李曉雪 董燕婕 苑學(xué)霞 丁照華 李大鵬 趙善倉

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所；山東省食品質(zhì)量與安全檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，濟(jì)南 250100)(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院2，泰安 271018)(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所3，濟(jì)南 250100)

青霉酸(Penicillic Acid, PA)是由不同株系的青霉菌(Penicillium)和曲霉菌(Aspergillus)產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，具有致突變和致癌作用，能誘導(dǎo)中國倉鼠卵巢細(xì)胞DNA單鏈的斷裂和抑制體外培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞DNA合成[1-3]；袁慧等[4]1998年調(diào)查湖南省霉變飼料發(fā)現(xiàn)有60份霉變飼料中檢出青霉酸，檢出率高達(dá)55.0%。1913年Alsberg等[5]在分析糙皮病與霉變玉米之間的關(guān)系時(shí)，首次從侵染軟毛青霉(P.puberulum)的玉米中分離出青霉酸，并證明了青霉酸對雞、鵪鶉等實(shí)驗(yàn)動物均具有毒性。青霉酸具有誘變性和致癌性，隨膳食攝入對公眾健康產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)。

1 青霉酸的主要特征

青霉酸是一種無色針狀結(jié)晶化合物。熔點(diǎn)83 ℃，沸點(diǎn)在常壓下為285.7 ℃，密度在25 ℃下為1.157 g/mL，易溶于熱水、乙醇、乙醚、苯、氯仿，略溶于冷水(2 g/100 mL)，微溶于熱石油醚，幾乎不溶于戊烷和己烷。青霉酸分子式為C8H10O4，分子量170.16。青霉酸以兩種異構(gòu)體的形式存在，一種為取代的γ-酮酸(γ-酮-β甲氧基-δ甲叉-A-乙酸)(γ-keto-β-methoxy-δ-methylene-A-hexanoicaci-d)，另一種為γ-羥基內(nèi)酯(y-hydroxylactonc)，其分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。

a γ-酮酸 b γ-羥基內(nèi)酯圖1 青霉酸的結(jié)構(gòu)式

2 青霉酸的發(fā)生流行

青霉酸是儲藏真菌產(chǎn)生的生物毒素，在5～32 ℃都產(chǎn)毒，在15～20 ℃時(shí)產(chǎn)毒最高，在低溫高濕的條件下，該毒素產(chǎn)量增高。其中青霉屬產(chǎn)青霉酸的菌種最多，尤以圓弧青霉菌有毒代謝產(chǎn)物中含量較高。青霉酸存在于谷物中，主要污染玉米、高粱、大麥、小麥、燕麥等糧食作物。1974年Thorpe等監(jiān)測美國玉米，其青霉酸含量為5～230 mg/kg[6]。干燥的辣椒樣品保存在相對濕度為91%～97%的環(huán)境中檢出青霉酸[7]。小麥中青霉酸含量為5～230 mg/kg[8]。

有研究表明，在霉變飼料中青霉菌的污染率占89.30%，而圓弧青霉菌占青霉菌污染率的60.30%[4]，飼料中因青霉酸中毒引起的疾病案例有很多，尤其是位于長江以南的省份較多，之前認(rèn)為主要是黃曲霉毒素B1(AFB1)引起的中毒，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，除AFB1引起的中毒外，青霉酸也有毒性作用，故而青霉酸對飼料安全影響很大[9]。

3 青霉酸的生物合成

圓弧青霉中青霉素酸的生物合成途徑大約有6步構(gòu)成[10](圖2)。1個(gè)單位的乙酰輔酶A同3個(gè)單位的丙二酸單酰輔酶A經(jīng)縮合反應(yīng)，失去3個(gè)分子的二氧化碳生成苔色酸。苔色酸經(jīng)環(huán)裂解和脫羧作用而生成青霉酸[11]。其反應(yīng)的最后一步是3-甲基苯醌通過氧化環(huán)裂變生成青霉酸，通過14C同位素示蹤標(biāo)記，研究結(jié)果表明反應(yīng)需要氧氣、還原型輔酶Ⅱ(NADPH)、黃素單核苷酸(FMN)和Fe2+，其反應(yīng)方程式為2NADPH++2H++O2+3-甲基苯醌=2NADP+H2O+PA，其反應(yīng)機(jī)制為拜耳-維立格氧化重排[12]。Axberg等[13]應(yīng)用14C標(biāo)記的前體物研究圓弧青霉青霉酸的生物合成順序依次是苔色酸生成2-氧-苔色酸、1,4-二氫-6-羥基-2-甲苯、6-羥基-2-甲基-苯醌，最后生成青霉酸。

