劉 磊，李 薇，宋正江，高本旺

(三峽植物園管理處，湖北 宜昌443000)

獼猴桃隸屬于獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)，為多年生雌雄異株木質(zhì)藤本植物。獼猴桃屬現(xiàn)有54個種和21個變種，共約75個分類群[1]，絕大多數(shù)物種分布于中國。獼猴桃馴化栽培被認為是近代果樹史上由野生到人工商品化栽培最成功的植物馴化范例[2]。

目前獼猴桃品種選育和遺傳改良的主要方法有野生選優(yōu)、實生選育以及雜交育種等。獼猴桃屬植物物種間存在廣泛的天然重疊分布區(qū)，并且分子系統(tǒng)學(xué)研究表明種間普遍存在雜交和基因漸滲現(xiàn)象[3-4]，在此基礎(chǔ)上提出了漸滲育種概念(introgression breeding)[5-6]，為獼猴桃屬植物雜交育種提供了理論依據(jù)。雜交育種是獼猴桃屬植物主要育種手段之一，但是對于像獼猴桃這樣的木本植物且功能性雌雄異株的植物來說更為耗時費力，很難獲得純合系。

單倍體和雙單倍體技術(shù)是經(jīng)濟作物品質(zhì)改良的重要手段，廣泛用于植物育種，可以一步獲得100%純系。單倍體可以自然發(fā)生，但頻率很低，需要人工誘導(dǎo)來滿足植物育種的需求。通過發(fā)育不成熟的子房、花藥或者分離小孢子體外培養(yǎng)的方法可以獲得單倍體植株[7]。

花粉胚胎發(fā)生能力與小孢子所處的發(fā)育時期有著至關(guān)重要的關(guān)系。一般認為花粉第一次減數(shù)分裂到有液泡小孢子至雙核早中期易于花粉胚胎發(fā)生[8]，可能此時期仍處于小孢子增殖階段還沒有完全分化[9]。Sopory等[10]認為小孢子發(fā)育時期可能影響再生植株倍性，其研究表明由單核期小孢子再生而來的植株多為單倍體，而由之后發(fā)育時期的花藥培養(yǎng)獲得的植株染色體數(shù)目增多。像砂梨[Pyruspyrifolia(Burm. f.) Nakai〗、印度苦楝(AzadirachtaindicaA.Juss.)和番木瓜(CaricaapayaL.)這樣的木本植物選用單核期花藥進行植株再生獲取單倍體和雙單倍體[11-14]。因此，在花藥培養(yǎng)之前應(yīng)進行小孢子發(fā)育時期鑒定，以便采集小孢子發(fā)育時期適宜的花蕾。

長期以來獼猴桃單倍體育種方面的工作開展較少。獼猴桃花藥培養(yǎng)只獲得體細胞胚，沒有小孢子胚胎發(fā)生[15-16]。Chalak等[17]對美味獼猴桃栽培品種‘海沃德’(六倍體)的花粉進行輻射，成功誘導(dǎo)三倍體再生植株。在此之前，Pandey等[18]用輻射的獼猴桃花粉進行授粉，誘導(dǎo)孤雌生殖?？偟膩碚f，獼猴桃屬植物中單倍體和雙單倍技術(shù)還沒有真正意義上開展。

本研究擬采集不同發(fā)育時期獼猴桃花蕾，觀察花蕾形態(tài)與小孢子發(fā)育時期之間的關(guān)系，旨在進行獼猴桃單倍體種質(zhì)創(chuàng)新與育種改良時，可直接根據(jù)花蕾形態(tài)判斷花粉發(fā)育時期，提高取材的準(zhǔn)確性和效率。

1 材料和方法

1.1 材料

采集三峽植物園管理處(宜昌市林業(yè)科學(xué)研究所)獼猴桃種質(zhì)資源圃內(nèi)中華獼猴桃(ActinidiachinesePlanch.)商業(yè)化栽培品種‘東紅’雄性花蕾作為實驗樣品，進行小孢子發(fā)育時期的觀察。

