史偉國，白國棟，宗希明，袁 寰，杜 鵑，高慶東

(1.佳木斯大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007;2.佳木斯市中醫(yī)醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

脫皮馬勃(LasiosphaerafenzliiReich.)，為灰包科脫皮馬勃屬真菌的干燥子實(shí)體。被收載于《中國藥典》(2015版第一部)。其性味辛平，歸肺經(jīng)。外用治鼻衄，創(chuàng)傷出血[1]。馬勃所含的重要活性成分多糖，因其具有保護(hù)肝臟損傷[2]、清除超氧離子自由基[3]等作用，在近幾年越來越被重視。這種真菌類多糖的獲取途徑有很多種，可以通過對(duì)真菌干燥的子實(shí)體的水提取獲得[4]，也可以通過菌絲體和發(fā)酵液的代謝產(chǎn)物獲得[5]，還可以在酶的輔助下提取獲得[6]。本項(xiàng)研究是在一定功率的超聲波輔助下，水料比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)馬勃粗多糖提取率的影響，應(yīng)用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，優(yōu)化超聲波輔助提取馬勃的條件，以期能為馬勃多糖的提取和進(jìn)一步研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬勃藥材購于黑龍江省佳木斯市百草堂藥店，經(jīng)佳木斯市中醫(yī)醫(yī)院制劑室主任中藥師丁麗鑒定為脫皮馬勃(LasiosphaerafenzliiReich.)，粉碎過篩，作為樣品。葡萄糖、濃硫酸、苯酚、乙醇均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?，水為蒸餾水。

1.2 儀器

KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)(島津公司)，AUW220D型電子分析天平(島津公司)，SF-200B型高速粉碎機(jī)(上海中藥機(jī)械廠)，HH-24型恒溫水浴鍋(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，202系列電熱恒溫干燥箱(上海葉拓儀器儀表有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 提取馬勃粗多糖

稱取經(jīng)粉碎后過3號(hào)篩馬勃粉末5.0 g，用87%乙醇50 mL浸泡過夜，抽濾，濾渣用87%乙醇洗脫2次。室溫放置，待乙醇自然揮發(fā)后殘?jiān)诔暪β蕿?00 W的條件下，按一定液料比、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行提取。抽濾，離心。用苯酚-硫酸法[7]，測定吸光度，計(jì)算馬勃粗多糖的提取率。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取干燥至恒重葡萄糖粉末10 mg，定容至100 mL，待葡萄糖完全溶解,得0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL分別置于試管中，分別加水2、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8 mL，加5%苯酚溶液1.0 mL，振勻，快速加入濃硫酸5.0 mL，放置10 min，振勻，置100 ℃水浴15 min后，取出室溫放涼，測定吸光度，在490 nm波長處出現(xiàn)最高值，以葡萄糖的濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A490)為縱坐標(biāo)繪制曲線。

1.3.3 馬勃粗多糖的測定

精密吸取按“1.3.1”項(xiàng)下方法提取后，稀釋至合適濃度的樣品溶液2 mL，按照苯酚-硫酸法測定馬勃粗多糖吸光度。根據(jù)樣品吸光度計(jì)算多糖提取率。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在超聲功率固定為200 W的條件下，以提取溫度40 ℃，提取時(shí)間40 min，液料比為15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 mL·g-1，分別提取粗多糖，測提取率；以提取溫度40 ℃，液料比為25∶1 g·mL-1，提取時(shí)間為30、40、50、60、70 min，分別提取粗多糖，測提取率；以提取時(shí)間為50 min，液料比為25∶1 g·mL-1時(shí)，提取溫度30、40、50、60、70 ℃，分別提取多糖，測定多糖提取率。確定最佳提取條件。

1.3.5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以液料比(X1)、提取時(shí)間(X2)和提取溫度(X3)3個(gè)因素分別選取5個(gè)水平對(duì)馬勃粗多糖提取率(Y)進(jìn)行考察，設(shè)計(jì)星點(diǎn)試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按“1.3.2”項(xiàng)下操作，得回歸方程A490=50.96C+0.015 3R2=0.999 1

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 提取率計(jì)算公式

馬勃粗多糖提取率(%)=

[(A490-0.0153)/50.96×稀釋倍數(shù)×樣品溶液體積]/樣品質(zhì)量

式中：A490為馬勃樣品的吸光度。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 液料比對(duì)提取率的影響

