陳 雷，史 敏，李 楊，馬晨超，曹金一*

(1.西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院，西安 710125；2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安 710069；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科，西安 710032)

腦復(fù)康寧膠囊由三七、黃芪、天麻、水蛭、石菖蒲、全蝎和冰片等9味藥材制成，具有益氣活血、通經(jīng)活絡(luò)、祛瘀生新和醒腦開竅的作用，主治腦血栓、腦梗死、腦出血、腦萎縮、腦中風(fēng)和面癱等?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的主要檢測(cè)項(xiàng)目?jī)H有石菖蒲和冰片的TLC鑒別，無(wú)含量測(cè)定的質(zhì)量控制。標(biāo)準(zhǔn)中藥的TLC鑒別數(shù)量少，不能完全滿足質(zhì)量控制的要求。本研究對(duì)該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了完善和提高，新增了天麻和黃芪的TLC鑒別項(xiàng)。原標(biāo)準(zhǔn)沒有君藥三七的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，本次修訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)選取君藥三七中的有效成分人參皂苷Rb1作為含量測(cè)定指標(biāo)，提高了現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)產(chǎn)品的可控性。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-20AT 型高效液相色譜儀(日本島津公司)；FE38型酸度計(jì)(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；YP1002電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；BSA224S型電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；ZNHW調(diào)溫電熱套(上海鷹迪儀器設(shè)備有限公司)；WGLL-65BE電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津泰斯特儀器有限公司)；JPS-20超聲清洗器(深圳市潔泰超聲洗凈設(shè)備有限公司)；ZF-2 型紫外光燈分析儀(上海市安亭電子儀器廠)。

1.2試藥 黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)110781-201616)，天麻素對(duì)照品(批號(hào)110807-201507)和人參皂苷Rb1對(duì)照品(批號(hào)110704-201625)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；腦復(fù)康寧膠囊(西京醫(yī)院藥劑科自制，批號(hào)：160601，160602，160603)；甲醇、乙腈為色譜純(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；磷酸、鹽酸和三氯甲烷均為分析純(天津市化學(xué)試劑二廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1黃芪的TLC鑒別 取3批(批號(hào)：160601，160602和160603)腦復(fù)康寧膠囊內(nèi)容物各5 g，加入20 mL甲醇，加熱回流1.5 h，過濾，濾液過5 g中性氧化鋁柱(100～200目)，用100 mL 體積分?jǐn)?shù)為40%的甲醇洗脫，收集層析液，蒸干，殘余物加水30 mL使溶解，用水飽和的正丁醇溶液萃取2次，每次20 mL，合并正丁醇相，減壓蒸干，殘余物加甲醇0.5 mL使其溶解，作為供試品溶液，待用。另取黃芪甲苷對(duì)照品，用甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，待用[1-3]。按照處方比例制備不含黃芪的陰性對(duì)照品，按照上述供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。參照TLC法(《中國(guó)藥典》2015年版一部附錄通則0502)[4]實(shí)驗(yàn)，分別吸取上述3種溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，選取三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以適量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱數(shù)分鐘至顯色清晰。在TLC板上，供試品與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同的棕褐色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)此斑點(diǎn)，故納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文。結(jié)果見圖1A[5-7]。

2.2天麻的TLC鑒別 取腦復(fù)康寧膠囊內(nèi)容物4 g，加體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取天麻素對(duì)照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。再按照工藝制法制備缺天麻的陰性對(duì)照溶液[8-10]。按照TLC法(《中國(guó)藥典》2015年版一部附錄通則0502)實(shí)驗(yàn)，吸取對(duì)照品溶液5 μL、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(8∶1∶3∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以體積分?jǐn)?shù)為10%的磷鉬酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)[11-13]。陰性對(duì)照無(wú)干擾，故納入標(biāo)準(zhǔn)正文，見圖1B。

圖1TLC圖

A.黃芪:1.陰性對(duì)照；2～4.供試品；5.黃芪甲苷對(duì)照品。 B.天麻:1.天麻素；2.天麻對(duì)照藥材；3～5供試品;6.陰性對(duì)照。

Fig.1 TLC chromatograms

A.Astragalusroot：1.negative sample；2-4.samples；5.astragaloside reference substance.B.Gastrodiaelata：1.gastrodin reference；2.gastrodiae rhizome reference；3-5.sample；6.negative sample.

2.3人參皂苷Rb1的含量測(cè)定

2.3.1色譜條件 分析柱：Kromasil C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：以乙腈(A)-水(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫程序見表1。檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；流速為1.0 mL·min-1;理論塔板數(shù)按照人參皂苷Rb1峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000[14-16]。在該色譜條件下，腦復(fù)康寧膠囊中人參皂苷Rb1和其他組分完全分離，陰性樣品在相應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)色譜峰，說明此方法專屬性較好。見圖2。

表1梯度洗脫程序

Tab.1 Program of the gradient elution

時(shí)間/minA,乙腈體積分?jǐn)?shù)/%B,水體積分?jǐn)?shù)/%0257520.00257560.00406060.10901065.00901065.10257570.002575

圖2HPLC圖

A.人參皂苷Rb1對(duì)照品；B.供試品；C.陰性樣品；1.人參皂苷Rb1。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.reference substance of ginsenoside Rb1；B.sample；C.negative sample；1.ginsenoside Rb1.

