林百豐 蘇欣 張學(xué)志

結(jié)核病是長期危害人類健康的慢性傳染病，是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。據(jù)2017年WHO報告估算全球共有1040萬例結(jié)核病新發(fā)患者，平均發(fā)病率為140/10萬，而我國肺結(jié)核發(fā)病患者例數(shù)居世界第3位，僅次于印度和印度尼西亞[1]。在2016年全球登記的540萬例新發(fā)和復(fù)發(fā)的肺結(jié)核患者中有57%有細(xì)菌學(xué)證據(jù)，其余患者是根據(jù)胸部影像檢查和患者的癥狀等被確診為肺結(jié)核。目前，我國的肺結(jié)核診斷多以胸部X線攝影為主，具有病原學(xué)依據(jù)的肺結(jié)核僅為31%，這與我國仍然使用傳統(tǒng)的方法診斷傳染性肺結(jié)核有關(guān)。由于傳統(tǒng)的痰涂片顯微鏡檢查法敏感度低；痰培養(yǎng)檢查法雖敏感度高，但耗時較長。原有的結(jié)核病診斷方法已不能滿足早診斷早治療的需求，所以我國的科研工作者利用分子生物學(xué)和基因組學(xué)檢測快的優(yōu)點，研制出很多新型的結(jié)核病核酸診斷技術(shù)和方法。本研究使用的交叉引物擴(kuò)增技術(shù)(crossing priming amplification，CPA)就是其中之一。筆者將CPA與傳統(tǒng)痰涂片顯微鏡檢查法和痰培養(yǎng)法進(jìn)行效能分析，評價CPA在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價值。

對象和方法

一、研究對象

采集2017年5月至2018年3月五常市結(jié)核病防治所門診初診疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本，按照《WS 288—2008肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行診斷[2]，最終納入267例肺結(jié)核患者，64例非結(jié)核性肺疾病患者，男200例，女131例。

二、 試劑和方法

1. 方法：由門診醫(yī)生指導(dǎo)患者留取3份合格的痰標(biāo)本(即時痰、夜間痰和晨起痰)，每份痰標(biāo)本約3～5 ml，分別進(jìn)行痰涂片、痰培養(yǎng)和CPA檢測。痰涂片檢查嚴(yán)格按照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》[3]的要求進(jìn)行，痰培養(yǎng)檢查按照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[4]的標(biāo)準(zhǔn)化操作執(zhí)行。

痰涂片檢查：采用萋-尼抗酸染色法。使用一端有磨砂面的無劃痕的新玻片，經(jīng)95%乙醇脫脂，干燥、清潔后用2B鉛筆在磨砂面上注明實驗序號及標(biāo)本序號；在生物安全柜中，小心打開承載痰標(biāo)本的容器，防止產(chǎn)生氣溶膠或使標(biāo)本外溢, 仔細(xì)觀察標(biāo)本，使用折斷的竹簽毛茬端，挑取痰標(biāo)本中干酪樣、膿樣或可疑部分約0.05 ml，于玻片正面涂抹成10 mm×20 mm的卵圓形痰膜。痰膜朝上靜置在生物安全柜中自然干燥后進(jìn)行染色鏡檢。

痰培養(yǎng)檢查：采用固體培養(yǎng)法。在生物安全柜內(nèi)將約2 ml痰標(biāo)本置于相應(yīng)的前處理管中；使用吸管將與痰標(biāo)本等體積4% NaOH加入前處理管中；旋緊處理管螺旋蓋，將處理管在渦旋振蕩器上渦旋振蕩30 s左右,將前處理管置于生物安全柜試管架內(nèi)，室溫靜置15 min,以無菌吸管吸取前處理后的痰標(biāo)本，均勻接種至酸性羅氏培養(yǎng)基斜面上，每支培養(yǎng)基接種約0.1～0.15 ml，旋上培養(yǎng)管螺旋蓋，不要太緊；將培養(yǎng)基放置在斜面放置架上，保持培養(yǎng)基斜面水平向上；置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，(36±1) ℃孵育；24 h后，擰緊培養(yǎng)管螺旋蓋，直立放置，繼續(xù)孵育。接種后第3天和第7天觀察培養(yǎng)情況，此后每周觀察1次，直至第8周末。

