張珍珍，韋艷娜，王 佳，王海燕，熊祺琰，邵國(guó)青，馮志新

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210014）

豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae）是引起豬支原體肺炎的重要病原，給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1,2]。目前，疫苗接種是有效防控豬支原體肺炎的重要方式[3]。豬肺炎支原體入侵機(jī)體的主要場(chǎng)所是呼吸道，可引起氣管上皮損傷等一系列呼吸道病變[4]。由于豬支原體肺炎的免疫應(yīng)答主要以局部免疫為主，豬肺炎支原體活疫苗通過(guò)黏膜途徑免疫可以誘導(dǎo)有效的局部黏膜免疫應(yīng)答[5]，從而發(fā)揮比滅活疫苗更優(yōu)的免疫保護(hù)效果。目前滴鼻免疫和氣霧免疫等方式已被用于豬肺炎支原體活疫苗黏膜免疫途徑的開(kāi)發(fā)[6,7]。

豬肺炎支原體免疫原性相對(duì)較弱，開(kāi)發(fā)適合豬肺炎支原體活疫苗的佐劑，對(duì)于進(jìn)一步提高豬肺炎支原體活疫苗的免疫保護(hù)力以及新型疫苗的研制有重要意義。例如CpG佐劑可以增強(qiáng)豬肺炎支原體弱毒株鼻腔免疫效果，增強(qiáng)仔豬細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答[8]。Gel 01是白色、不透明、可流動(dòng)的凝膠，主要成分為丙烯酸，已被研發(fā)用于動(dòng)物水性疫苗佐劑[9]。Deville等[10]研究表明Gel 01佐劑可增強(qiáng)活疫苗經(jīng)黏膜免疫途徑的免疫保護(hù)效果，但Gel 01佐劑用于豬支原體肺炎活疫苗黏膜接種的免疫效果尚未有報(bào)道。本研究采用Gel 01聯(lián)合豬支原體肺炎活疫苗滴鼻免疫小鼠，檢測(cè)其免疫效果，以期為豬肺炎支原體活疫苗黏膜佐劑的篩選提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料水佐劑 MontanideTMGel 01購(gòu)自法國(guó) Seppic 公司；雌性BALB/c小鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)比較中心；豬支原體肺炎（168株）活疫苗（批號(hào)：20170518）由本實(shí)驗(yàn)室制備提供；小鼠IL-4 ELISA檢測(cè)試劑盒、小鼠IFN-γ ELISA 檢測(cè)試劑盒和小鼠IL-17 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢基因美生物科技有限公司；TMB顯色液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠IgG抗體購(gòu)自武漢博士德生物公司；小鼠IgA、IgG1、IgG2a抗體購(gòu)自BETHYL公司。

1.2 動(dòng)物分組及免疫BALB/c雌性小鼠，隨機(jī)分成3組，每組20只，分別以50 μL/只含Gel 01（終濃度為20%）的豬支原體肺炎（168株）活疫苗（107CCU）和生理鹽水無(wú)佐劑的豬支原體肺炎（168株）活疫苗的生理鹽水滴鼻小鼠。首免14 d后加強(qiáng)免疫1次。

1.3 抗體檢測(cè)在末次免疫后第7 d、21 d、35 d和49 d分別對(duì)小鼠進(jìn)行眼框采血，1000×g離心15 min，分離血清，檢測(cè)小鼠血清中IgG、IgG1和IgG2a抗體水平。在末次免疫后第21 d和第49 d取小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF），300×g離心10 min，收集上清，檢測(cè)其中sIgA、IgG、IgG1和IgG2a抗體水平。

1.4 細(xì)胞因子檢測(cè)在免疫后第21 d、49 d，收集小鼠血清和BALF，離心后收集上清。根據(jù)ELISA 試劑盒說(shuō)明檢測(cè)血清和支氣管肺泡灌洗液（bronchoaveolar levage fluid，BALF）中IL-4、IL-17、IFN-γ 的含量。

