楊銀平 律廣富 張 喬 姚夢杰 梁新合 李 莖 張 輝 孫佳明

(長春中醫(yī)藥大學吉林省人參科學研究院，長春 130117)

1 引 言

阿爾茨海默病(AD)是癡呆的主要形式之一，是以老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)和海馬神經(jīng)元丟失為主要病理特征，以記憶力減退、認知功能障礙為主要臨床特征的神經(jīng)退行性疾病[1]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，AD經(jīng)典的發(fā)病機制主要包括氧化應激反應、Aβ淀粉樣蛋白沉積、tau蛋白異常磷酸化等[2]，氧化應激作為與神經(jīng)退行性疾病發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的重要病理機制之一，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)高度敏感的情況下可引起蛋白、脂質(zhì)及DNA氧化修飾，繼而引發(fā)線粒體功能障礙，導致細胞損傷[3]。谷氨酸作為神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛分布在神經(jīng)中樞系統(tǒng)中，在神經(jīng)病理情況下，由于神經(jīng)細胞損傷后興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體的反向轉(zhuǎn)運激活，神經(jīng)末梢釋放大量谷氨酸，致使“谷氨酸泄漏”(Glutamate leakage)，累積大量谷氨酸引起的基于氧化應激和線粒體功能障礙的神經(jīng)毒性和細胞毒性[4,5]，最終導致神經(jīng)死亡而引發(fā)AD等神經(jīng)退行性疾病。

人參皂苷被認為是人參中主要有效成分和生理活性成分，具有保護腦組織和神經(jīng)細胞、改善學習和記憶功能。人參皂苷可以調(diào)節(jié)谷氨酸誘導氧化應激和線粒體功能障礙，可能對預防和治療神經(jīng)退行性疾病起到關(guān)鍵作用[6,7]。其中，人參皂苷元可調(diào)節(jié)神經(jīng)元對神經(jīng)傳遞興奮的反應或壓力，非皂苷元部分治療改善了老年老鼠的記憶力衰退[8]。研究表明，人參皂苷Rb1可以改善AD的小鼠臨床癥狀，其潛在機制可能與AD小鼠的卵磷脂、氨基酸和鞘脂類代謝有關(guān)[9]，但體外細胞代謝研究較少，AD可能與細胞代謝物不平衡之間有一定的關(guān)系，但具體代謝調(diào)節(jié)機制尚不清楚。

細胞代謝組學研究能夠直接描述特定細胞類型的代謝，快速直觀，干擾小，是微觀生命體的宏觀表現(xiàn)。目前，尚未有應用1H NMR技術(shù)分析人參皂苷Rb1對谷氨酸誘導損傷的神經(jīng)細胞保護的細胞代謝組學研究報道。本研究應用基于1H NMR的細胞代謝學技術(shù)對谷氨酸損傷和人參皂苷Rb1保護的SH-SY5Y細胞中的內(nèi)源性代謝物變化進行考察，篩選鑒定各組細胞差異代謝物和分析主要代謝途徑，在細胞水平上，系統(tǒng)探討了人參皂苷Rb1保護氧化損傷神經(jīng)細胞的作用機制。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

500 MHzAvance Ⅲ NMR譜儀(德國Bruker公司); CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司); CKX41熒光倒置式基礎(chǔ)型顯微鏡(日本Olympus公司); 流式細胞儀(美國Merck-Millipore公司); BP211D 型十萬分之一電子天平(北京賽多利斯天平有限公司); Model 680型酶標儀(日本Takara公司); KQ5200 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); Microfuge?22R Centrifuge高速低溫離心機(美國Beckman Coulter公司); HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市榮華儀器制造有限公司); 微孔濾器(美國 Millipore公司); 多規(guī)格培養(yǎng)皿(美國Corning公司); Milli-Q超純水儀(美國Bedford公司)。