1.2 方法

2017年3月初，獼猴桃現(xiàn)蕾時開始取樣。取材時以花蕾開放程度分為I期、II期、III期、IV期、V期、VI期和VII共7個形態(tài)階段(表1)，每組取15個花蕾。每天早上8:30-9:30，采集雄花花蕾置于冰盒內(nèi)，帶回實驗室用卡諾固定液(無水乙醇與冰醋酸體積比為3∶1)于室溫下固定24 h，固定液為樣品10倍。然后用95%酒精洗去醋酸，于75%酒精4℃保存?zhèn)溆?。取固定處理后的花? 用鑷子小心剝?nèi)ポ嗥?、花? 取出花藥, 在1 mol L-1HCl 中60 ℃恒溫下解離3～6 min, 然后用蒸餾水清洗干凈。

將花藥放在載玻片上, 滴1滴1.5%醋酸洋紅染色液, 用雙面刀片從花藥中部切斷, 用鑷子輕輕擠壓花藥, 使其散出花粉母細胞或花粉粒, 去掉花藥壁殘渣, 加蓋蓋玻片, 在酒精燈火焰上微烤2～3次，45%醋酸分色制片。用奧科巴斯BX43型生物數(shù)碼顯微鏡先在100×下找到視野, 再在400×下確定花藥小孢子所處的發(fā)育時期并拍照。

2 結(jié)果和分析

2.1 小孢子發(fā)育時期

通過對I～VII時期花蕾的顯微觀察，檢測到單核期中期、單核靠邊期、雙核期和三核期花粉(圖1)。因選取試驗材料時期局限性，本研究未觀察到小孢子母細胞時期、二分體時期及四份體時期等花粉早期的發(fā)育狀態(tài)。

2.2 小孢子發(fā)育時期與花蕾外部形態(tài)特征、花蕾大小的關(guān)系

小孢子處于單核期花蕾處于Ⅰ期和Ⅱ期，花蕾緊實被花萼片緊緊包裹，花萼稍有松動，花瓣稍露(圖2)。Ⅰ期花蕾花瓣和花萼平均長度分別為0.80 cm和0.50 cm，花瓣長和花萼長比值為1.59，有84.4%小孢子處于單核期，其中單核中期有32.4%，單核靠邊期有52.0%；Ⅱ期花蕾花瓣和花萼平均長度分別為0.85 cm和0.51 cm，花瓣長和花萼長比值為1.67，有68.6%小孢子處于單核期，其中單核中期有37.3%，單核靠邊期有31.3%(表1)。

Ⅲ期和Ⅳ期花蕾的小孢子大多處于雙核期，此時花蕾仍較為緊實，花萼片松動較多，花瓣裸露面積增大但仍平整未展開(圖2)。Ⅲ期花蕾花瓣和花萼長分別為0.87和0.48，二者比值為1.82，此時小孢子有62.0%處于雙核期；Ⅳ期花蕾花瓣和花萼長分別為0.87和0.46，二者比值為1.89，此時小孢子有75.4%處于雙核期(表1)。

圖1 獼猴桃小孢子不同發(fā)育時期圖片 A：單核中期；B：單核靠邊期；C：雙核期；D：三核期

表1 獼猴桃花蕾大小及小孢子發(fā)育時期統(tǒng)計

V期、VI期、VII期小孢子細胞大多處于三核期(圖2)，基本發(fā)育為成熟花粉，所占比例分別為63.8%、85.3%和84.5%。V期花蕾花萼片基本打開，花瓣平整或稍有松動；VI期花瓣松動較多，有2～3片花瓣松動；VII期處于鈴鐺花時期，花瓣3～4片松動。V期、VI期、VII期花瓣長度大于1 cm，花瓣和花萼長度比值均大于2。

表1數(shù)據(jù)顯示，在小孢子發(fā)育階段，花蕾花萼長度基本沒有增長，花瓣長度逐漸增長?；ò旰突ㄝ嚅L度比值為1.59～1.67時，小孢子發(fā)育時期多處于單核期；花瓣和花萼長度比值為1.82～1.89時，小孢子發(fā)育時期多處于雙核期；當(dāng)花瓣和花萼長度比值大于2時，小孢子發(fā)育時期處于三核期，為成熟花粉。