圖2 青霉酸的生物合成途徑

Sekiguchi等[10]通過N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍處理圓弧靑霉(P.cyclopium)得到了青霉酸陰性突變體(P.cyclopiumNRRL 1888)。培養(yǎng)的圓弧青霉突變體(SK2N6)中快速積累6-甲基-1,2,3-三羥基苯，14C放射性標(biāo)記的乙酸迅速進(jìn)入6-甲基-1,2,3-三羥基苯中，同時(shí)，含有14C的6-甲基-1,2,3-三羥基苯快速進(jìn)入圓弧青霉NRRL 1888。研究結(jié)果表明，6-甲基-1,2,3-三羥基苯為圓弧青霉合成青霉酸中間產(chǎn)物。青霉酸的生物合成是由一組聚酮合酶(PKSs)酶催化。通過基因敲除技術(shù)和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)研究表明，只有在曲霉菌westerdijkiae中的pks-nrps基因aolc35-6中編碼某些未知的中間體的aomsas基因和參與生物合成的苔色酸和青霉酸的基因[14]。

4 青霉酸的毒性

4.1 細(xì)胞毒性

青霉酸能促使人呼吸道上皮細(xì)胞死亡，阻斷細(xì)胞的能量傳導(dǎo)，降低細(xì)胞的呼吸作用[15]。青霉酸通過增加細(xì)胞的長度和寬度而導(dǎo)致扁平的和絲狀的細(xì)胞的產(chǎn)生，并且這個(gè)過程相較于蠟樣芽孢桿菌來說，對傷寒沙門菌影響更大。在青霉酸影響下，傷寒沙門菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜明顯的受到破壞，并且一部分細(xì)胞質(zhì)可能隨著細(xì)胞的破裂而流出[16]。青霉酸對人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780的IC50值為1.5 μg/mL，青霉酸誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞神經(jīng)狀突起結(jié)構(gòu)變化，產(chǎn)生神經(jīng)偶極型突起，同雙丁酰環(huán)腺苷酸誘導(dǎo)作用相似。當(dāng)青霉酸處理質(zhì)量濃度為3～6 μg/mL時(shí)，誘導(dǎo)許多神經(jīng)突起從細(xì)胞體延伸[17]。小鼠經(jīng)皮下注射青霉酸，LD50為100 mg/kg，大鼠皮下注射青霉酸1.0 mg，每周2次，64～67周后，注射局部引發(fā)纖維瘤，結(jié)果表明有致突變作用[9]。家兔青霉酸急性中毒時(shí)，臨床上出現(xiàn)體溫降低，心率先快后慢，呼吸增數(shù)，胃腸蠕動加強(qiáng)，脫毛，蛋白尿和引起孕兔流產(chǎn)等現(xiàn)象，病理學(xué)變化主要是腎、肝和心肌細(xì)胞變性[18]。

4.2 器官毒性

青霉酸易于與含有巰基的半胱氨酸、谷胱甘肽、精氨酸、組氨酸和賴氨酸發(fā)生反應(yīng)，通過對青霉酸與半胱氨酸、谷胱甘肽生成的加合物進(jìn)行鑒定，加合物雞胚表現(xiàn)出毒性[19]。尼西雞經(jīng)人工染毒60 d內(nèi)，檢測其病理變化及臟器中的殘留量，結(jié)果表明，青霉酸主要侵害肝、腎及心肌細(xì)胞，且在臟器中含量分布依次為肝>腎>心，由此表明青霉酸的分布與各臟器的病變程度具有相關(guān)性[20]。對雌性狗腹腔注射青霉酸染毒后，會出現(xiàn)腹部漿膜面出血、充血、肝臟竇狀隙擴(kuò)張現(xiàn)象，肝臟外周小葉肝細(xì)胞質(zhì)中肝糖原量也明顯下降，乳酸脫氫酶數(shù)量也在降低[21]。另外，青霉酸能抑制Na+、Ca2+、K+進(jìn)入青蛙的離體心肌，引起心臟功能障礙[22]。