人參皂苷Rb1標準品(中國藥品生物制品檢定所); 胎牛血清(FBS，美國Gibico公司); DMEM細胞培養(yǎng)液(美國Hyclone公司); 雙抗(100 μg/mL 鏈霉素和100 U/mL 青霉素，美國Hyclone公司); 胰蛋白酶(美國Amresco公司); 噻唑藍(MTT，美國Amresco公司); 二甲基亞砜(DMSO，天津市光復精細化工研究所); Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡診斷試劑盒(四正柏生物有限公司); TSP-d4(青島騰龍微波科技有限公司); 重水(D2O，青島騰龍微波科技有限公司); NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O(汕頭市西隴化工廠)。

2.2 實驗方法

2.2.1MTT法測定SH-SY5Y細胞存活率選用AD體外SH-SYSY細胞谷氨酸損傷模型[10]。人神經(jīng)母細胞瘤細胞株(SH-SY5Y)購自上海細胞庫，置于37℃、5% CO2的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，用含有10%(V/V)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。傳代3次后，取對數(shù)生長期細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，接種于96孔板，每孔100 μL(4×103細胞/孔)。培養(yǎng)24 h后，造模，設(shè)置模型組和對照組則和人參皂苷Rb1保護組，每組設(shè)置6個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以DMEM培養(yǎng)液配制人參皂苷Rb1至工作濃度(0.1、1、10、50、100和200 μg/mL)進行體外保護作用考察，考察時間設(shè)置為 24、48和72 h。離心，棄去培養(yǎng)液，每孔加入含20% MTT(5 mg/mL)的DMEM細胞培養(yǎng)液100 μL，4 h后，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，置酶標儀中振蕩10 min，使結(jié)晶溶解，顏色均勻。在490 nm處測量各孔的吸光值，重復3次，按以下公式計算細胞存活率: 存活率(Survival rate, SR, %)=(OD樣品組-OD空白組)/(OD正常組-OD空白組)。

2.2.2AnnexinV/PI雙染法對細胞凋亡的分析細胞凋亡是AD發(fā)病過程中的一個重要病理環(huán)節(jié)，是細胞死亡的一種基本形式，線粒體在谷氨酸誘導的細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。在該方法中，異硫氰酸熒光素(FITC)標記的膜聯(lián)蛋白(Annexin V)可用于檢測細胞凋亡[11]。碘化丙啶(PI)被用于區(qū)分存活的早期細胞和壞死或晚期凋亡細胞。本研究考察人參皂苷Rb1對谷氨酸誘導的SH-SY5Y細胞系是否有誘導凋亡的保護作用，設(shè)置模型組、對照組和人參皂苷Rb1保護組(100 μg/mL)，作用于SH-SY5Y細胞24、48和72 h后，用Annexin V/PI 細胞凋亡檢測試劑盒測定細胞凋亡情況。

2.2.3細胞代謝組學樣本制備參考文獻[12]，取對數(shù)生長期細胞，按1×105接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h，設(shè)置模型組、對照組和人參皂苷Rb1保護組，每組設(shè)置6個平行瓶。模型組和人參皂苷Rb1保護組的每個樣品瓶加10 mL 30 mmol/L谷氨酸DMEM溶液，正常組每瓶加10 mL 含F(xiàn)BS的DMEM完全細胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h，給藥保護組加入含50 μg/mL人參皂苷Rb1的培養(yǎng)液10 mL，模型組、空白組加入DMEM細胞培養(yǎng)液10 mL，作用24 h后，分別吸取培養(yǎng)液，在4℃以1000 r/min離心10 min。用PBS洗培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞8次，以0.25% 胰蛋白酶消化細胞，用PBS溶液分別輕吹打培養(yǎng)瓶內(nèi)和離心管底部的細胞，合并對應的兩組細胞后,在相同條件下離心清洗2次。再次棄去上清后，迅速放入液氮中淬滅細胞，-80℃保存過夜。 取出細胞和培養(yǎng)液，于4℃反復凍融5次，加入甲醇-水(1∶2，V/V)溶液，適當渦旋后，于冰浴下超聲破碎(超聲設(shè)置為運行5 s，停頓9 s，20 min)，充分釋放細胞內(nèi)容物。在4℃以13000 r/min離心10 min，取上清液，凍干，供細胞代謝組學用。