CPA 檢測：痰液中加入2～3倍體積的4%NaOH溶液，消化處理15 min，取消化好的溶液1 ml，置于1.5 ml離心管中，離心半徑為8.8 cm,13 000 r/min離心5 min，離心沉淀用無菌生理鹽水洗滌(重復(fù)2次)；洗滌后的沉淀中加入40 μl DNA提取液，經(jīng)95～100 ℃裂解10 min后，離心半徑為8.8 cm,13 000 r/min離心5 min。離心后的上清液作為CPA恒溫擴(kuò)增的DNA模板。每支玻璃化試劑反應(yīng)管中加入15 μl緩沖液，然后加入20 μl石蠟油(防止污染)，靜置2～3 min，待充分溶解后；分別給每個反應(yīng)管中加入4 μl DNA樣本，4 μl標(biāo)準(zhǔn)陰性對照和4 μl標(biāo)準(zhǔn)陽性對照，置于(63±2) ℃ 恒溫金屬浴60 min。待反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)管依照說明書進(jìn)行操作，15 min后讀取結(jié)果并記錄試驗結(jié)果[5]。結(jié)果判讀：先觀察檢測線(T線)，如果T線出現(xiàn)紅色，則判定為陽性，即當(dāng)前樣本中有結(jié)核分枝桿菌核酸檢出；如果T線沒有出現(xiàn)紅色，而質(zhì)控線(C線)出現(xiàn)紅色，則判定為陰性，即當(dāng)前樣本中沒有結(jié)核分枝桿菌核酸檢出；如果T線和C線都沒有出現(xiàn)紅色，說明檢測失敗。

2．試劑：痰涂片染色劑和痰培養(yǎng)的酸性羅氏培養(yǎng)基均購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；培養(yǎng)使用的4% NaOH為本實驗室配置；結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(恒溫擴(kuò)增-試紙條法)及干式恒溫金屬浴為杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

三、質(zhì)量控制

痰涂片顯微鏡檢查和痰培養(yǎng)檢查：為了保證試驗的質(zhì)量，應(yīng)嚴(yán)格按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[6]質(zhì)量保證的要求執(zhí)行。每批培養(yǎng)基都用H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株做質(zhì)量控制。CPA的質(zhì)量控制嚴(yán)格按照《結(jié)核病實驗室質(zhì)量保證手冊》[7]的要求執(zhí)行。

四、 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用“率(%)”表示，采用配對卡方檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。計算CPA的檢測效能指標(biāo)：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%[8]。

結(jié) 果

331例患者中痰涂片檢測陽性66例，陰性265例；痰培養(yǎng)陽性136例，陰性195例；CPA檢測陽性137例，陰性194例。以痰培養(yǎng)檢查結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，CPA檢測的敏感度和特異度分別為98.94%(186/188)、92.31%(132/143)。以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，痰涂片檢查的敏感度和特異度分別為23.97%(64/267)、96.88%(62/64)；痰培養(yǎng)檢查敏感度和特異度分別為 48.69%(130/267)、90.63%(58/64)；CPA檢查的敏感度和特異度分別為 51.31%(137/267)、96.88%(62/64)，見表1。 分別對痰涂片與痰培養(yǎng)、痰涂片與CPA的敏感度進(jìn)行了統(tǒng)計學(xué)分析，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=62.23，P<0.01；χ2=69.05，P<0.01)，痰培養(yǎng)與CPA的敏感度進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.50，P=0.219)；分別對痰涂片與痰培養(yǎng)、痰涂片與CPA檢測、痰培養(yǎng)與CPA檢測的特異度進(jìn)行了比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.50，P=0.219；χ2=0.50，P=1.000；χ2=1.50，P=0.219)。

