楊銀平 律廣富 張 喬 姚夢(mèng)杰 梁新合 李 莖 張 輝 孫佳明

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，長(zhǎng)春 130117)

1 引 言

阿爾茨海默病(AD)是癡呆的主要形式之一，是以老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)和海馬神經(jīng)元丟失為主要病理特征，以記憶力減退、認(rèn)知功能障礙為主要臨床特征的神經(jīng)退行性疾病[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，AD經(jīng)典的發(fā)病機(jī)制主要包括氧化應(yīng)激反應(yīng)、Aβ淀粉樣蛋白沉積、tau蛋白異常磷酸化等[2]，氧化應(yīng)激作為與神經(jīng)退行性疾病發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的重要病理機(jī)制之一，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)高度敏感的情況下可引起蛋白、脂質(zhì)及DNA氧化修飾，繼而引發(fā)線(xiàn)粒體功能障礙，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[3]。谷氨酸作為神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛分布在神經(jīng)中樞系統(tǒng)中，在神經(jīng)病理情況下，由于神經(jīng)細(xì)胞損傷后興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的反向轉(zhuǎn)運(yùn)激活，神經(jīng)末梢釋放大量谷氨酸，致使“谷氨酸泄漏”(Glutamate leakage)，累積大量谷氨酸引起的基于氧化應(yīng)激和線(xiàn)粒體功能障礙的神經(jīng)毒性和細(xì)胞毒性[4,5]，最終導(dǎo)致神經(jīng)死亡而引發(fā)AD等神經(jīng)退行性疾病。

人參皂苷被認(rèn)為是人參中主要有效成分和生理活性成分，具有保護(hù)腦組織和神經(jīng)細(xì)胞、改善學(xué)習(xí)和記憶功能。人參皂苷可以調(diào)節(jié)谷氨酸誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和線(xiàn)粒體功能障礙，可能對(duì)預(yù)防和治療神經(jīng)退行性疾病起到關(guān)鍵作用[6,7]。其中，人參皂苷元可調(diào)節(jié)神經(jīng)元對(duì)神經(jīng)傳遞興奮的反應(yīng)或壓力，非皂苷元部分治療改善了老年老鼠的記憶力衰退[8]。研究表明，人參皂苷Rb1可以改善AD的小鼠臨床癥狀，其潛在機(jī)制可能與AD小鼠的卵磷脂、氨基酸和鞘脂類(lèi)代謝有關(guān)[9]，但體外細(xì)胞代謝研究較少，AD可能與細(xì)胞代謝物不平衡之間有一定的關(guān)系，但具體代謝調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。

細(xì)胞代謝組學(xué)研究能夠直接描述特定細(xì)胞類(lèi)型的代謝，快速直觀，干擾小，是微觀生命體的宏觀表現(xiàn)。目前，尚未有應(yīng)用1H NMR技術(shù)分析人參皂苷Rb1對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)損傷的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的細(xì)胞代謝組學(xué)研究報(bào)道。本研究應(yīng)用基于1H NMR的細(xì)胞代謝學(xué)技術(shù)對(duì)谷氨酸損傷和人參皂苷Rb1保護(hù)的SH-SY5Y細(xì)胞中的內(nèi)源性代謝物變化進(jìn)行考察，篩選鑒定各組細(xì)胞差異代謝物和分析主要代謝途徑，在細(xì)胞水平上，系統(tǒng)探討了人參皂苷Rb1保護(hù)氧化損傷神經(jīng)細(xì)胞的作用機(jī)制。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

500 MHzAvance Ⅲ NMR譜儀(德國(guó)Bruker公司); CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司); CKX41熒光倒置式基礎(chǔ)型顯微鏡(日本Olympus公司); 流式細(xì)胞儀(美國(guó)Merck-Millipore公司); BP211D 型十萬(wàn)分之一電子天平(北京賽多利斯天平有限公司); Model 680型酶標(biāo)儀(日本Takara公司); KQ5200 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); Microfuge?22R Centrifuge高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司); HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市榮華儀器制造有限公司); 微孔濾器(美國(guó) Millipore公司); 多規(guī)格培養(yǎng)皿(美國(guó)Corning公司); Milli-Q超純水儀(美國(guó)Bedford公司)。