2.2.4細胞代謝組學數(shù)據(jù)采集細胞凍干粉溶于600 μL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.005% TSP 10%重水, pH 7.4)，在4℃以13000 r/min 離心10 min, 取上清液，于5 mm NMR 管中進行測試。所有樣品均在25℃下于Bruker Avance Ⅲ 500譜儀上完成(頻率500 MHz)。采用 NOSEY序列測試, 弛豫延遲 320 ms, 譜寬12019.12 Hz, 掃描次數(shù)為64次，以TSP為內(nèi)標物質(zhì)。

2.3 數(shù)據(jù)處理

原始核磁文件采用MestReNova進行處理。核磁圖譜經(jīng)過定位、基線校準，歸一化后，在δ0～9 ppm區(qū)域按δ0.04 ppm等間隔分段積分，其中δ4.80～5.06 ppm(殘余水峰)不進行積分，將積分后的數(shù)據(jù)導入Excel程序中進行整理。所得數(shù)據(jù)導入SIMCA-P 11.0軟件中進行多元統(tǒng)計分析，包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)。

圖1 人參皂苷Rb1對谷氨酸誘導的SH-SY5Y細胞存活率的影響(x±s, n=3)。*p<0.05: 與模型組相比; #p<0.05: 與48 h相比; ▲p<0.05: 與24 h相比; ▼p<0.05: 與24 h相比。Fig.1 Survival rate of SH-SY5Y cell induced by glutamic acid after treated with ginsenoside Rb1, (x±s, n=3). *p<0.05, compared with corresponding model groups; #p<0.05, compared with the 48h group; ▲p<0.05, compared with the 24 h group; ▼p<0.05, compared with the 24 h group

3 結(jié)果與討論

3.1 人參皂苷Rb1對谷氨酸誘導SH-SY5Y細胞存活率的影響

基于人參皂苷Rb1對谷氨酸誘導的SH-SY5Y細胞的作用，研究其對氧化損傷神經(jīng)細胞增殖的影響。以正常對照組細胞存活率(100%)為參照，人參皂苷Rb1作用較低濃度(0.1、1、10和50 μg/mL)時，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，隨著劑量和作用時間增加，細胞存活率逐漸增強，48和72 h存活率呈現(xiàn)較明顯的上升趨勢。經(jīng)計算，人參皂苷Rb1作用48 h后細胞存活率達到88.10%±0.01%; 72 h后的細胞存活率達到95.57%±0.05%(圖1)。結(jié)果表明，人參皂苷Rb1對谷氨酸誘導的SH-SY5Y細胞損傷具有一定的保護作用。

3.2 人參皂苷Rb1對谷氨酸誘導SH-SY5Y細胞凋亡的影響

圖2 流式細胞術(shù)Annexin V-FITC 雙染色法檢測細胞凋亡Fig.2 Cell apoptosis detected by flow cytometry with Annexin V-FITC double staining

細胞經(jīng)Annexin V-FITC和PI雙染，從對照組細胞流式散點圖(圖2)左下象限可見，早期有極少熒光信號，說明正常生長的細胞幾乎無凋亡現(xiàn)象。而谷氨酸作用于SH-SY5Y細胞24、48和72 h后的模型組凋亡細胞比例逐漸增高，并于72 h達到最高，早期和晚期細胞凋亡率之和為49.3%。人參皂苷Rb1保護組作用于谷氨酸誘導的SH-SY5Y細胞24、48和72 h 后，可見凋亡細胞比例先上升達到最大，48 h時細胞早期和晚期凋亡率之和為42.5%，逐漸下降并于72 h達到36.8%，上述結(jié)果表明, 人參皂苷Rb1對谷氨酸誘導的SH-SY5Y細胞損傷活性有一定的保護作用。

3.3 細胞代謝組學的核磁圖譜指認

圖3 對照組、模型組、人參皂苷Rb1保護組的SH-SY5Y細胞1H NMR指紋圖譜: A、B、C分別為δ 0.7～2.5 ppm、 δ 2.6～4.6 ppm和δ 5.7～9.0 ppm的1H NMR譜圖，a、b、c分別代表對照組、模型組和人參皂苷Rb1保護組Fig.3 1H NMR fingerprint spectra (A: δ 0.7～2.5 ppm, B: δ 2.6～4.6 ppm, C: δ 5.7～9.0 ppm) of SH-SY5Y cell from control group (a) , model group (b) and ginsenoside Rb1 treatment group (c)