1.5 小鼠淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定在免疫后第21 d，無(wú)菌分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整至5×106個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，分別加入5 μg豬肺炎支原體全菌抗原溶液（抗原刺激組）、5μL PBS溶液(陰性對(duì)照組)、2.5 μg刀豆蛋白溶液（陽(yáng)性對(duì)照組），每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)72 h后，加入10 μL的CCK-8溶液，孵育4 h后在450 nm測(cè)定吸光度。以純培養(yǎng)基的孔為空白對(duì)照孔。刺激指數(shù)=(抗原刺激孔OD值-空白對(duì)照孔OD值)/(PBS刺激孔OD值-空白對(duì)照孔OD值)

1.6 數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)采用Graphpad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)分析，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 Gel 01聯(lián)合疫苗黏膜免疫對(duì)小鼠局部體液免疫水平的影響Gel 01與豬支原體肺炎（168株）活疫苗滴鼻免疫小鼠后，檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IgG抗體及亞型的變化，結(jié)果見(jiàn)圖1。與疫苗組相比，末次免疫第21 d、49 d時(shí)，Gel 01+疫苗組能夠顯著提高BALF中活疫苗特異性IgG、IgG1和IgG2a抗體水平（p＜0.05），但對(duì)IgG1/IgG2a無(wú)顯著影響。同時(shí)檢測(cè)了BALF中黏膜抗體sIgA的含量，與疫苗組相比，Gel 01+疫苗組能顯著增強(qiáng)sIgA抗體水平（p＜0.05）。以上結(jié)果表明Gel 01與疫苗共同滴鼻能顯著增強(qiáng)小鼠的局部體液免疫反應(yīng)。

圖1 ELISA檢測(cè)小鼠免疫后BALF中抗體水平Fig. 1 ELISA detection of antibodies in mice BALF post immunization

2.2 Gel 01聯(lián)合黏膜疫苗免疫對(duì)小鼠局部細(xì)胞免疫的影響檢測(cè)Gel 01聯(lián)合疫苗免疫后，BALF中Th1（IFN-γ）、Th2（IL-4）和Th17（IL-17）型細(xì)胞因子含量的變化，結(jié)果見(jiàn)圖2。疫苗組的IFN-γ、IL-4和IL-17含量于對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，而Gel 01+疫苗組能顯著升高BALF中IFN-γ、IL-4和IL-17的含量（p＜0.05）。以上結(jié)果表明Gel 01可以增加Th1、Th2和Th17型細(xì)胞因子的表達(dá)，激活黏膜局部細(xì)胞免疫。

2.3 Gel 01聯(lián)合疫苗黏膜免疫對(duì)小鼠全身體液免疫水平的影響Gel 01與豬支原體肺炎(168株)活疫苗滴鼻免疫小鼠后不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)其血清中抗體水平，結(jié)果見(jiàn)圖3。對(duì)照組不能誘導(dǎo)產(chǎn)生活疫苗特異性IgG抗體；疫苗組在免疫后第21 d IgG抗體水平達(dá)到峰值，與對(duì)照組相比有顯著性差異（p＜0.01）；而Gel 01+疫苗組能夠顯著提高血清中活疫苗特異性IgG抗體水平（p＜0.05）。同時(shí)，檢測(cè)了Gel 01對(duì)抗體亞型IgG1和IgG2a的影響，結(jié)果顯示，末次免疫第7 d，疫苗組和Gel 01+疫苗組之間無(wú)顯著性差異；在免疫后第21、35、49 d時(shí)，Gel 01能進(jìn)一步提高活疫苗誘導(dǎo)的IgG1和IgG2a抗體水平（p＜0.05）。以上結(jié)果表明Gel 01聯(lián)合疫苗黏膜免疫能激活小鼠全身體液免疫。

2.4 Gel 01聯(lián)合疫苗黏膜免疫對(duì)小鼠全身細(xì)胞免疫水平的影響

2.4.1 Gel 01聯(lián)合疫苗黏膜免疫對(duì)血清細(xì)胞因子的影響 檢測(cè)Gel 01聯(lián)合疫苗免疫后，小鼠血清和灌洗液中Th1、Th2和Th17型細(xì)胞因子含量的變化，結(jié)果見(jiàn)圖4。疫苗組的血清中IFN-γ、IL-4和IL-17含量極顯著高于對(duì)照組（p＜0.01），而Gel 01+疫苗組能進(jìn)一步提升血清中IL-17的含量，但對(duì)IFN-γ和IL-4的含量無(wú)顯著影響。