4.3 聯(lián)合毒性

青霉酸與飼料中其他毒素如赭曲霉毒素A相互作用，聯(lián)合毒性增強(qiáng)。青霉酸與赭曲霉毒素A聯(lián)合作用于雛雞時(shí)，其肝臟與腎臟會出現(xiàn)上皮細(xì)胞腫脹和顆粒樣變性，其毛細(xì)血管內(nèi)皮的單核細(xì)胞會出現(xiàn)增殖現(xiàn)象，也能觀察到免疫器官退行性變化和淋巴細(xì)胞的減少[23]。青霉酸能抑制淋巴細(xì)胞的體外增殖，赭曲霉毒素A和青霉酸聯(lián)合作用于豬，可以引起其實(shí)驗(yàn)性腎病[24-25]。赭曲霉毒素A(OTA)與青霉素表現(xiàn)出的協(xié)同作用(P<02<20.05)，而棒曲霉素(PAT)與青霉素表現(xiàn)出拮抗作用(P<02<20.05)[26]。在保加利亞和南非的農(nóng)場飼料中，多種真菌毒素污染(特別是伏馬毒素B1和青霉酸)引發(fā)了豬霉菌毒素中毒、禽腎病，因此動物和人類長期暴露于多種真菌毒素污染的環(huán)境中，可能是其慢性腎臟疾病產(chǎn)生的一個(gè)重要因素[27-28]。

5 青霉酸的作用機(jī)制

青霉酸對細(xì)菌的生物作用機(jī)制是破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增加其通透性[16]。青霉酸通過改變牛巨噬細(xì)胞(BoMac)基因表觀遺傳調(diào)控中所涉及的關(guān)鍵酶而抑制蛋白質(zhì)和RNA的合成。青霉酸能顯著誘導(dǎo)組蛋白去甲基化酶(JMJD-3)的表達(dá)，略微降低組蛋白去乙酰化酶(HDAC)的表達(dá)[29]。青霉酸對脲酶的毒性是通過結(jié)合酶分子的基本基團(tuán)硫醇而形成的[30]。青霉酸可通過抑制亮氨酸的進(jìn)入而阻礙蛋白質(zhì)的合成，其阻礙作用隨濃度的增高和時(shí)間的延長而增強(qiáng)[31]。青霉酸能抑制DNA、RNA、蛋白質(zhì)和一些含巰基的酶的合成，選擇性抑制細(xì)胞膜上的(Na+, K+)-ATP酶活性[32]。Bentley等[11]1962年研究表明青霉酸濃度(80 μmol/L)通過選擇性地抑制各種致病因子和其他群體感應(yīng)調(diào)節(jié)基因影響銅綠假單胞菌的群體感應(yīng)通信。在Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞中，青霉酸濃度為100～200 μmol/L時(shí)通過調(diào)節(jié)半胱氨酸蛋白酶8(caspase-8)靶位活性而抑制Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[33]。青霉酸作為群體感應(yīng)抑制劑能顯著提高活細(xì)胞比例和中心感染數(shù)，但對相應(yīng)的噬菌體裂解量影響較小[34]。

6 青霉酸檢測方法

6.1 免疫學(xué)方法

6.1.1 酶聯(lián)免疫法

通過青霉酸與牛血清白蛋白、卵清白蛋白結(jié)合制備青霉酸完全抗原，通過人工抗原免疫小鼠獲得特異性單克隆抗體[35-36]。在此基礎(chǔ)上采用酶聯(lián)免疫吸附法來測定樣品中青霉酸含量。酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、安全性高、操作簡便等特點(diǎn)，但由于樣品中存在的復(fù)雜成分會干擾抗原-抗體反應(yīng)的專一性，因而與色譜學(xué)方法相比，ELISA法對基質(zhì)的要求更高，一般不能同時(shí)檢測多種毒素。