應用優(yōu)化的實驗條件獲取細胞代謝組學的核磁數(shù)據(jù)，通過分析化學位移、峰型及耦合常數(shù)等核磁數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻[13～22]對化合物的結(jié)構(gòu)進行了指認。圖3為典型的對照組、人參皂苷Rb1保護組和模型組的1H NMR指紋譜，鑒定出包括氨基酸、有機酸、脂類等29種化合物。直觀分析發(fā)現(xiàn)，細胞經(jīng)谷氨酸處理前后，化學成分差異較大。

3.4 谷氨酸損傷SH-SY5Y細胞的代謝組學分析

為闡明SH-SY5Y細胞經(jīng)谷氨酸處理前后的化學差異，對經(jīng)MestRoNova處理后數(shù)據(jù)進一步采用多元統(tǒng)計分析方法進行分析。主成分分析(PCA)是目前最常用的無監(jiān)督分析方法之一，通過降低維度的思想把相關(guān)性的指標轉(zhuǎn)化為幾個具有更高聚合度的主成分指標，可以最大限度地體現(xiàn)數(shù)據(jù)特征[23]。圖4A為SH-SY5Y細胞經(jīng)谷氨酸處理前后的PCA得分散點圖(PC1: 0.65; PC2: 0.22)，空白對照組和模型組組間分離明顯，這可能是由于谷氨酸損傷的細胞代謝發(fā)生異常所致，由此推斷模型組細胞發(fā)生了顯著變化。有監(jiān)督的PLS-DA 排列實驗(Permutation test)通常用于判別建立模型的有效性和模型的穩(wěn)定性，即原始模型的預測能力大于任何一次隨機排列y變量的預測能力，該分析結(jié)果(圖4B)顯示模型有效穩(wěn)定，預測性能高。OPLS-DA方法去除與樣品的分類不相關(guān)的干擾因素，即進一步消除非谷氨酸作用的影響，使組間分離最大化，并尋找差異性代謝物。OPLS-DA(圖4C)顯示谷氨酸造模有效。由表1可知，對照組和模型組差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)合載荷圖(圖4D)和VIP分析，結(jié)果見表1。

圖4 對照組(■ )和模型組(●)細胞基于1H NMR的細胞代謝組學下的PCA得分圖(A)、PLS-DA圖(B)、OPLS-DA得分圖(C)和OPLS-DA載荷圖(D)Fig.4 Principal component analysis (PCA) scores plot (A), partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) plot (B), orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) score plot (C) and loading plot (D) based on1H NMR-metabolomics of cell from control group (■) and model group (●)

對正常對照組和模型組進行建模比對，將VIP>1及t檢驗(p<0.05)的24種差異代謝物帶入MetaboAnlyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca/)在線分析平臺，選擇Homo sapiens (human)路徑庫作為代謝通路數(shù)據(jù)庫，Hypergeometric Test作為通路富集分析，Relative-betweeness centrality分析通路拓撲結(jié)構(gòu)，篩選出代謝通路影響值大于0.10的代謝通路。如圖5所示，確定24種差異代謝物(見表1)分別分布于代謝通路中，表明谷氨酸可能對以上通路造成代謝紊亂，使造模細胞在整體狀態(tài)上失調(diào)。其中，有6種代謝物在模型組中表現(xiàn)為上調(diào)，18種代謝物在模型組中為下調(diào)。

3.5 人參皂苷Rb1對谷氨酸損傷SH-SY5Y細胞保護的代謝組學分析

以相同的方法處理對照組、模型組和人參皂苷Rb1保護組的細胞代謝組學數(shù)據(jù)矩陣，由PC1(0.55)和PC2(0.20)為坐標軸構(gòu)建的PCA得分散點圖(圖6A)可見，3組樣本能夠明顯分開，人參皂苷Rb1保護組的代謝輪廓離開模型組，并有向?qū)φ战M靠近的趨勢，表明人參皂苷Rb1對模型細胞具有一定的保護作用。PLS-DA模型驗證顯示，模型有效可靠(圖6B)。由3組OPLS-DA得分圖(圖6C，R2=0.22，Q2=0.45)可見，對照組、模型組和人參皂苷Rb1保護組具有明顯差異。采用有監(jiān)督的OPLS-DA獲取3組間的潛在差異生物標記物，對載荷圖(圖6D)和VIP值進行分析。

