包雯駿，張 強(qiáng)，李樹(shù)清，林穎崢，李 健，嚴(yán)亞賢

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240；2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海200135）

近年來(lái)，規(guī)?；i場(chǎng)豬腹瀉類疫病復(fù)雜程度日益增加，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，在世界范圍內(nèi)受到越來(lái)越多關(guān)注。豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)和豬delta冠狀病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）同屬于冠狀病毒科（Coronaviridae），3種病毒均可引起以腹瀉、嘔吐，脫水、仔豬高死亡率為主要特征的高度接觸性腸道傳染病[1,2]，此3種病毒感染引起的疫病是我國(guó)從國(guó)外引進(jìn)種豬重點(diǎn)關(guān)注的腹瀉類疫病。豬捷申病毒（Porcine teschovirus，PTV）是小RNA病毒科捷申病毒屬成員，原屬腸道病毒，可引起以豬腦脊髓灰質(zhì)炎、母豬繁殖障礙、腹瀉、心包炎、心肌炎、皮膚損傷等多癥狀為特征的病毒性傳染病[3]。捷申病毒有13個(gè)血清型，而只有PTV-1引起的捷申病毒性腦脊髓炎在國(guó)際活動(dòng)物貿(mào)易中受到關(guān)注，而其他血清型引起的腹瀉等疫病常被忽略，研究證實(shí)國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)均存在廣泛的PTV感染[4,5]。

PEDV、TGEV、PDCoV和PTV同屬腸道類病毒，?；旌细腥荆?種病毒在流行病學(xué)、臨床癥狀上相似，臨床鑒別困難。建立同時(shí)鑒別診斷這4種病毒的方法對(duì)豬腹瀉性疫病病因確診、流行病學(xué)調(diào)查、入境口岸檢疫和疫病防控具有重要意義。多重?zé)晒釸T-PCR能夠在同一反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)基因，而且具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、擴(kuò)增時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)，對(duì)于混合感染疫病，特別是具有相似臨床癥狀和流行病學(xué)特征的疫病更具有重要的意義，在快速分子診斷方面擁有良好的應(yīng)用前景。本研究利用四重?zé)晒舛縍T-PCR技術(shù)建立同時(shí)檢測(cè)PEDV、TGEV、PDCoV和PTV的方法，為這4種病毒病的臨床診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供快速檢測(cè)技術(shù)。

1 材料和方法

1.1 毒株及質(zhì)粒豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬捷申病毒（PTV）、豬呼吸道冠狀病毒（Porcine respiratory coronavirus，PRCV）、豬輪狀病毒（Rotavirus，RoV）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circoviruses type 2，PCV2）、豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）和帶有PEDV N基因、TGEV S基因、PDCoV M基因和PTV 5'非編碼區(qū)基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒 pMD-PEDN、pMD-TGES、pMD-PDM和pMD-PT由本實(shí)驗(yàn)室保存；豬口蹄疫O型病毒（Foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）滅活疫苗、豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）活疫苗和豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）活疫苗購(gòu)自商業(yè)化疫苗公司，疫苗毒核酸作為陽(yáng)性檢測(cè)樣品。100份臨床健康豬糞拭子采自華東地區(qū)三家豬場(chǎng)及兩個(gè)國(guó)家進(jìn)口種豬。

1.2 主要試劑和儀器磁珠法總核酸提取試劑盒購(gòu)自Magen公司，dNTPs、RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）、Premix ExTaq（Probe qPCR）購(gòu)自寶生物（大連）有限公司。Lifetechnologies ViiA7熒光定量PCR儀和Kingfisher 磁珠核酸提取儀（ML）購(gòu)自Thermo fisher公司。

1.3 引物和探針根據(jù)GenBank中登錄的病毒基因組信息，選取PEDV N基因、TGEV S基因、PDCoV M基因和PTV相對(duì)保守的5'非編碼區(qū)基因作為靶標(biāo)基因。分別使用Clustal W程序?qū)蛐蛄羞M(jìn)行比對(duì)，選取保守區(qū)域使用Beacon Designer 8.0軟件設(shè)計(jì)和篩選四套簡(jiǎn)并引物和探針。PEDV探針5'標(biāo)記ROX熒光基團(tuán)，3'標(biāo)記BHQ2基團(tuán)；TGEV探針5'標(biāo)記CY5熒光基團(tuán)，3'標(biāo)記BHQ3基團(tuán)；PDCoV探針5'VIC標(biāo)記R，3'BHQ1標(biāo)記；PTV探針5'標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3'標(biāo)記BHQ1基團(tuán)（見(jiàn)表1）。引物和探針由上海生工生物技術(shù)公司合成，配制成工作濃度為10 μmol/L-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取pMD-PEDN、pMD-TGES、pMD-PDM和pMD-PT 4種標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒10 μL分別加入到含有90 μL TE 的1.5 mL EP管中，分別按照10倍梯度稀釋到10-10。取其中5個(gè)稀釋度作為標(biāo)準(zhǔn)模板，使用矩陣法優(yōu)化引物和探針的濃度及退火溫度，進(jìn)行熒光qRT-PCR反應(yīng)，計(jì)算循環(huán)閾值(Ct)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 特異性試驗(yàn)應(yīng)用建立起來(lái)的熒光qRT-PCR方法對(duì)PEDV、TGEV、PRCV、PTV、RoV、PCV2、PRV、CSFV、FMDV、PPV、PRRSV進(jìn)行特異性試驗(yàn)。使用總核酸提取試劑盒按其說(shuō)明提取總核酸，再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA備用。逆轉(zhuǎn)錄體系：5×AMV 緩沖液4 μL，dNTPs 2 μL，RNA酶抑制劑1 μL，反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）1 μL，RNA模板 10 μL，其余用無(wú)Nuclease-Free Water補(bǔ)足20 μL。逆轉(zhuǎn)錄程序：42℃ 30 min，95℃ 10 min。