6.1.2 免疫金標(biāo)記法

免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)；朱麗等[37]探討了膠體金標(biāo)記抗圓弧青霉菌毒素—青霉酸單克隆抗體探針的制備方法，摸索其最佳反應(yīng)條件并對其活性進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，膠體金標(biāo)記抗青霉酸單克隆抗體的最佳pH為8.2，1 mL膠體金標(biāo)記的最小蛋白質(zhì)量為25 μg。金標(biāo)體與二抗發(fā)生牢固結(jié)合，即金標(biāo)探針具有活性。

6.2 理化分析方法

6.2.1 薄層層析法

Golinski等[38]建立了谷物(大麥、玉米、燕麥、黑麥和小麥樣品)中青霉酸的薄層色譜檢測方法。采用甲苯-乙酸乙酯-90%甲酸作為薄層色譜的展開劑，將展開的色譜板進(jìn)一步暴露于吡啶、乙酸酐或它們的混合物蒸汽中，通過這種處理將青霉酸轉(zhuǎn)化為新的熒光化合物，并在365 nm處檢測。

6.2.2 氣相色譜法

采用三甲基硅烷衍生或使用非衍生固定劑3%的聚碳硼烷-甲基硅氧烷(Dexsil 300)，應(yīng)用OV-17 OV-25毛細(xì)管建立青霉酸氣相色譜檢測方法，青霉酸定量限為25 ng。建立了在發(fā)霉的玉米樣品中同時(shí)提取和檢測青霉酸和展青霉素的氣相色譜方法。

6.2.3 高效液相色譜法

采用高效液相色譜法將對酞內(nèi)酰胺苯甲酸氯(PIB-CL)作為柱前衍生試劑對青霉酸進(jìn)行衍生反應(yīng)，在乙腈-水(47∶53，V/V)為流動相的條件下，采用ODS柱，紫外檢測器分離(λ=300 nm)青霉酸[39]；應(yīng)用反相高效液相色譜法分離青霉酸，以乙腈-水-冰醋酸作為流動相，采用10 μm色譜柱，在紫外(UV)254 nm處進(jìn)行檢測。在5～500 μg/mL的線性范圍內(nèi)，青霉酸的最低檢出限為5 ng，尿和膽汁樣品加標(biāo)回收率為92%～105%[40]。

6.2.4 質(zhì)譜分析法

目前色譜質(zhì)譜聯(lián)用在真菌毒素檢測方面的應(yīng)用越來越普遍[41-43]。一種同時(shí)分析奶酪中的9種真菌毒素(黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1，赭曲霉毒素A、霉酚酸、青霉酸和婁底青霉素C)的檢測方法，該方法包括液相萃取-高效液相色譜的分析物的分離和質(zhì)譜檢測，樣品加標(biāo)濃度在5～200 μg/kg范圍內(nèi)，青霉酸的定量限為5 μg/kg，平均回收率為96%～143%[44]；一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法同時(shí)測定小麥、大麥和燕麥中曲霉、鐮刀菌、青霉菌、麥角真菌產(chǎn)生的31種真菌毒素的方法，包括溶劑自動萃取、過濾、濃縮與粗提物的分析，反相色譜分離，電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，負(fù)離子模式，青霉酸在小麥中的最低檢出限為15 μg/kg，定量限為35 μg/kg，平均回收率為70%～108%[45]；一種能同時(shí)測定開心果、小麥、花生、玉米、玉米片中33種霉菌毒素的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，反相色譜分離，電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，正離子模式[46]；Vishwanath等[47]建立了一種同時(shí)測定室內(nèi)基質(zhì)中186種真菌和細(xì)菌代謝物的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，青霉酸基質(zhì)抑制效應(yīng)為(67±4)%，最低檢出限為38.0 μg/kg；Varga等[48]建立了一種同時(shí)測定杏仁、花生、榛子和開心果中191種真菌代謝產(chǎn)物的測定方法，該方法包括歐盟法典和食品法典所有規(guī)定真菌毒素，樣品用酸化乙腈-水溶液提取，提取液稀釋，直接注入U(xiǎn)HPLC-MS/MS系統(tǒng)，正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測。