表1 對照組與模型組差異代謝物鑒定與代謝通路分析

Table 1 Identified biomarkers and pathway of control group compared with the control group

化學位移δ (ppm)代謝物MetabolitesVIP變化趨勢Trend相關(guān)通路Ralated pathway3.39Scyllo-inositol7.04↑**—1.23β-Hydroxybutyrate2.61↑**Butanoate metabolism1.19Ethanol2.19↑**Glycolysis or Gluconeogenesis1.35Threonine2.14↓**Glycine, serine and threonine metabolism0.91Pantothenic acid2.11↓**Pantothenate and CoA biosynthesis0.95Leucine1.99↓**Valine, leucine and isoleucine degradation/Valine, leucine and isoleucine biosynthesis3.67Glycerinum1.95↑**—0.87Lipid1.77↓**—0.99Isoleucine1.66↓*Valine, leucine and isoleucine biosynthesis3.71Glycine1.50↑*Glycine, serine and threonine metabolism/Primary bile acid biosynthesis1.71Arginine1.46↓**Arginine and proline metabolism1.91Acetic acid1.43↓**Pyruvate metabolism/Sulfur metabolism3.03Creatine1.43↓**Arginine and proline metabolism/Glycine, serine and threonine metabolism3.87Inosine1.36↓*Purine metabolism1.47Alanine1.31↓**Alanine, aspartate and Glutamate metabolism/Taurine and hypotaurine metabolism2.03Proline1.27↓**Arginine and proline metabolism2.11Glutamic acid1.24↑*Alanine, aspartate and Glutamate metabolism/D-Glutamine and D-Glutamate metabolism4.15Uridine1.14↓*Pyrimidine metabolism3.19Choline1.12↓**Glycerophospholipid metabolism1.03Valine1.04↓*Valine, leucine and isoleucine biosynthesis3.23Histidine1.04↓**Histidine metabolism3.07Lysine1.04↓*Lysine degradation/Lysine biosynthesis/Aminoacyl-tRNA biosynthesis8.47Formic acid1.01↓**Glyoxylate and dicarboxylate metabolism/Methane metabolism1.27Acetoacetate1.01↓**Synthesis and degradation of ketone bodies/Butanoate metabolism/Propanoate metabolisma“↑”“↓”分別代表模型組與正常對照組相比的變化趨勢,**p< 0.01模型組與正常對照組相比,*p<0.05模型組與正常對照組相比。a“↑” and “↓” represent the compound as up and down regulated in the model group compared with the control roup. **p< 0.01, *p<0.05, model group compared with control group

圖5 對照組和模型組細胞代謝物組學圖

酮體的合成和降解(a)，精氨酸和脯氨酸代謝(b)，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(c)，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(d)，泛酸和輔酶A生物合成(e)，賴氨酸降解(f)，甲烷代謝(g)，二羧酸代謝(h)，組氨酸代謝(i)，氨酰tRNA生物合成(j)，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝(k)

Fig.5 Metabolome view of control group and model group

Synthesis and degradation of ketone bodies (a), arginine and proline metabolism (b), glycine, serine and threonine metabolism (c), alanine, aspartic acid and glutamate metabolism (d) , pantothenic acid and coenzyme A biosynthesis (e), lysine degradation (f), methane metabolism (g), dicarboxylic acid metabolism (h), histidine metabolism (i), aminoacyl tRNA biosynthesis (j),D-glutamine andD-glutamate metabolism (k)

圖6 人參皂苷Rb1保護組(■)、對照組(◆)和模型組(●)細胞基于1H NMR的細胞代謝組學下的PCA得分圖(A)、PLS-DA圖(B)、OPLS-DA得分圖(C)和OPLS-DA載荷圖(D)Fig.6 PCA scores plot (A), PLS-DA plot (B), OPLS-DA score plot (C) and loading plot (D) based on1H NMR-metabolomics of cell from ginsenoside Rb1 treatment group, control group and model group

