丁 皓 吳小東 李長(zhǎng)于

(1 浙江省環(huán)境保護(hù)科學(xué)設(shè)計(jì)研究院， 杭州 310007；2 浙江方圓檢測(cè)集團(tuán)股份有限公司，杭州 310018)

前言

1996年，歐洲委員會(huì)給出了內(nèi)分泌干擾物的第一個(gè)定義：“改變生物體或其后代或(亞)人群內(nèi)分泌系統(tǒng)功能的外源物質(zhì)或混合物”。許多以不同化學(xué)結(jié)構(gòu)為特征的天然和合成(或半合成)試劑具有破壞調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和發(fā)育的正常內(nèi)分泌過程的潛力[1]。美國(guó)環(huán)保局1998年公布了67類危及人體和其他生物體的內(nèi)分泌干擾物名單，這些化合物存在約86 000種商用化學(xué)品中，人群接觸幾率極大，此類物質(zhì)在環(huán)境中存在時(shí)間長(zhǎng)，并且只要極少量便會(huì)起到擾亂生物體內(nèi)分泌的作用，造成免疫缺陷、異常生長(zhǎng)發(fā)育、甚至長(zhǎng)達(dá)多代的危害等各類疾病。目前，與廢棄物污染相關(guān)的內(nèi)分泌干擾物主要有鄰苯二甲酸酯類[2-6]、己二酸酯類[7-10]、鹵代聯(lián)苯[11-13]和烷基酚類[14-17]等。

對(duì)內(nèi)分泌干擾物進(jìn)行及時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)，能有效預(yù)防環(huán)境中的內(nèi)分泌干擾物造成的危害，是對(duì)內(nèi)分泌干擾物進(jìn)行預(yù)防和治理的關(guān)鍵步驟。目前較為常用的快速處理環(huán)境樣品的萃取技術(shù)有：索氏提取、固相萃取、固相微萃取、超聲波萃取、微波萃取、加速溶劑萃取和超臨界流體萃取等。主要用到的檢測(cè)方法為氣相色譜法(GC)[18]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[9,19]、高效液相色譜法(HPLC)[20-21]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)[22]。

就目前而言，國(guó)內(nèi)的檢測(cè)方法主要針對(duì)食品以及日用品等方面，并未充分重視對(duì)排放到環(huán)境中干擾物的檢測(cè)，而且相比較于食品及日用品中內(nèi)分泌干擾物較為單一的特點(diǎn)，排放到環(huán)境中的內(nèi)分泌干擾物質(zhì)種類多樣，濃度低且來源廣，只針對(duì)某一種內(nèi)分泌干擾物的分析手段，在日趨復(fù)雜的環(huán)境檢測(cè)任務(wù)中無法起到很好作用。在已報(bào)道針對(duì)水體和土壤的檢測(cè)方法中，多集中于單獨(dú)檢測(cè)一類內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，工作重復(fù)量大，耗時(shí)長(zhǎng)且成本較高，應(yīng)用于實(shí)際工作可行性不高，且內(nèi)分泌干擾物在環(huán)境中的濃度較低即可導(dǎo)致危害的特點(diǎn)，相對(duì)應(yīng)的分析手段通常需要較低的檢出限。因此，開發(fā)出能對(duì)多類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物同時(shí)進(jìn)行高效分析的檢測(cè)方案，能有效避免上述缺陷，有利于對(duì)檢測(cè)的規(guī)?；ぷ鳌?/p>

綜上所述，若能開發(fā)合適的前處理技術(shù)，配合高效檢測(cè)手段，開發(fā)對(duì)多種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)將極大有助于檢測(cè)效率的提高，使之適合于環(huán)境相關(guān)的監(jiān)測(cè)工作。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及材料

實(shí)驗(yàn)過程中所用到的儀器如表1所示，試劑及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)見表2。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器

表2 實(shí)驗(yàn)試劑及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

1.2 樣品制備與前處理

將土壤樣品放于常壓下干燥，過0.25 mm孔徑篩去除石塊、植物根莖和其它較大顆粒，經(jīng)粉碎機(jī)研磨，過0.12 mm孔徑篩，保存于干燥器中待測(cè)。

稱取制備好的土壤樣品1.0 g于玻璃比色管中，加入0.01 mL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(濃度為10 mg/L)和10 mL丙酮(50%)+正己烷(50%)混合溶劑(分兩次加入)，每次超聲提取20 min，經(jīng)離心后，合并提取液，用氮吹儀在40 ℃下吹至近干，準(zhǔn)確加入1.0 mL正己烷定容，渦漩，作為待凈化液。選用硅膠固相萃取柱(事先用10 mL正己烷活化)進(jìn)行凈化，將凈化液過柱，待自然流干后，用10 mL洗脫液[二氯甲烷(90%)+丙酮(10%)]進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，用氮吹儀在40 ℃下吹至近干，加入1.0 mL正己烷定容，渦漩，過0.22 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

