中、低劑量組分別按照14.6，7.3 和3.6 g·kg-1·d-1灌胃化生平合劑，陽性對照組按照0.2 g·kg-1·d-1灌胃西咪替丁水溶液，模型組每日給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥7 d。

2.2動物造模 采用大鼠幽門結(jié)扎法進行造模。大鼠常規(guī)飼養(yǎng)并灌胃到第8 d時，各組動物禁食不禁水24 h。于第9 d灌胃1 h后開始實驗，先將大鼠用七氟烷麻醉后固定在鼠板上，剔除腹部皮毛，用止血鉗撐開大鼠腹腔，使胃部暴露，找到胃和十二指腸交界處，在胃幽門下穿一線(勿傷及周圍血管)，將幽門結(jié)扎，同時經(jīng)十二指腸給予被試藥物，對照組給予等體積生理鹽水?？p合腹壁切口，用生理鹽水沖洗后將大鼠放回飼養(yǎng)籠內(nèi)。

2.3觀察指標及檢測

2.3.1血清樣本的檢測 禁水禁食5 h后用烏拉坦麻醉大鼠，頸動脈取血。將收集的大鼠血液以3 000 r·min-1離心10 min，分離血清，在-20 ℃冰箱中保存。用放射免疫法測定GAS及IL-8的含量。

2.3.2胃液量及胃液總酸度的測定 打開大鼠腹腔，結(jié)扎其賁門，摘取全胃，用生理鹽水沖洗干凈后沿胃大彎剪開大鼠胃部，傾倒其胃內(nèi)容物于潤濕的漏斗中，過濾于有刻度的試管中，記錄收集的胃液量。取濾過的胃液1 mL，加入質(zhì)量濃度為10 g·L-1的酚酞試液2滴，用0.1 mol·L-1的氫氧化鈉對照品溶液進行滴定，滴定終點為紅色且在2 s內(nèi)不消失，記錄消耗的氫氧化鈉對照品溶液的量，計算胃液總酸度。

2.3.3胃組織肉眼形態(tài)觀察 摘取全胃，用生理鹽水沖洗，肉眼觀察并記錄各組特征，沿胃大彎剪開大鼠胃部，將剪開的胃組織用生理鹽水沖洗干凈，將胃組織盡量展平后觀察胃黏膜的色澤、腫脹度及潰瘍形成等情況。

2.3.4胃組織病理組織學(xué)觀察 將2.3.3項下剪開的胃組織觀察記錄后，用濾紙吸干，立即放入體積分數(shù)為10%的中性甲醛固定液中。經(jīng)包埋、切片、HE染色處理后，在光鏡下觀察大鼠胃部組織病理變化。

3 結(jié)果

3.1化生平合劑對大鼠GAS及IL-8活性的影響 見表1。由表1可知，與模型組比較，化生平合劑高、中、低劑量組GAS含量均有所降低，陽性對照組也降低，且化生平合劑高、中劑量組及陽性對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，化生平合劑低劑量組則差異不顯著(P>0.05)；化生平合劑各劑量組及陽性對照組IL-8的含量均有所降低，但與模型組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1化生平合劑對大鼠GAS及IL-8活性的影響

分組nGAS/pg·mL-1IL-8/pg·mL-1模型組10118.77±11.3179.65±21.75化生平合劑低劑量組9101.44±17.7174.94±17.38化生平合劑中劑量組10100.79±11.67?72.76±12.67化生平合劑高劑量組9 96.87±14.41?60.63±19.25陽性對照組10 91.32±22.80?70.89±27.62

注：與模型組比較*P<0.05。

3.2化生平合劑對大鼠胃液量的影響 見表2。由表2可知，各給藥組均可使大鼠胃液含量降低。與模型組相比，化生平合劑給藥后高、中劑量組及陽性對照組均可使大鼠胃液量顯著減少(P<0.01)，化生平合劑低劑量組也可降低大鼠胃液量(P<0.05)。

表2化生平合劑對大鼠胃液量的影響

分組給藥劑量/g·kg-1·d-1n胃液量/mL模型組4.0 mL105.41±1.44化生平合劑低劑量組3.693.89±1.62?化生平合劑中劑量組7.3103.04±1.61??化生平合劑高劑量組14.692.32±1.94??陽性對照組0.2103.22±1.57??

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

3.3化生平合劑對大鼠胃液酸度的影響 見表3。胃液酸度是胃潰瘍形成的關(guān)鍵因素，結(jié)果顯示，化生平合劑高、中、低劑量組及陽性對照組均在一定程度可使大鼠胃液酸度降低，但與模型組對比，只有化生平合劑高劑量組和陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，化生平合劑中、低劑量組與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

由表2和表3可知，化生平合劑可通過減少胃液含量、降低胃液中的胃酸活力，從而達到對胃黏膜的保護與修復(fù)，起到治療胃潰瘍的作用。

表3化生平合劑對大鼠胃液酸度的影響

分組給藥劑量/g·kg-1·d-1n胃液酸度/mmol·L-1模型組4.0 mL100.082±0.092化生平合劑低劑量組3.690.081±0.096化生平合劑中劑量組7.3100.078±0.097化生平合劑高劑量組14.690.065±0.084??陽性對照組0.2100.049±0.098??