為探索以上獲得的代謝差異物涉及的代謝通路，采用MetaboAnalyst 3.0中的Pathway Analysis數(shù)據(jù)庫進行分析。將多元統(tǒng)計分析所得的VIP>1及單因素方差分析(p<0.05)的7種代謝差異物(表2)導入數(shù)據(jù)庫，篩選出與差異代謝物密切相關(guān)的代謝通路(圖7)。代謝通路影響值大于0.10的靶標代謝路徑中，代謝通路圓點越大表示對代謝組學的重要性越大，其中影響最大的為?；撬岷蛠喤；撬岽x(圖7a)。代謝通徑顏色越深，表示代謝通路分析的富集性越大，其中最強的也是?；撬岷蛠喤；撬岽x(圖7a)。谷氨酸誘導的細胞損傷給藥保護后代謝物的變化主要涉及牛磺酸和亞?；撬岽x(圖7a)，精氨酸和脯氨酸代謝(圖7b)，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(圖7c)，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝(圖7d)，丙酮酸代謝(圖7e)等代謝通路。以上這些通路分別與能量代謝及氨基酸代謝緊密相關(guān)，表明人參皂苷Rb1主要通過對以上5種通路對模型細胞代謝產(chǎn)生影響，使模型細胞在整體代謝狀態(tài)上回調(diào)，此結(jié)論與谷氨酸誘導的PC12細胞所影響的代謝通路大多相同[12]。與模型組相比，?；撬帷⒁宜帷⒕彼?、肌酸、脯氨酸和丙氨酸6種代謝差異物在人參皂苷Rb1保護組中表現(xiàn)為上調(diào)，谷氨酸在人參皂苷Rb1保護組中表現(xiàn)為下調(diào)。

表2 模型組與人參皂苷Rb1保護組差異代謝物鑒定與代謝通路分析

Table 2 Identified biomarkers and pathway of ginsenoside Rb1 group compared with the control group and the model group

化學位移Chemical shift(ppm)VIP value代謝物Metabolites變化趨勢Trenda相關(guān)通路 Ralated pathway2.111.97Glutamic acid↓*Alanine, aspartate and Glutamate metabolism/D-Glutamine and D-Glutamate metabolism3.271.76Taurine↑*Taurine and hypotaurine metabolism/Primary bile acid biosynthesis1.911.26Acetic acid↑*Pyruvate metabolism/Sulfur metabolism1.711.21Arginine↑*Arginine and proline metabolism/Aminoacyl-tRNA biosynthesis3.031.18Creatine↑*Arginine and proline metabolism/Glycine, serine and threonine metabolism1.471.1Alanine↑**Alanine, aspartate and Glutamate metabolism/Taurine and hypotaurine metabolism2.031.04Proline↑*Arginine and proline metabolism/Aminoacyl-tRNA biosynthesisa“↑”“↓”分別代表人參皂苷Rb1給藥保護組與模型組與對照組相比的變化趨勢,**p<0.01模型組與對照組相比,*p<0.05模型組與對照組相比。a “↑” and “↓” represent the compound as up and down regulated in ginsenoside Rb1 treatment group compared with model group. **p<0.01,*p<0.05, model group compared with control group.

圖7 人參皂苷Rb1給藥保護組、模型組、正常對照組差異性代謝物通路得分圖牛磺酸和亞?；撬岽x(a)，精氨酸和脯氨酸代謝(b)，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(c)，D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代謝(d)，丙酮酸代謝(e)Fig.7 Metabolome view of ginsenoside Rb1 group, control group and model groupTaurine and hypotaurine metabolism(a); Arginine and proline metabolism(b); Alanine, aspartate and Glutamate metabolism(c); D-glutamine and D-glutamate metabolism(d); Pyruvate metabolism(e)