1.6 敏感性試驗(yàn)用10倍梯度稀釋的4種標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為檢測(cè)模板，按10-1～10-10稀釋度混合模板進(jìn)行四重?zé)晒鈗RT-PCR敏感性試驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行單一熒光qRTPCR敏感性比對(duì)驗(yàn)證。

1.7 臨床樣本檢測(cè)對(duì)100份豬糞便樣品使用磁珠法抽提總核酸，再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA保存?zhèn)溆?。采用建立的四重?zé)晒鈗RT-PCR對(duì)臨床樣本同時(shí)進(jìn)行PEDV、TGEV、PDCoV和PTV檢測(cè)，并設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照，當(dāng)RT-PCR儀收集到明顯擴(kuò)增信號(hào)，出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線并且Ct≤35時(shí)判定為陽(yáng)性；熒光信號(hào)不明顯35＜Ct≤40時(shí)判定為可疑，可疑樣品需復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果仍35＜Ct≤40判為陽(yáng)性；無(wú)熒光信號(hào)判為陰性。同時(shí)使用單一熒光qRT-PCR進(jìn)行檢測(cè)。分別統(tǒng)計(jì)PEDV、TGEV、PDCoV和PTV的檢出率，比較多重?zé)晒鈗RT-PCR和單一熒光qRT-PCR的差異性。

2 結(jié)果

2.1 體系優(yōu)化 使用矩陣法調(diào)整引物濃度（0.5 μL、1 μL和1.5 μL）、探針濃度（0.3 μL、0.5 μL和0.8 μL）和退火溫度（54℃、56℃、58℃和60℃）對(duì)四重?zé)晒鈗RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。最終確定的四重?zé)晒鈗RT-PCR反應(yīng)體系（40μL）：Premix ExTaq（Probe qPCR）20 μL，4對(duì)上、下游引物各1 μL，4種探針各0.5 μL，4種標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板各1 μL，其余用ddH2O補(bǔ)足；若使用20 μL體系，各組分減半。四重?zé)晒鈗RT-PCR最佳反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 變性30 s、56℃退火 1 min，40個(gè)循環(huán)，退火階段收集熒光信號(hào)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線以10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，選取5個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度設(shè)定3個(gè)平行，通過(guò)四重?zé)晒鈗RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，得到擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。模板稀釋度在10-3～10-7內(nèi)與Ct值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 PEDV、TGEV、PDCoV和PTV多重標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of PEDV, TGEV, PDCoV and PTV

2.3 特異性試驗(yàn) 應(yīng)用建立起來(lái)的熒光qRT-PCR方法對(duì)PEDV、TGEV、PDCoV、PTV、PRCV、PCV-2、PRV、CSFV、FMDV、PPV、PRRSV基因組進(jìn)行特異性檢測(cè)。使用磁珠法提取總核酸，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光qRT-PCR檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖2。四重?zé)晒鈗RT-PCR方法僅對(duì)PEDV、TGEV、PDCoV和PTV 4種病毒出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，而陰性對(duì)照和其他病毒核酸均無(wú)Ct值，無(wú)特異性擴(kuò)增曲線，表明本方法具有良好的特異性。

2.4 敏感性試驗(yàn)將10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒通過(guò)本研究建立的四重?zé)晒鈗RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。PEDV最低檢出濃度為141拷貝／μL，TGEV為68拷貝／μL，PDCoV為8拷貝／μL，PTV為11拷貝／μL。單一熒光qRT-PCR時(shí)PEDV最低檢出濃度為14.1拷貝／μL，TGEV為68拷貝／μL，PDCoV為8拷貝／μL，PTV為11拷貝／μL。

圖2 PEDV、TGEV、PDCoV和PTV四重?zé)晒鈗RT-PCR特異性結(jié)果Fig.2 Speci ficity vesults of qRT-PCR for PEDV, TGEV, PDCoV and PTV

圖3 PEDV、TGEV、PDCoV和PTV四重?zé)晒鈗RT-PCR敏感性結(jié)果Fig.3 Sensitivity results of qRT-PCR for PEDV, TGEV, PDCoV and PTV