人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所); 胎牛血清(FBS，美國(guó)Gibico公司); DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(美國(guó)Hyclone公司); 雙抗(100 μg/mL 鏈霉素和100 U/mL 青霉素，美國(guó)Hyclone公司); 胰蛋白酶(美國(guó)Amresco公司); 噻唑藍(lán)(MTT，美國(guó)Amresco公司); 二甲基亞砜(DMSO，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所); Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡診斷試劑盒(四正柏生物有限公司); TSP-d4(青島騰龍微波科技有限公司); 重水(D2O，青島騰龍微波科技有限公司); NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O(汕頭市西隴化工廠)。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1MTT法測(cè)定SH-SY5Y細(xì)胞存活率選用AD體外SH-SYSY細(xì)胞谷氨酸損傷模型[10]。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SH-SY5Y)購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)，置于37℃、5% CO2的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，用含有10%(V/V)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。傳代3次后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，接種于96孔板，每孔100 μL(4×103細(xì)胞/孔)。培養(yǎng)24 h后，造模，設(shè)置模型組和對(duì)照組則和人參皂苷Rb1保護(hù)組，每組設(shè)置6個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以DMEM培養(yǎng)液配制人參皂苷Rb1至工作濃度(0.1、1、10、50、100和200 μg/mL)進(jìn)行體外保護(hù)作用考察，考察時(shí)間設(shè)置為 24、48和72 h。離心，棄去培養(yǎng)液，每孔加入含20% MTT(5 mg/mL)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL，4 h后，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，置酶標(biāo)儀中振蕩10 min，使結(jié)晶溶解，顏色均勻。在490 nm處測(cè)量各孔的吸光值，重復(fù)3次，按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率: 存活率(Survival rate, SR, %)=(OD樣品組-OD空白組)/(OD正常組-OD空白組)。

2.2.2AnnexinV/PI雙染法對(duì)細(xì)胞凋亡的分析細(xì)胞凋亡是AD發(fā)病過(guò)程中的一個(gè)重要病理環(huán)節(jié)，是細(xì)胞死亡的一種基本形式，線(xiàn)粒體在谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在該方法中，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白(Annexin V)可用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡[11]。碘化丙啶(PI)被用于區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞。本研究考察人參皂苷Rb1對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞系是否有誘導(dǎo)凋亡的保護(hù)作用，設(shè)置模型組、對(duì)照組和人參皂苷Rb1保護(hù)組(100 μg/mL)，作用于SH-SY5Y細(xì)胞24、48和72 h后，用Annexin V/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。

2.2.3細(xì)胞代謝組學(xué)樣本制備參考文獻(xiàn)[12]，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1×105接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h，設(shè)置模型組、對(duì)照組和人參皂苷Rb1保護(hù)組，每組設(shè)置6個(gè)平行瓶。模型組和人參皂苷Rb1保護(hù)組的每個(gè)樣品瓶加10 mL 30 mmol/L谷氨酸DMEM溶液，正常組每瓶加10 mL 含F(xiàn)BS的DMEM完全細(xì)胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h，給藥保護(hù)組加入含50 μg/mL人參皂苷Rb1的培養(yǎng)液10 mL，模型組、空白組加入DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液10 mL，作用24 h后，分別吸取培養(yǎng)液，在4℃以1000 r/min離心10 min。用PBS洗培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞8次，以0.25% 胰蛋白酶消化細(xì)胞，用PBS溶液分別輕吹打培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)和離心管底部的細(xì)胞，合并對(duì)應(yīng)的兩組細(xì)胞后,在相同條件下離心清洗2次。再次棄去上清后，迅速放入液氮中淬滅細(xì)胞，-80℃保存過(guò)夜。 取出細(xì)胞和培養(yǎng)液，于4℃反復(fù)凍融5次，加入甲醇-水(1∶2，V/V)溶液，適當(dāng)渦旋后，于冰浴下超聲破碎(超聲設(shè)置為運(yùn)行5 s，停頓9 s，20 min)，充分釋放細(xì)胞內(nèi)容物。在4℃以13000 r/min離心10 min，取上清液，凍干，供細(xì)胞代謝組學(xué)用。

2.2.4細(xì)胞代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集細(xì)胞凍干粉溶于600 μL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.005% TSP 10%重水, pH 7.4)，在4℃以13000 r/min 離心10 min, 取上清液，于5 mm NMR 管中進(jìn)行測(cè)試。所有樣品均在25℃下于Bruker Avance Ⅲ 500譜儀上完成(頻率500 MHz)。采用 NOSEY序列測(cè)試, 弛豫延遲 320 ms, 譜寬12019.12 Hz, 掃描次數(shù)為64次，以TSP為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