?；撬嵩跈C體中有抗氧化和清除自由基的能力，與?；撬岷蛠喤；撬岽x密切相關(guān)，對抗老年癡呆患者神經(jīng)元細胞凋亡和衰老有重要意義。研究表明，牛磺酸能夠増強大鼠的學習記憶能力，機體內(nèi)?；撬峒皝喤；撬岷扛淖兗按x異常可能會造成記憶能力下降和認知功能障礙，而且與神經(jīng)元的衰老進程密切相關(guān)。?；撬崾菂⑴c多個氨基酸代謝與能量代謝的關(guān)鍵蛋白轉(zhuǎn)化節(jié)點，由谷氨酸脫羧酶活性異常引起的?；撬岷蛠喤；撬岽x紊亂可能導致大腦性麻痹癥狀的發(fā)生。谷氨酸損傷的SH-SY5Y細胞通過給予人參皂苷Rb1保護后，發(fā)現(xiàn)?；撬岷匡@著增高，代謝恢復正常，提示人參皂苷Rb1通過調(diào)節(jié)改善?；撬岷蛠喤；撬岽x而達到緩解和治療AD的作用。

脯氨酸在機體內(nèi)要經(jīng)谷氨酸才能被代謝，可導致谷氨酸代謝紊亂, 阻止谷氨酸攝取[12]。與模型組相比，人參皂苷Rb1給藥保護組脯氨酸含量明顯升高。因此AD患者機體內(nèi)一種氨基酸的代謝紊亂可能同時干擾其它多種活性物質(zhì)的改變，導致多種氨基酸代謝的異常。

谷氨酸和天冬氨酸作為神經(jīng)系統(tǒng)中重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)中，能引起突觸后膜去極化。當與AD發(fā)病相關(guān)的神經(jīng)元細胞過度興奮時，短時間內(nèi)釋放大量谷氨酸和天冬氨酸，使得局部含量超標，產(chǎn)生較嚴重的神經(jīng)毒性，可加速神經(jīng)元細胞變性死亡。與模型組相比，人參皂苷Rb1保護組谷氨酸含量顯著下降，可見人參皂苷Rb1能通過對谷氨酸的回調(diào)從而達到治療AD的作用。

丙酮酸是代謝過程中重要的中間產(chǎn)物，丙酮酸累積可以加速機體應激反應，進而導致能量代謝異常，是加速腦體功能下降。與模型組相比，人參皂苷Rb1保護組的乙酸含量顯著上升，表示丙酮酸累積減少可使丙酮酸代謝正常進行，人參皂苷Rb1給藥后能抑制腦體功能下降幅度, 對AD起到治療作用。

甘氨酸是神經(jīng)系統(tǒng)的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，與AD患者體內(nèi)蘇氨酸利用降低及絲氨酸的利用升高密切相關(guān)。細胞可以從甘氨酸合成絲氨酸，并且絲氨酸在細胞膜及神經(jīng)鞘的合成中都發(fā)揮著作用。研究結(jié)果表明，細胞損傷后絲氨酸含量的降低可以抑制活性氧(ROS)和炎癥因子的生成，與模型組相比, 人參皂苷Rb1給藥保護組甘氨酸含量明顯上升，其代謝異常可能在AD發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。

泛酸和輔酶A生物合成、硫代謝、谷胱甘肽代謝、初級膽汁酸生物合成等為生物體內(nèi)最常見且必不可少的代謝方式，在AD的形成和治療中參與機體內(nèi)多種活性物質(zhì)的合成與代謝，在機體的學習記憶、神經(jīng)傳導和受體功能等方面發(fā)揮著重要作用。

4 結(jié) 論

人參皂苷Rb1通過減少谷氨酸誘導的SH-SY5Y細胞凋亡發(fā)揮對神經(jīng)細胞氧化損傷的保護作用。本研究基于1H NMR細胞代謝組學技術(shù)，發(fā)現(xiàn)谷氨酸主要通過影響氨基酸代謝對SH-SY5Y細胞產(chǎn)生氧化損傷作用，而人參皂苷Rb1通過上調(diào)谷氨酸損傷模型中的?；撬?、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸和蘇氨酸等15種代謝差異物，下調(diào)谷氨酸、β-羥基丁酸和鯊肌醇使SH-SY5Y細胞代謝整體回調(diào)，說明人參皂苷Rb1主要通過影響多種能量及氨基酸代謝，在細胞整體水平上對氧化損傷神經(jīng)細胞產(chǎn)生保護作用。