2.5 臨床樣品檢測(cè)分別使用建立起來(lái)的四重?zé)晒鈗RT-PCR方法和單一熒光RT-PCR方法同時(shí)對(duì)100份糞拭子進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性樣品通過(guò)基因測(cè)序確認(rèn)。四重?zé)晒鈗RT-PCR方法PEDV、PTV、TGEV、PDCoV檢出率分別為10%、6%、2%和55%；單一熒光RTPCR方法PEDV、PTV、TGEV、PDCoV檢出率分別為8%、6%、2%和55%。從結(jié)果可以看出四重?zé)晒釸T-PCR方法與單一熒光RT-PCR相比，除PEDV檢出率稍低外，其他三種疫病敏感性一致。國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)和進(jìn)口種豬PTV總體檢出率很高，達(dá)55%，有的豬場(chǎng)高達(dá)85%；國(guó)外進(jìn)口種豬PEDV、TGEV和PDCoV均未檢出。

表2 臨床糞拭子熒光qRT-PCR樣本檢測(cè)結(jié)果Table 2 The testing results using real-time RT-PCR for clinical fecal samples

3 討論

近年，豬腹瀉類疫病頻繁發(fā)生，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，廣受社會(huì)關(guān)注。國(guó)內(nèi)外針對(duì)腹瀉病原檢測(cè)開(kāi)展了一系列研究，主要針對(duì)傳染性胃腸炎（TGEV）、流行性腹瀉（PEDV）、豬delta冠狀病毒（PDCoV）、輪狀病毒（RoV）、捷申病毒（PTV）、博卡病毒、星狀病毒等病原開(kāi)展PCR或多重RT-PCR研究[6-9]。本研究選擇PEDV、TGEV、PDCoV和PTV作為研究對(duì)象，考慮到重要豬腹瀉類疫病診斷的同時(shí)，還兼顧進(jìn)口種豬隔離檢疫工作的實(shí)際需要。

本研究中使用TGEV S基因作為檢測(cè)靶基因，主要是考慮TGEV與PRCV毒株的同源性很高，研究認(rèn)為PRCV是TGEV的基因缺失突變物，最主要的差別在于PRCV在S基因缺失了621～681個(gè)nt[10,11]。PRCV在國(guó)內(nèi)外的豬場(chǎng)感染很常見(jiàn)，PRCV可引起豬呼吸道亞臨床感染或輕微的呼吸道癥狀，不隨糞便排出，一般認(rèn)為PRCV單獨(dú)作為病原的意義不大。因此，不管是病原學(xué)方法還是血清學(xué)方法診斷技術(shù)，尤其在對(duì)隔離檢疫的外表健康動(dòng)物實(shí)施檢疫的過(guò)程中，區(qū)分TGEV和PRCV感染非常重要。本研究針對(duì)TGEV的引物探針是基于PRCV S基因缺失的核苷酸設(shè)計(jì)，確保檢測(cè)到的基因來(lái)自TGEV毒株，而不是其突變物PRCV。

探針熒光PCR技術(shù)跟常規(guī)PCR相比，特異性更強(qiáng)，敏感度更高，還可對(duì)樣本進(jìn)行精確定量，目前在臨床疫病診斷上已得到廣泛應(yīng)用。但受熒光PCR設(shè)備光學(xué)通道、熒光基團(tuán)可檢測(cè)波長(zhǎng)以及引物探針錯(cuò)配等因素影響，目前的技術(shù)條件下，多重?zé)晒釶CR易受干擾，尤其是四重以上的PCR方法，難以形成敏感性、特異性俱佳的技術(shù)方案。本研究是首次使用四重?zé)晒鈗RT-PCR技術(shù)建立了豬腹瀉類病原檢測(cè)方法。建立的四重?zé)晒鈗RT-PCR方法，特異性好，僅可特異性檢出PEDV、TGEV、PDCoV和PTV，不會(huì)檢出其他豬病毒性病原；最低核酸檢測(cè)線分別為141拷貝／μL、68拷貝／μL、8拷貝／μL和11拷貝／μL，靈敏性較高。使用該方法對(duì)采集的100份臨床健康豬糞拭子進(jìn)行檢測(cè)，共檢出PEDV陽(yáng)性樣品10例、TGEV陽(yáng)性6例、PDCoV陽(yáng)性2例和PTV陽(yáng)性55例，說(shuō)明本研究建立的四重?zé)晒釸T-PCR方法可用于臨床樣品的檢測(cè)診斷。而且本研究建立的四重?zé)晒鈗RT-PCR方法與單一熒光qRTPCR相比，敏感性并未大幅降低，更加快捷簡(jiǎn)便。目前我國(guó)國(guó)外進(jìn)口種豬的原農(nóng)場(chǎng)生物安全管理措施有效，PEDV、TGEV和PDCoV等常見(jiàn)腹瀉病原均未檢出；PTV血清型較多，國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)感染率也很高，進(jìn)口種豬檢出率高，而未發(fā)現(xiàn)PTV-1引起的捷申病毒性腦脊髓炎。

本研究為PEDV、TGEV、PDCoV和PTV 4種豬腹瀉類病毒的檢測(cè)診斷、流行病學(xué)調(diào)查和疫病防控提供了有效技術(shù)方法，對(duì)疫病快速診斷、防止疫情擴(kuò)散和維護(hù)國(guó)門生物安全有較大的應(yīng)用價(jià)值。