2.3 數(shù)據(jù)處理

原始核磁文件采用MestReNova進(jìn)行處理。核磁圖譜經(jīng)過(guò)定位、基線(xiàn)校準(zhǔn)，歸一化后，在δ0～9 ppm區(qū)域按δ0.04 ppm等間隔分段積分，其中δ4.80～5.06 ppm(殘余水峰)不進(jìn)行積分，將積分后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel程序中進(jìn)行整理。所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 11.0軟件中進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)。

圖1 人參皂苷Rb1對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響(x±s, n=3)。*p<0.05: 與模型組相比; #p<0.05: 與48 h相比; ▲p<0.05: 與24 h相比; ▼p<0.05: 與24 h相比。Fig.1 Survival rate of SH-SY5Y cell induced by glutamic acid after treated with ginsenoside Rb1, (x±s, n=3). *p<0.05, compared with corresponding model groups; #p<0.05, compared with the 48h group; ▲p<0.05, compared with the 24 h group; ▼p<0.05, compared with the 24 h group

3 結(jié)果與討論

3.1 人參皂苷Rb1對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

基于人參皂苷Rb1對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的作用，研究其對(duì)氧化損傷神經(jīng)細(xì)胞增殖的影響。以正常對(duì)照組細(xì)胞存活率(100%)為參照，人參皂苷Rb1作用較低濃度(0.1、1、10和50 μg/mL)時(shí)，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴(lài)性，隨著劑量和作用時(shí)間增加，細(xì)胞存活率逐漸增強(qiáng)，48和72 h存活率呈現(xiàn)較明顯的上升趨勢(shì)。經(jīng)計(jì)算，人參皂苷Rb1作用48 h后細(xì)胞存活率達(dá)到88.10%±0.01%; 72 h后的細(xì)胞存活率達(dá)到95.57%±0.05%(圖1)。結(jié)果表明，人參皂苷Rb1對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。

3.2 人參皂苷Rb1對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

圖2 流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC 雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡Fig.2 Cell apoptosis detected by flow cytometry with Annexin V-FITC double staining

細(xì)胞經(jīng)Annexin V-FITC和PI雙染，從對(duì)照組細(xì)胞流式散點(diǎn)圖(圖2)左下象限可見(jiàn)，早期有極少熒光信號(hào)，說(shuō)明正常生長(zhǎng)的細(xì)胞幾乎無(wú)凋亡現(xiàn)象。而谷氨酸作用于SH-SY5Y細(xì)胞24、48和72 h后的模型組凋亡細(xì)胞比例逐漸增高，并于72 h達(dá)到最高，早期和晚期細(xì)胞凋亡率之和為49.3%。人參皂苷Rb1保護(hù)組作用于谷氨酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞24、48和72 h 后，可見(jiàn)凋亡細(xì)胞比例先上升達(dá)到最大，48 h時(shí)細(xì)胞早期和晚期凋亡率之和為42.5%，逐漸下降并于72 h達(dá)到36.8%，上述結(jié)果表明, 人參皂苷Rb1對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷活性有一定的保護(hù)作用。

3.3 細(xì)胞代謝組學(xué)的核磁圖譜指認(rèn)

圖3 對(duì)照組、模型組、人參皂苷Rb1保護(hù)組的SH-SY5Y細(xì)胞1H NMR指紋圖譜: A、B、C分別為δ 0.7～2.5 ppm、 δ 2.6～4.6 ppm和δ 5.7～9.0 ppm的1H NMR譜圖，a、b、c分別代表對(duì)照組、模型組和人參皂苷Rb1保護(hù)組Fig.3 1H NMR fingerprint spectra (A: δ 0.7～2.5 ppm, B: δ 2.6～4.6 ppm, C: δ 5.7～9.0 ppm) of SH-SY5Y cell from control group (a) , model group (b) and ginsenoside Rb1 treatment group (c)