2.3.2溶液的制備 對(duì)照品溶液：精密稱取人參皂苷Rb1對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.4 mg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液：精密稱定腦復(fù)康寧膠囊2.0 g，加入甲醇50 mL，在水浴鍋上加熱回流2 h，補(bǔ)加適量甲醇，搖勻，過濾，濾液減壓蒸干，殘余物用適量蒸餾水溶解，用水飽和的正丁醇溶液萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇相，蒸干，得殘?jiān)?，將殘?jiān)糜?0 mL量瓶中，用色譜甲醇溶解并定容，用0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，收集濾液，即得。

陰性樣品溶液：按照處方比例制備不含三七的陰性對(duì)照品，按照上述供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。

2.3.3線性關(guān)系的考察 精密稱定人參皂苷Rb1對(duì)照品0.016 4 g，置于10 mL量瓶中，加甲醇適量使溶解，搖勻，定容，即得質(zhì)量濃度為1.640 0 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液5 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.82 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，按照上述方法操作，依次制備成質(zhì)量濃度分別為0.410 0，0.205 0，0.102 5 和0.051 2 mg·mL-1的對(duì)照品溶液[17]。精密吸取上述制備的對(duì)照品溶液各10 μL，分別進(jìn)樣，注入高效液相色譜儀，按照2.3.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=2 354.4x+25.771，r=0.999 6。質(zhì)量濃度在0.051 2～1.640 0 mg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.3.4精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取質(zhì)量濃度為0.410 0mg·mL-1的對(duì)照品溶液，按照2.3.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果人參皂苷Rb1的峰面積RSD值為1.57%，結(jié)果表明，該儀器精密度良好[18]。

2.3.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、腦復(fù)康寧膠囊(批號(hào)160601)供試品溶液，考察二者日內(nèi)差異與日間差異峰面積的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，對(duì)照品日間和日內(nèi)峰面積的RSD值分別小于0.42%和0.35%，供試品日間和日內(nèi)峰面積的RSD值分別小于0.14%和0.22%，對(duì)照品和供試品溶液穩(wěn)定性均符合含量測(cè)定要求。

2.3.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別取同一批號(hào)的腦復(fù)康寧膠囊，制備5份供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣，按照2.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算人參皂苷Rb1的含量，其RSD值為1.02%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取本品(批號(hào)160603，含量為1.15 mg·粒-1)，共6份。精密吸取2.3.2項(xiàng)下制備的人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液適量，加入到樣品中，按照 2.3.2 項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備回收實(shí)驗(yàn)溶液，按照2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算樣品含量及回收率，平均回收率為99.40%，RSD值為1.59%，結(jié)果表明該方法回收率良好。見表2。

2.3.8樣品的測(cè)定 取3批樣品適量，按照2.3.2項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，按照2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果顯示，3批樣品中斯皮諾素的平均含量為1.15 mg·粒-1，RSD值為1.82%。結(jié)果表明，不同批次間均一性較好。本品每粒含三七以人參皂苷Rb1(C54H92O23)計(jì)，不得少于0.80 mg·粒-1(每粒0.35 g)。

表2人參皂苷Rb1的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of ginsenoside Rb1recovery test (n=6)

取樣量/g樣品含量/mg加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%1.001 23.289 63.286.561 799.7599.40 1.591.102 13.621 23.286.785 196.791.009 33.316 23.286.573 499.311.003 23.296 23.286.571 199.841.009 13.315 63.286.562 398.991.003 43.296 93.286.632 9101.70

3 討論

天麻鑒別實(shí)驗(yàn)中，參照《中國(guó)藥典》2015年版一部天麻鑒別方法，按照原藥材0.5 g換算，取本品2.5 g，點(diǎn)樣量大(30 μL)，拖尾嚴(yán)重，因此增加取樣量到4 g，減少點(diǎn)樣量，結(jié)果分離效果較好、斑點(diǎn)清晰。用硅膠G薄層板考察了2種展開系統(tǒng)的分離效果，展開劑乙酸乙酯-甲醇-水(9∶1∶0.2)和氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(8∶3∶1∶0.1)，結(jié)果顯示，后者的分離效果較好。

文獻(xiàn)報(bào)道[19-20]，將三七不同部位人參皂苷Rb1的含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)三七不同部位人參皂苷含量差異較為明顯，其中根莖(習(xí)稱剪口)中含量最高?！吨袊?guó)藥典》要求三七含量測(cè)定按照干燥品計(jì)算含人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1和三七皂苷R1的總和不得少于5.0%，但三者中三七皂苷R1的含量最低，因此，綜合考慮到藥材含量的穩(wěn)定性以及臨床用藥的有效性和安全性，最終選擇人參皂苷Rb1為含量測(cè)定指標(biāo)。通過對(duì)3批腦復(fù)康寧膠囊的含量進(jìn)行測(cè)定，人參皂苷Rb1的含量均為1.10 mg·粒-1，考慮到藥材差異和裝量差異，最終確定腦復(fù)康寧膠囊中人參皂苷Rb1的含量為每粒不低于0.80 mg。

腦復(fù)康寧膠囊作為醫(yī)院制劑，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較低，不能滿足對(duì)藥品質(zhì)量的嚴(yán)格要求，本研究建立了腦復(fù)康寧膠囊的TLC鑒別和其關(guān)鍵成分人參皂苷Rb1含量測(cè)定的方法，可作為腦復(fù)康寧膠囊質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)，提高了該制劑質(zhì)量的可控性，符合《軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高技術(shù)要求》。