7 青霉酸的污染防控

良好田間操作(GAP)可減少青霉酸的污染，通過良好的田間管理來抑制青霉酸的產(chǎn)生被認(rèn)為是最有效的防控策略。青霉菌、曲霉菌容易在植物體受傷位置繁殖生長，所以防止植物體的機(jī)械或害蟲損傷能很大程度上減少青霉酸的污染。飼料中青霉酸等霉菌毒素的污染可以從多種途徑進(jìn)行，加強(qiáng)對飼料的監(jiān)測，防止飼料原料在生產(chǎn)前就霉變，發(fā)現(xiàn)被污染的飼料，立即剔除；在飼料中加入足量的防霉劑，飼料中添加防霉劑是預(yù)防霉變的重要措施[49-50]。

谷物中青霉酸的產(chǎn)后防控策略主要是采用不同的處理方法將其高效、安全地清除，控制好飼料原料的質(zhì)量、儲藏及其加工運(yùn)輸過程，特別是控制好飼料的水分及高溫制粒后的降溫過程，是污染消除的關(guān)鍵。對于已經(jīng)被青霉酸污染的飼料可以用物理或者化學(xué)方法加以去除。許多研究表明，通過物理、化學(xué)、生物、熱滅活、輻射等方法，可去除飼料中多種霉菌毒素或使其在不同程度下失活，如在飼料中添加可吸附霉菌毒素的物質(zhì)：鋁硅酸鹽類、活性炭，沸石，酵母或酵母細(xì)胞壁成分等[51]，使毒素在經(jīng)動物腸道時(shí)不被吸收，直接排出體外[52]；微生物的降解為控制青霉酸的污染提供了新的思路，可以利用微生物之間的競爭作用篩選出能抑制產(chǎn)毒霉菌生長的菌株，以降低青霉酸的污染[53-54]。

8 展望

青霉酸同時(shí)具有抗菌、抗腫瘤的活性[55]。青霉酸在1～25 μg/mL最小抑菌濃度(MIC)范圍內(nèi)，具有較高的體外抗疫霉菌(Phytophthoraspp)活性。青霉酸能誘導(dǎo)辣椒疫霉菌(P.capsici)頂端分枝、菌絲體腫脹，惡疫霉菌(P.cactorum)菌絲頂端不規(guī)則分枝和小球形腫脹，栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)有不規(guī)則的分枝和腫脹，德雷疫霉(P.drechsleri)菌絲頂端或附近不規(guī)則的球形膨脹[56]。對12種植物病原細(xì)菌進(jìn)行體外青霉酸抗菌活性測試，結(jié)果表明，青霉酸在12.3～111.1 μg/mL MIC值范圍內(nèi)能抑制所有細(xì)菌病原體的生長；青霉酸在111.1 μg/mL和333.3 μg/mL濃度條件下能有效抑制桃離體葉片細(xì)菌性斑點(diǎn)病，抑制率分別為82.4%和94.1%[57]。青霉酸對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有抑制作用，青霉酸可作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中新型植物殺菌劑開發(fā)的先導(dǎo)分子。近年來，真菌毒素污染問題引起人們的廣泛關(guān)注，而青霉酸是霉變飼料中的高產(chǎn)型真菌毒素，對各種動物都具有不同程度的毒性，更應(yīng)引起我們的重視。目前，研究主要集中于青霉酸的單一毒性，但在飼料及飼料原料中通常不僅僅存在青霉酸，還存在其他毒素，混和毒素的攝入對健康造成的不良影響比單一毒素的攝入風(fēng)險(xiǎn)更大。而3種或更多種真菌毒素的聯(lián)合毒性的報(bào)道較少，且真菌毒素聯(lián)合毒性的機(jī)理尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。另外，隨著人們對青霉酸毒性機(jī)理的進(jìn)一步了解和對青霉酸檢測技術(shù)、脫毒方法研究的日漸深入，加強(qiáng)飼料防霉脫毒工作，降低對人和動物的危害，也是今后的研究方向。