應(yīng)用優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件獲取細(xì)胞代謝組學(xué)的核磁數(shù)據(jù)，通過(guò)分析化學(xué)位移、峰型及耦合常數(shù)等核磁數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻(xiàn)[13～22]對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了指認(rèn)。圖3為典型的對(duì)照組、人參皂苷Rb1保護(hù)組和模型組的1H NMR指紋譜，鑒定出包括氨基酸、有機(jī)酸、脂類(lèi)等29種化合物。直觀分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞經(jīng)谷氨酸處理前后，化學(xué)成分差異較大。

3.4 谷氨酸損傷SH-SY5Y細(xì)胞的代謝組學(xué)分析

為闡明SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)谷氨酸處理前后的化學(xué)差異，對(duì)經(jīng)MestRoNova處理后數(shù)據(jù)進(jìn)一步采用多元統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行分析。主成分分析(PCA)是目前最常用的無(wú)監(jiān)督分析方法之一，通過(guò)降低維度的思想把相關(guān)性的指標(biāo)轉(zhuǎn)化為幾個(gè)具有更高聚合度的主成分指標(biāo)，可以最大限度地體現(xiàn)數(shù)據(jù)特征[23]。圖4A為SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)谷氨酸處理前后的PCA得分散點(diǎn)圖(PC1: 0.65; PC2: 0.22)，空白對(duì)照組和模型組組間分離明顯，這可能是由于谷氨酸損傷的細(xì)胞代謝發(fā)生異常所致，由此推斷模型組細(xì)胞發(fā)生了顯著變化。有監(jiān)督的PLS-DA 排列實(shí)驗(yàn)(Permutation test)通常用于判別建立模型的有效性和模型的穩(wěn)定性，即原始模型的預(yù)測(cè)能力大于任何一次隨機(jī)排列y變量的預(yù)測(cè)能力，該分析結(jié)果(圖4B)顯示模型有效穩(wěn)定，預(yù)測(cè)性能高。OPLS-DA方法去除與樣品的分類(lèi)不相關(guān)的干擾因素，即進(jìn)一步消除非谷氨酸作用的影響，使組間分離最大化，并尋找差異性代謝物。OPLS-DA(圖4C)顯示谷氨酸造模有效。由表1可知，對(duì)照組和模型組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合載荷圖(圖4D)和VIP分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖4 對(duì)照組(■ )和模型組(●)細(xì)胞基于1H NMR的細(xì)胞代謝組學(xué)下的PCA得分圖(A)、PLS-DA圖(B)、OPLS-DA得分圖(C)和OPLS-DA載荷圖(D)Fig.4 Principal component analysis (PCA) scores plot (A), partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) plot (B), orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) score plot (C) and loading plot (D) based on1H NMR-metabolomics of cell from control group (■) and model group (●)

對(duì)正常對(duì)照組和模型組進(jìn)行建模比對(duì)，將VIP>1及t檢驗(yàn)(p<0.05)的24種差異代謝物帶入MetaboAnlyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca/)在線(xiàn)分析平臺(tái)，選擇Homo sapiens (human)路徑庫(kù)作為代謝通路數(shù)據(jù)庫(kù)，Hypergeometric Test作為通路富集分析，Relative-betweeness centrality分析通路拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，篩選出代謝通路影響值大于0.10的代謝通路。如圖5所示，確定24種差異代謝物(見(jiàn)表1)分別分布于代謝通路中，表明谷氨酸可能對(duì)以上通路造成代謝紊亂，使造模細(xì)胞在整體狀態(tài)上失調(diào)。其中，有6種代謝物在模型組中表現(xiàn)為上調(diào)，18種代謝物在模型組中為下調(diào)。

3.5 人參皂苷Rb1對(duì)谷氨酸損傷SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)的代謝組學(xué)分析

以相同的方法處理對(duì)照組、模型組和人參皂苷Rb1保護(hù)組的細(xì)胞代謝組學(xué)數(shù)據(jù)矩陣，由PC1(0.55)和PC2(0.20)為坐標(biāo)軸構(gòu)建的PCA得分散點(diǎn)圖(圖6A)可見(jiàn)，3組樣本能夠明顯分開(kāi)，人參皂苷Rb1保護(hù)組的代謝輪廓離開(kāi)模型組，并有向?qū)φ战M靠近的趨勢(shì)，表明人參皂苷Rb1對(duì)模型細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。PLS-DA模型驗(yàn)證顯示，模型有效可靠(圖6B)。由3組OPLS-DA得分圖(圖6C，R2=0.22，Q2=0.45)可見(jiàn)，對(duì)照組、模型組和人參皂苷Rb1保護(hù)組具有明顯差異。采用有監(jiān)督的OPLS-DA獲取3組間的潛在差異生物標(biāo)記物，對(duì)載荷圖(圖6D)和VIP值進(jìn)行分析。