1.3 儀器工作條件

1.3.1色譜條件

色譜柱：HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)毛細(xì)管色譜柱；載氣：氦氣，純度≥99.999%；進(jìn)樣口溫度280 ℃；柱溫條件：60 ℃保持1 min，以10 ℃/min的速率升溫至220 ℃，保持1 min，以5 ℃/min的速率升溫至280 ℃，保持8 min；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣方式為不分流；進(jìn)樣體積1 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件

電離方式為EI；離子源溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；測(cè)定模式為全掃描(Fullscan)和選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)，質(zhì)量掃描范圍10～550 amu。

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)分泌干擾物的色譜分離

根據(jù)查閱的文獻(xiàn)資料，鄰苯二甲酸酯類、己二酸酯類、烷基酚類和多氯聯(lián)苯類內(nèi)分泌干擾物均可在非極性毛細(xì)管色譜柱得到較好分離。由于本實(shí)驗(yàn)涉及檢測(cè)組份數(shù)目較多，且種類不同，為了保證一次能夠分離多種物質(zhì)，需要對(duì)儀器的條件參數(shù)進(jìn)行調(diào)整。

實(shí)驗(yàn)中將配制的41種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合溶液，通過GC/MS全掃描和選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)獲得41種目標(biāo)化合物的總離子流色譜圖(圖1)及對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖，然后選擇豐度高、干擾低的特征離子作為SIM(選擇離子監(jiān)測(cè))定量離子，同時(shí)選擇豐度較高、干擾較低的2～3種特征離子作為定性離子，通過對(duì)定性離子豐度比例的分析實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)化合物的定性，按此方法35 min內(nèi)可完成41種目標(biāo)化合物的分析測(cè)定。

由圖1可以看出，在此操作條件下，待測(cè)的41種物質(zhì)能較好地分離，其分離效果較好，能夠在不同保留時(shí)間下出峰，故該操作條件可行。

圖1 41種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)總離子流色譜圖Figure 1 Total ion chromatogram of 41 standard substances.

2.2 提取方式的選擇

振蕩提取、索氏提取等傳統(tǒng)的提取方法處理周期長(zhǎng)、溶劑消耗量大。微波輔助提取、加速溶劑提取、超臨界流體提取等儀器和技術(shù)成本相對(duì)較高。超聲波提取法不僅能有效地將結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的有機(jī)物從固體樣品中提取出來，且具有效率高、儀器價(jià)格便宜、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。綜合考慮，本研究選擇超聲波提取法提取土壤或底泥中這四類內(nèi)分泌干擾物。

2.3 不同提取溶劑提取率的比較

取3份相同土壤樣品1.0 g(精確至0.000 1 g)，加入10 mg/L的40種內(nèi)分泌干擾物標(biāo)準(zhǔn)中間溶液0.1 mL，分別加入二氯甲烷、正己烷、丙酮(50%)+正己烷(50%)混合溶劑10 mL對(duì)土壤樣品進(jìn)行超聲提取30 min，然后經(jīng)離心，過濾膜上機(jī)測(cè)試。結(jié)果表明：二氯甲烷、丙酮(50%)+正己烷(50%)混合溶劑提取效果較好；正己烷提取效率除氯代聯(lián)苯較好外，鄰苯二甲酸酯、烷基酚和己二酸酯提取效率較差，回收率基本都在50%以下。研究發(fā)現(xiàn)，使用添加了丙酮的正已烷-丙酮(1∶1，V/V)混合溶劑體系對(duì)目標(biāo)化合物提取效率較高，為測(cè)定土壤中內(nèi)分泌干擾物的最佳提取溶劑。

2.4 超聲提取時(shí)間的選擇

圖2 不同提取時(shí)間下內(nèi)分泌干擾物峰面積-1Figure 2 Peak area of endocrine disruptor under different extraction times-1.

以丙酮(50%)+正己烷(50%)混合溶劑為提取溶劑時(shí)，考察5、10、20、30 min 4種不同的超聲時(shí)間下樣品提取率，確定最優(yōu)提取時(shí)間(圖2—5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著超聲時(shí)間的增加，目標(biāo)化合物的提取率有所提高，在20、30 min超聲時(shí)間下提取效果較好，同時(shí)，由于30 min的超聲提取時(shí)間對(duì)目標(biāo)化合物提取效率整體上有下降趨勢(shì)，考慮目標(biāo)化合物提取率及實(shí)驗(yàn)效率等因素，最終確定超聲時(shí)間為20 min。

圖3 不同提取時(shí)間下內(nèi)分泌干擾物峰面積-2Figure 3 Peak area of endocrine disruptor under different extraction times-2.