3 討 論

目前單倍體育種主要通過發(fā)育不成熟的子房、花藥或者分離小孢子體外培養(yǎng)的方法可以獲得單倍體植株，而選擇適宜小孢子發(fā)育時期是單倍體取得成功的重要因素之一。王玉英等[19]在花藥培養(yǎng)時對比了單核早期、單核靠邊期和雙核期，指出了對大多數(shù)植物而言，單核靠邊期的效果是最佳的。Ranjith Pathirana等[20]研究表明處于小孢子發(fā)育單核中期到后期的三花龍膽(GentianatrifloraPall.)花藥可再生出單倍體或雙單倍體。在胡蘿卜(DaucuscarotaL.)小孢子培養(yǎng)過程中，通過花蕾大小和形態(tài)選取小孢子發(fā)育階段處于單核晚期或者雙核早期的花藥分離小孢子進行小孢子培養(yǎng)[21]。一般認為花粉第一次減數(shù)分裂到有液泡小孢子至雙核早中期易于花粉胚胎發(fā)生[22]。因此，花藥培養(yǎng)或小孢子培養(yǎng)獲得單倍體或雙單倍體首先在材料選擇上極其重要。通過顯微鏡逐個觀察小孢子發(fā)育時期很困難，確定小孢子發(fā)育時期與相對應(yīng)的花器官外部形態(tài)指標(biāo)間的聯(lián)系至關(guān)重要。

圖2 不同階段花蕾形態(tài)特征描述

獼猴桃是一種重要的水果資源，目前獼猴桃在單倍體育種方面的研究工作開展較少，即使有少量關(guān)于獼猴桃花藥培養(yǎng)方面的文章但是只是獲得了體細胞胚，并沒有小孢子胚胎發(fā)生過程。在砂梨[Pyruspyrifolia(Burm.f.)Nakai]、印度苦楝(AzadirachtaindicaA.Juss.)和番木瓜(CaricapapayaL.)等木本植物中選用單核期花藥進行植株再生獲取單倍體和雙單倍體[11-14]。因此，在獼猴桃花藥培養(yǎng)獲得單倍體的研究中，首先要確定獼猴桃小孢子發(fā)育時期和花蕾形態(tài)特征間的聯(lián)系，便于今后單倍體育種研究的材料選擇。

孫守如等[23]研究結(jié)果表明南瓜花蕾形態(tài)與小孢子發(fā)育時期存在密切關(guān)系，依據(jù)花蕾縱橫比可判斷小孢子發(fā)育時期。孫治強等[24]認為，茄子同一品種花蕾長和花蕾直徑有一定規(guī)律，其小孢子發(fā)育時期與萼裂基部差有一定關(guān)系。在西瓜花藥和小孢子培養(yǎng)中，通過確定花蕾發(fā)育和花粉發(fā)育時期的關(guān)系，找到西瓜單核靠邊期花粉相對應(yīng)的西瓜花蕾的形態(tài)特征[25]。上述研究結(jié)果表明，花蕾形態(tài)特征與小孢子發(fā)育時期有著密切的聯(lián)系，可以作為花藥培養(yǎng)或小孢子培養(yǎng)的取材依據(jù)。在獼猴桃中，其花蕾形態(tài)特征與小孢子發(fā)育時期的關(guān)系還未見報道。

從研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，獼猴桃小孢子發(fā)育時期與花蕾形態(tài)特征及花瓣與萼片長度比值存在密切關(guān)系。所以在獼猴桃單倍體育種取材過程中可先根據(jù)花蕾的形態(tài)特征，即花萼松動和花瓣裸露大小進行初步判斷，然后再以花瓣和花萼長度比值進行進一步篩選，以此提高獼猴桃小孢子取材的準(zhǔn)確性。

植物的花粉發(fā)育不但容易受到環(huán)境的影響，而且不同品種、不同倍性小種間的花蕾形態(tài)和花粉發(fā)育情況也存在差異。因此，獼猴桃花蕾形態(tài)特征與小孢子發(fā)育時期間的相關(guān)性仍有待進一步深入研究。