表1 對(duì)照組與模型組差異代謝物鑒定與代謝通路分析

Table 1 Identified biomarkers and pathway of control group compared with the control group

化學(xué)位移δ (ppm)代謝物MetabolitesVIP變化趨勢(shì)Trend相關(guān)通路Ralated pathway3.39Scyllo-inositol7.04↑**—1.23β-Hydroxybutyrate2.61↑**Butanoate metabolism1.19Ethanol2.19↑**Glycolysis or Gluconeogenesis1.35Threonine2.14↓**Glycine, serine and threonine metabolism0.91Pantothenic acid2.11↓**Pantothenate and CoA biosynthesis0.95Leucine1.99↓**Valine, leucine and isoleucine degradation/Valine, leucine and isoleucine biosynthesis3.67Glycerinum1.95↑**—0.87Lipid1.77↓**—0.99Isoleucine1.66↓*Valine, leucine and isoleucine biosynthesis3.71Glycine1.50↑*Glycine, serine and threonine metabolism/Primary bile acid biosynthesis1.71Arginine1.46↓**Arginine and proline metabolism1.91Acetic acid1.43↓**Pyruvate metabolism/Sulfur metabolism3.03Creatine1.43↓**Arginine and proline metabolism/Glycine, serine and threonine metabolism3.87Inosine1.36↓*Purine metabolism1.47Alanine1.31↓**Alanine, aspartate and Glutamate metabolism/Taurine and hypotaurine metabolism2.03Proline1.27↓**Arginine and proline metabolism2.11Glutamic acid1.24↑*Alanine, aspartate and Glutamate metabolism/D-Glutamine and D-Glutamate metabolism4.15Uridine1.14↓*Pyrimidine metabolism3.19Choline1.12↓**Glycerophospholipid metabolism1.03Valine1.04↓*Valine, leucine and isoleucine biosynthesis3.23Histidine1.04↓**Histidine metabolism3.07Lysine1.04↓*Lysine degradation/Lysine biosynthesis/Aminoacyl-tRNA biosynthesis8.47Formic acid1.01↓**Glyoxylate and dicarboxylate metabolism/Methane metabolism1.27Acetoacetate1.01↓**Synthesis and degradation of ketone bodies/Butanoate metabolism/Propanoate metabolisma“↑”“↓”分別代表模型組與正常對(duì)照組相比的變化趨勢(shì),**p< 0.01模型組與正常對(duì)照組相比,*p<0.05模型組與正常對(duì)照組相比。a“↑” and “↓” represent the compound as up and down regulated in the model group compared with the control roup. **p< 0.01, *p<0.05, model group compared with control group

圖5 對(duì)照組和模型組細(xì)胞代謝物組學(xué)圖

酮體的合成和降解(a)，精氨酸和脯氨酸代謝(b)，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(c)，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(d)，泛酸和輔酶A生物合成(e)，賴(lài)氨酸降解(f)，甲烷代謝(g)，二羧酸代謝(h)，組氨酸代謝(i)，氨酰tRNA生物合成(j)，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝(k)

Fig.5 Metabolome view of control group and model group

Synthesis and degradation of ketone bodies (a), arginine and proline metabolism (b), glycine, serine and threonine metabolism (c), alanine, aspartic acid and glutamate metabolism (d) , pantothenic acid and coenzyme A biosynthesis (e), lysine degradation (f), methane metabolism (g), dicarboxylic acid metabolism (h), histidine metabolism (i), aminoacyl tRNA biosynthesis (j),D-glutamine andD-glutamate metabolism (k)

圖6 人參皂苷Rb1保護(hù)組(■)、對(duì)照組(◆)和模型組(●)細(xì)胞基于1H NMR的細(xì)胞代謝組學(xué)下的PCA得分圖(A)、PLS-DA圖(B)、OPLS-DA得分圖(C)和OPLS-DA載荷圖(D)Fig.6 PCA scores plot (A), PLS-DA plot (B), OPLS-DA score plot (C) and loading plot (D) based on1H NMR-metabolomics of cell from ginsenoside Rb1 treatment group, control group and model group