圖4 不同提取時(shí)間下內(nèi)分泌干擾物峰面積-3Figure 4 Peak area of endocrine disruptor under different extraction times-3.

圖5 不同提取時(shí)間下內(nèi)分泌干擾物峰面積-4Figure 5 Peak area of endocrine disruptor under different extraction times-4.

2.5 固相提取柱凈化效果及洗脫溶劑比較

對(duì)硅膠柱、C18柱和弗羅里硅土柱(Florisil小柱)進(jìn)行洗脫對(duì)比實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程稱取相同陰性土壤樣品1 g(精確至0.000 1 g)，并加入10 mg/L的40種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，按土壤樣品前處理步驟進(jìn)行，得到待凈化液，按照正交實(shí)驗(yàn)步驟，分別對(duì)硅膠柱、C18柱和弗羅里硅土柱三種固相萃取柱凈化效果，以及正己烷、二氯甲烷、二氯甲烷∶丙酮(9∶1，V/V)三種洗脫溶劑洗脫效果進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)分析。 結(jié)果顯示無論選用哪種提取柱時(shí)，三種洗脫溶劑的總體效果皆為二氯甲烷∶丙酮(9∶1，V/V)最佳。當(dāng)用二氯甲烷∶丙酮(9∶1，V/V)混合溶液作為洗脫溶劑，比較硅膠柱、C18柱和弗羅里硅土柱的凈化效果，其中硅膠柱的回收率較高，基質(zhì)干擾較少，凈化效果最好，因此本實(shí)驗(yàn)采用硅膠柱凈化。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

分別對(duì)40種內(nèi)分泌干擾物標(biāo)準(zhǔn)工作系列溶液(0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.0、2.0 mg/L)進(jìn)行測(cè)定，通過內(nèi)標(biāo)法，以40種內(nèi)分泌干擾物定量離子與內(nèi)標(biāo)物二(1-丁基戊烷)己二酸定量離子峰面積比y對(duì)其濃度比x進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，在0.01～2.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，所得峰面積比與濃度比的線性關(guān)系良好，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)(R2)如表3所示。稱取陰性空白樣品，加入40種內(nèi)分泌干擾物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，上機(jī)測(cè)試得出信噪比，以3倍信噪比(S/N=3)得出該方法檢出限，結(jié)果如表3所示。

表3 40種內(nèi)分泌干擾物線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)(R2)

2.7 方法加標(biāo)回收及精密度實(shí)驗(yàn)

稱取1 g(精確至0.000 1 g)空白樣品于10 mL比色管中，按低、中、高三個(gè)水平分別加入1 mg/L的40種內(nèi)分泌干擾物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.02、0.1、1.0 mL，每個(gè)水平做6個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，然后按照樣品前處理步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，經(jīng)上機(jī)得出對(duì)應(yīng)的回收率(表4)。

表4 精密度和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8 實(shí)際樣品分析

利用本實(shí)驗(yàn)建立的方法，將采集來的30份土壤樣品進(jìn)行了檢測(cè)，根據(jù)保留時(shí)間和離子比率定性，內(nèi)標(biāo)法定量，結(jié)果表明，在所選取的土樣中，鄰苯二甲酸二異丁酯(DIBP)，鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)與鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)等常見的鄰苯二甲酸酯類均有檢出(表5)。陽性樣品的色譜圖如圖6所示。

表5 樣品檢測(cè)結(jié)果

圖6 陽性樣品總離子流色譜圖Figure 6 Total ion chromatogram of positive samples.

3 結(jié)論

內(nèi)分泌干擾物的測(cè)定多集中于單獨(dú)測(cè)定一類物質(zhì)，工作重復(fù)量大，耗時(shí)長(zhǎng)且成本較高，應(yīng)用于實(shí)際工作可行性不高。

采用超聲提取方法，對(duì)土壤中的目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行提取，并通過固相萃取技術(shù)將土壤中低濃度的待測(cè)組分富集和凈化，通過考察不同預(yù)處理手段對(duì)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物回收率的影響，最終確定樣品的最佳處理?xiàng)l件為：以丙酮(50%)+正己烷(50%)混合溶劑為提取劑，硅膠固相萃取柱為富集凈化柱，二氯甲烷(90%)+丙酮(10%)混合溶劑為洗脫溶劑，建立了對(duì)土壤內(nèi)分泌干擾物多種物質(zhì)同時(shí)進(jìn)行測(cè)定的方法，該方法操作簡(jiǎn)便快捷，前處理所需設(shè)備及試劑較少，線性相關(guān)性好，準(zhǔn)確度高，檢出限低，具有較高的實(shí)用價(jià)值，可應(yīng)用于大批量的樣品檢測(cè)，提高環(huán)境監(jiān)測(cè)效率。