討 論

早期診斷和治療對結(jié)核病的預(yù)防控制至關(guān)重要，我國現(xiàn)有的基層結(jié)核病實驗室診斷結(jié)核病主要以傳統(tǒng)痰涂片檢查和痰培養(yǎng)檢查為主。常規(guī)痰涂片檢查方法簡單、快速、特異度高、成本低廉，但敏感度低，每毫升標(biāo)本中含量5000～10 000條菌以上才能檢出。痰培養(yǎng)檢查法是目前結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，敏感度高但耗費(fèi)的時間較長，每周都需要觀察培養(yǎng)結(jié)果，至少3～4周才能獲得結(jié)果，操作需要嚴(yán)格控制標(biāo)本前處理時間，對實驗室人員的操作水平要求較高，培養(yǎng)出陽性菌株后需要進(jìn)一步的菌種鑒定，才可確診是否為結(jié)核分枝桿菌。

與目前廣泛使用的熒光PCR技術(shù)相比較，CPA技術(shù)反應(yīng)速度快，反應(yīng)時間約1 h，使試劑盒可用于檢驗檢疫、突發(fā)性傳染病的檢測與監(jiān)控現(xiàn)場檢測或醫(yī)院的床邊診斷，檢測成本低：目前熒光光定量PCR儀價格昂貴，無法在很多中小醫(yī)院普及。CPA技術(shù)只需要離心機(jī)和一臺簡單的恒溫裝置，如普通的水浴鍋、金屬浴，即可進(jìn)行擴(kuò)增。操作簡單，對操作人員的技能要求不高，絕大多數(shù)人通過簡單培訓(xùn)或自學(xué)都可掌握，為核酸檢測試劑的廣泛應(yīng)用創(chuàng)造了條件。

表1 以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)比較3種檢測方法對結(jié)核病的檢測效能

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%，特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%,陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%,陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

本研究中CPA檢測以痰培養(yǎng)檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，其敏感度和特異度分別為98.94%和92.31%。國內(nèi)有報道可疑肺結(jié)核患者應(yīng)用CPA檢測敏感度為85.71%，特異度為98.92%[5,9]。以培養(yǎng)法為參照CPA檢測結(jié)核分枝桿菌的敏感度分別為89.7%、89.8%、83.72%，特異度分別為92.9%、87.4%、98.98%[10-12]。從以上的敏感度和特異度的比較可以看出本研究以痰培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，CPA的敏感度均高于其他方法，而特異度基本與其他研究保持一致的水平。由于本次采集的是X線胸片異常患者的標(biāo)本進(jìn)行的研究，從而使檢測的敏感度有了很大的提高。如果在擴(kuò)大標(biāo)本量，CPA檢測的敏感度和特異度可能還會有所提高，檢測的結(jié)果會更加的準(zhǔn)確。

以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，痰涂片、痰培養(yǎng)和CPA檢測的敏感度分別為23.97%、48.69%和51.31%，可以看出CPA檢測的敏感度較高，對于痰涂片檢測陰性，而痰培養(yǎng)正在等待時，在短時間內(nèi)確定排菌患者有非常大的意義，但其不能確定死菌與活菌；痰涂片、痰培養(yǎng)和CPA檢測的特異度分別為96.88%、90.63%和96.88%，CPA檢測的特異度與痰涂片檢測的特異度相同，但略高于痰培養(yǎng)的特異度，而且CPA檢測縮短了時間，從收集標(biāo)本到檢測出結(jié)果約需2 h，更符合我國結(jié)核病早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的需求。

綜上所述，CPA檢測對實驗室的生物安全和實驗室人員的技術(shù)水平要求不高，大大縮短了檢測時間，并且CPA的敏感度和特異度比較高，因此，很適合在縣(區(qū))級結(jié)核病實驗室中推廣和應(yīng)用。