為探索以上獲得的代謝差異物涉及的代謝通路，采用MetaboAnalyst 3.0中的Pathway Analysis數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析。將多元統(tǒng)計(jì)分析所得的VIP>1及單因素方差分析(p<0.05)的7種代謝差異物(表2)導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出與差異代謝物密切相關(guān)的代謝通路(圖7)。代謝通路影響值大于0.10的靶標(biāo)代謝路徑中，代謝通路圓點(diǎn)越大表示對(duì)代謝組學(xué)的重要性越大，其中影響最大的為牛磺酸和亞?；撬岽x(圖7a)。代謝通徑顏色越深，表示代謝通路分析的富集性越大，其中最強(qiáng)的也是?；撬岷蛠喤；撬岽x(圖7a)。谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷給藥保護(hù)后代謝物的變化主要涉及?；撬岷蛠喤；撬岽x(圖7a)，精氨酸和脯氨酸代謝(圖7b)，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(圖7c)，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝(圖7d)，丙酮酸代謝(圖7e)等代謝通路。以上這些通路分別與能量代謝及氨基酸代謝緊密相關(guān)，表明人參皂苷Rb1主要通過(guò)對(duì)以上5種通路對(duì)模型細(xì)胞代謝產(chǎn)生影響，使模型細(xì)胞在整體代謝狀態(tài)上回調(diào)，此結(jié)論與谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞所影響的代謝通路大多相同[12]。與模型組相比，?；撬?、乙酸、精氨酸、肌酸、脯氨酸和丙氨酸6種代謝差異物在人參皂苷Rb1保護(hù)組中表現(xiàn)為上調(diào)，谷氨酸在人參皂苷Rb1保護(hù)組中表現(xiàn)為下調(diào)。

表2 模型組與人參皂苷Rb1保護(hù)組差異代謝物鑒定與代謝通路分析

Table 2 Identified biomarkers and pathway of ginsenoside Rb1 group compared with the control group and the model group

化學(xué)位移Chemical shift(ppm)VIP value代謝物Metabolites變化趨勢(shì)Trenda相關(guān)通路 Ralated pathway2.111.97Glutamic acid↓*Alanine, aspartate and Glutamate metabolism/D-Glutamine and D-Glutamate metabolism3.271.76Taurine↑*Taurine and hypotaurine metabolism/Primary bile acid biosynthesis1.911.26Acetic acid↑*Pyruvate metabolism/Sulfur metabolism1.711.21Arginine↑*Arginine and proline metabolism/Aminoacyl-tRNA biosynthesis3.031.18Creatine↑*Arginine and proline metabolism/Glycine, serine and threonine metabolism1.471.1Alanine↑**Alanine, aspartate and Glutamate metabolism/Taurine and hypotaurine metabolism2.031.04Proline↑*Arginine and proline metabolism/Aminoacyl-tRNA biosynthesisa“↑”“↓”分別代表人參皂苷Rb1給藥保護(hù)組與模型組與對(duì)照組相比的變化趨勢(shì),**p<0.01模型組與對(duì)照組相比,*p<0.05模型組與對(duì)照組相比。a “↑” and “↓” represent the compound as up and down regulated in ginsenoside Rb1 treatment group compared with model group. **p<0.01,*p<0.05, model group compared with control group.

圖7 人參皂苷Rb1給藥保護(hù)組、模型組、正常對(duì)照組差異性代謝物通路得分圖?；撬岷蛠喤；撬岽x(a)，精氨酸和脯氨酸代謝(b)，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(c)，D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代謝(d)，丙酮酸代謝(e)Fig.7 Metabolome view of ginsenoside Rb1 group, control group and model groupTaurine and hypotaurine metabolism(a); Arginine and proline metabolism(b); Alanine, aspartate and Glutamate metabolism(c); D-glutamine and D-glutamate metabolism(d); Pyruvate metabolism(e)