由圖2可知，馬勃粗多糖的提取率在最開始的時(shí)候是隨料液比的增加而大幅度增大，差異性顯著，但到達(dá)25∶1后繼續(xù)增大料液比，多糖的提取率還會(huì)增高，但增高的幅度變小，差異性不顯著，故選料液比25∶1為最佳液料比。

2.3.2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

由圖3可知，馬勃粗多糖的提取率在最開始是逐漸上升，后小幅度下降，分析原因可能是在超聲波的空化和機(jī)械剪切力的作用下使細(xì)胞迅速破裂，促進(jìn)胞內(nèi)粗多糖的滲出。但超聲提取時(shí)間過長，也會(huì)裂解多糖的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致先升后降的結(jié)果。在50 min時(shí)，多糖提取率達(dá)到最高，故選50 min為最佳提取時(shí)間。

2.3.3 提取溫度對(duì)提取率的影響

由圖4可知，馬勃粗多糖的提取率是隨著溫度的升高而顯著增大，后小幅度下降，分析原因可能是粗多糖在溶劑中的溶解度隨著溫度的升高而增大，后當(dāng)達(dá)到一定溫度后，由于高溫可能對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致先升后降的結(jié)果。在提取溫度為50 ℃時(shí)多糖的提取率最高，故選50 ℃為最佳提取溫度。

圖2 液料比對(duì)粗多糖提取率的影響

圖3 提取時(shí)間對(duì)粗多糖提取率的影響

圖4 提取溫度對(duì)粗多糖提取率的影響

2.4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Central Composite Design設(shè)計(jì)原理，通過對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果的分析，星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

表1 馬勃粗多糖提取工藝星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素表

2.5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

響應(yīng)值(Y)代表多糖提取率，分別對(duì)各因素(X1、X2、X3)進(jìn)行二項(xiàng)式方程擬合，見表2。

2項(xiàng)式方程擬合模型：Y=3.49+0.42X1+0.21X2+0.16X3-0.12X1X2+0.086X1X3+0.073

X2X3-0.10X2 1-0.28X2 2-0.24X2 3(R2=0.9803)。

由回歸分析結(jié)果(表3)可知，二項(xiàng)式方程擬合模型P<0.000 1，達(dá)到高度顯著水平，模型可以通過檢驗(yàn)，R2=0.980 3，失擬為P>0.05(不顯著)，說明該方程的預(yù)測值比較接近實(shí)際值，具有較高的可信度。該實(shí)驗(yàn)的顯著影響因素為：X1、X2、X3、X1X2、X1X3、X2 1、X2 2、X2 3。將不顯著因素刪除，方程簡化為：

Y=3.49+0.42X1+0.21X2+0.16X3-0.12X1X2+0.086X1X3-0.10X2 1-0.28X2 2-0.24X2 3

(R2=0.972 8)

表3 馬勃粗多糖提取工藝回歸分析結(jié)果

2.6 工藝參數(shù)的預(yù)測與優(yōu)化

使用Design-Expert 8.0.6軟件，對(duì)已得二項(xiàng)式擬合方程繪制3D響應(yīng)面，見圖5～7。

圖5 液料比與時(shí)間對(duì)多糖得率的影響3D圖

圖6 液料比與溫度對(duì)多糖得率的影響3D圖

圖7 時(shí)間與溫度對(duì)多糖得率的影響3D圖

根據(jù)二項(xiàng)式模型的預(yù)測，馬勃粗多糖最佳提取工藝為：液料比30∶1( mL∶g),提取時(shí)間53.77 min，提取溫度58.33 ℃，多糖提取率為3.88%。根據(jù)上述工藝，采用液料比30 mL·g-1、提取時(shí)間54 min、提取溫度58 ℃，平行驗(yàn)證3次，粗多糖的平均提取率為4.01%，驗(yàn)證的結(jié)果與模型預(yù)測值相近，因此，該方法可以考慮作為超聲波輔助提取馬勃粗多糖的優(yōu)化與預(yù)測。

3 小 結(jié)

本試驗(yàn)運(yùn)用3因素5水平星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法研究了馬勃粗多糖的提取率在固定超聲功率的情況下，和液料比、提取時(shí)間、提取溫度這三個(gè)因素之間的關(guān)系，并且預(yù)測出最佳提取工藝參數(shù)：液料比30∶1( mL∶g),提取時(shí)間53.77 min，提取溫度58.33 ℃。根據(jù)試驗(yàn)所得最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證后，實(shí)測平均提取率為4.01%。說明使用該方法來確定馬勃粗多糖的最佳提取工藝預(yù)測性較好，可以為馬勃的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。