注：與模型組比較**P<0.01。

3.4化生平合劑對大鼠胃組織病理形態(tài)的影響 見圖1。處死大鼠，摘取全胃，肉眼可見模型組胃體顯著增大，胃中充滿胃液，胃黏膜有充血、水腫、潰瘍及出血點，光鏡下胃黏膜表面上皮局部出血、壞死，固有層有較多的中性粒細胞浸潤?；胶蟿└摺⒅?、低劑量組及陽性對照組與模型組相比，胃體較小，胃液較少，胃黏膜水腫、充血較模型組輕，有個別散在的出血點，光鏡下顯示胃黏膜上皮少見缺失，固有層中性粒細胞少許浸潤，各給藥組之間病理形態(tài)差異不顯著。說明化生平合劑高、中、低劑量組對幽門結(jié)扎法所致的大鼠急性胃黏膜損傷均有一定的保護修復(fù)作用。

圖1大鼠胃組織病理學(xué)觀察(H&E，200×)

A.模型組；B.陽性對照組；C.化生平合劑低劑量組；D.化生平合劑中劑量組；E.化生平合劑高劑量組。

Fig.1 Pathological observation of gastric tissue in rats (H&E，200×)

A.model group；B.positive control group；C.Huashengping Mixture low dose group；D.Huashengping Mixture middle dose group；E.Huashengping Mixture high dose group.

4 討論

中醫(yī)講究“治未病”原則，根據(jù)胃病早期的臨床癥狀將其歸為胃脘痛、痞滿等范疇，治療以補益脾胃、活血化瘀、清熱解毒為原則。運用化生平合劑進行治療，方中君藥黃芪與白芨可補氣生血、去腐生肌；臣藥白花蛇舌草、虎杖和黃連有清熱利濕解毒之功；丹參、桃仁和三七活血化瘀，三者共為佐藥，使瘀血去而新血生，瘡瘍?nèi)ザ氯馍皇顾庪u內(nèi)金發(fā)揮消食健脾的功效，甘草既能益氣補中、清熱解毒、和中緩急止痛，又能調(diào)和諸藥。研究證實，丹參能通過抑制胃酸及胃蛋白酶分泌，改善胃黏膜供血及胃潰瘍患者的氧化應(yīng)激狀態(tài)等機制促進潰瘍創(chuàng)面的愈合[5-7]。黃芪和三七能通過促進HSP70的表達而保護受損的胃黏膜細胞并進行修復(fù)[8-9]。黃連通過對幽門螺桿菌的抑制作用等機制提高胃黏膜屏障功能[10-12]。此外，白芨、甘草和虎杖等單味中藥在治療胃潰瘍方面均有研究報道[13-18]。蔡永敏等[19]通過采用信息定量統(tǒng)計方法，對治療胃潰瘍的中藥進行檢索和排名，發(fā)現(xiàn)丹參、黃連、黃芪、甘草和黃芪等幾味中藥在治療胃潰瘍等相關(guān)疾病中使用頻次最高。諸藥合用，使氣虛者補氣，血瘀者行血，肉腐者生新，元氣內(nèi)充，血液得運，死肉可除，則諸證自愈。

早在20世紀70年代，相關(guān)研究表明，胃癌的發(fā)生是經(jīng)過正常胃黏膜→慢性淺表性胃炎→慢性萎縮性胃炎→胃黏膜腸上皮化生→胃黏膜異型增生→胃癌這一多步驟、逐漸進展的過程，在演變過程中伴隨著眾多分子的改變及基因的累積[20-21]。一般認為，胃黏膜的損傷是由胃酸、胃蛋白酶、幽門螺桿菌、GAS和炎癥因子等攻擊因子與前列腺素E2(PGE2)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)和生長抑素(SS)等保護防御因子的失衡有關(guān)[22]。GAS由胃竇G細胞分泌，可通過直接作用于胃壁細胞上的GAS受體，促進胃酸的分泌，GAS含量増加可導(dǎo)致胃酸的増加，加重胃黏膜損傷[23]。急性胃黏膜損傷后GAS增高可能是由于PGE2的合成降低導(dǎo)致對GAS的分泌、釋放控制減弱，GAS具有促進胃酸分泌的作用[24]，胃酸過多分泌會進一步刺激損傷部位，加劇胃黏膜損傷。而藥物治療可使升高的GAS水平下降至正常水平，使胃黏膜有損傷作用的胃酸和胃蛋白酶原的過度分泌得以控制，從而減輕胃黏膜的損傷[25]。胃黏膜受損后會激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)所引起的各種炎癥細胞的活化，產(chǎn)生IL-1、IL-8 及TNF-α等促炎細胞因子，引起或加重炎癥反應(yīng)[26]。IL-8是由單核細胞、巨噬細胞等多種細胞產(chǎn)生的，主要是趨化和激活嗜中性粒細胞在炎癥部位聚集，加劇炎癥的發(fā)生[27]。當(dāng)發(fā)生局部炎癥或敗血癥時，外周血中的IL-8水平檢測值可升高。

總之，化生平合劑可通過抑制胃酸液及GAS分泌，降低胃液排出量及炎癥因子IL-8水平，達到保護胃黏膜、治療和修復(fù)胃黏膜損傷的作用，可為化生平合劑在臨床上治療胃黏膜損傷提供理論依據(jù)。