?；撬嵩跈C(jī)體中有抗氧化和清除自由基的能力，與?；撬岷蛠喤；撬岽x密切相關(guān)，對(duì)抗老年癡呆患者神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和衰老有重要意義。研究表明，?；撬崮軌驂垙?qiáng)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，機(jī)體內(nèi)?；撬峒皝喤；撬岷扛淖兗按x異?？赡軙?huì)造成記憶能力下降和認(rèn)知功能障礙，而且與神經(jīng)元的衰老進(jìn)程密切相關(guān)。?；撬崾菂⑴c多個(gè)氨基酸代謝與能量代謝的關(guān)鍵蛋白轉(zhuǎn)化節(jié)點(diǎn)，由谷氨酸脫羧酶活性異常引起的?；撬岷蛠喤；撬岽x紊亂可能導(dǎo)致大腦性麻痹癥狀的發(fā)生。谷氨酸損傷的SH-SY5Y細(xì)胞通過(guò)給予人參皂苷Rb1保護(hù)后，發(fā)現(xiàn)?；撬岷匡@著增高，代謝恢復(fù)正常，提示人參皂苷Rb1通過(guò)調(diào)節(jié)改善牛磺酸和亞?；撬岽x而達(dá)到緩解和治療AD的作用。

脯氨酸在機(jī)體內(nèi)要經(jīng)谷氨酸才能被代謝，可導(dǎo)致谷氨酸代謝紊亂, 阻止谷氨酸攝取[12]。與模型組相比，人參皂苷Rb1給藥保護(hù)組脯氨酸含量明顯升高。因此AD患者機(jī)體內(nèi)一種氨基酸的代謝紊亂可能同時(shí)干擾其它多種活性物質(zhì)的改變，導(dǎo)致多種氨基酸代謝的異常。

谷氨酸和天冬氨酸作為神經(jīng)系統(tǒng)中重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)中，能引起突觸后膜去極化。當(dāng)與AD發(fā)病相關(guān)的神經(jīng)元細(xì)胞過(guò)度興奮時(shí)，短時(shí)間內(nèi)釋放大量谷氨酸和天冬氨酸，使得局部含量超標(biāo)，產(chǎn)生較嚴(yán)重的神經(jīng)毒性，可加速神經(jīng)元細(xì)胞變性死亡。與模型組相比，人參皂苷Rb1保護(hù)組谷氨酸含量顯著下降，可見(jiàn)人參皂苷Rb1能通過(guò)對(duì)谷氨酸的回調(diào)從而達(dá)到治療AD的作用。

丙酮酸是代謝過(guò)程中重要的中間產(chǎn)物，丙酮酸累積可以加速機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致能量代謝異常，是加速腦體功能下降。與模型組相比，人參皂苷Rb1保護(hù)組的乙酸含量顯著上升，表示丙酮酸累積減少可使丙酮酸代謝正常進(jìn)行，人參皂苷Rb1給藥后能抑制腦體功能下降幅度, 對(duì)AD起到治療作用。

甘氨酸是神經(jīng)系統(tǒng)的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，與AD患者體內(nèi)蘇氨酸利用降低及絲氨酸的利用升高密切相關(guān)。細(xì)胞可以從甘氨酸合成絲氨酸，并且絲氨酸在細(xì)胞膜及神經(jīng)鞘的合成中都發(fā)揮著作用。研究結(jié)果表明，細(xì)胞損傷后絲氨酸含量的降低可以抑制活性氧(ROS)和炎癥因子的生成，與模型組相比, 人參皂苷Rb1給藥保護(hù)組甘氨酸含量明顯上升，其代謝異?？赡茉贏D發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。

泛酸和輔酶A生物合成、硫代謝、谷胱甘肽代謝、初級(jí)膽汁酸生物合成等為生物體內(nèi)最常見(jiàn)且必不可少的代謝方式，在AD的形成和治療中參與機(jī)體內(nèi)多種活性物質(zhì)的合成與代謝，在機(jī)體的學(xué)習(xí)記憶、神經(jīng)傳導(dǎo)和受體功能等方面發(fā)揮著重要作用。

4 結(jié) 論

人參皂苷Rb1通過(guò)減少谷氨酸誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡發(fā)揮對(duì)神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。本研究基于1H NMR細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)谷氨酸主要通過(guò)影響氨基酸代謝對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷作用，而人參皂苷Rb1通過(guò)上調(diào)谷氨酸損傷模型中的?；撬?、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸和蘇氨酸等15種代謝差異物，下調(diào)谷氨酸、β-羥基丁酸和鯊肌醇使SH-SY5Y細(xì)胞代謝整體回調(diào)，說(shuō)明人參皂苷Rb1主要通過(guò)影響多種能量及氨基酸代謝，在細(xì)胞整體水平上對(duì)氧化損傷神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。