圖2 ELISA檢測(cè)小鼠免疫后BALF中IFN-γ、IL-4和IL-17水平Fig. 2 ELISA detection of IFN-γ、IL-4和IL-17 levels in mice BALF post immunization

圖3 ELISA檢測(cè)小鼠免疫后血清抗體水平Fig. 3 ELISA detection of antibodies in mice serum post immunization

2.4.2 Gel 01對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響 于免疫后第21 d分離各免疫組的脾淋巴細(xì)胞，并用支原體全菌抗原刺激72 h測(cè)定細(xì)胞增殖情況，結(jié)果見(jiàn)圖5。與對(duì)照組相比，單獨(dú)活疫苗組的淋巴細(xì)胞未能顯著增殖，而Gel 01+疫苗組能夠產(chǎn)生對(duì)支原體抗原產(chǎn)生有效增殖應(yīng)答，顯著高于單獨(dú)疫苗組和對(duì)照組（p＜0.05）。

圖4 ELISA檢測(cè)小鼠免疫后血清IFN-γ、IL-4和IL-17水平Fig. 4 ELISA detection of IFN-γ、IL-4 and IL-17 levels in mice serum post immunization

圖5 各免疫組中豬肺炎支原體活疫苗細(xì)胞免疫刺激能力的變化Fig. 5 The cellular immune stimulation index of mice immunized with adjuvanted Mhp live vaccines

3 討論

Gel 01作為商品化的佐劑具有穩(wěn)定性好、副作用小的特性，已被報(bào)道用于多種動(dòng)物疫苗的佐劑。劉扶搖等[11]研究表明Gel 01與豬乙型腦炎活疫苗協(xié)同免疫小鼠后，很好的誘發(fā)免疫小鼠的體液免疫應(yīng)答，提高小鼠血清抗體水平，增強(qiáng)豬乙型腦炎活疫苗的免疫保護(hù)效果。Arous等[12]也證實(shí)Gel 01佐劑與豬圓環(huán)病毒滅活苗混合免疫小豬后，能顯著增強(qiáng)小豬中抗原特異性的抗體滴度，提高疫苗的安全性與穩(wěn)定性。但Gel 01佐劑配合豬支原體肺炎疫苗，并直接作用于黏膜系統(tǒng)，尚未有報(bào)道。我們前期實(shí)驗(yàn)表明Gel 01與豬肺炎支原體的兼容性較好，在濃度為20%時(shí)不影響豬肺炎支原體的活性?；诖耍狙芯渴状慰疾炝薌el 01作為黏膜佐劑應(yīng)用于豬肺炎支原體活疫苗的免疫效果，為豬肺炎支原體活疫苗黏膜佐劑的篩選提供實(shí)驗(yàn)支撐。

豬肺炎支原體以呼吸道局部定植感染為主，因此宿主呼吸道的局部黏膜免疫與病原的感染保護(hù)密切相關(guān)[13]。呼吸道鼻相關(guān)淋巴組織（nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues，NALT）是鼻腔免疫發(fā)揮重要作用的黏膜系統(tǒng)[14]。NALT中的抗體分泌細(xì)胞不僅包括IgA型，也包括IgG型。其中的IgA分泌細(xì)胞主要?dú)w巢至黏膜效應(yīng)部位，而IgG抗體形成細(xì)胞主要?dú)w巢至系統(tǒng)淋巴結(jié)，從而產(chǎn)生明顯的氣管和肺黏膜免疫反應(yīng)和系統(tǒng)免疫[15]。李元峰等[6]研究表明豬肺炎支原體疫苗經(jīng)滴鼻免疫能夠增加豬鼻黏膜和氣管IgA和IgG分泌細(xì)胞的面積，并促進(jìn)鼻黏膜及肺組織中產(chǎn)生豬肺炎支原體特異性sIgA抗體[8]。本研究檢測(cè)了小鼠滴鼻免疫后BALF中抗體水平，豬支原體肺炎活疫苗經(jīng)滴鼻免疫后能一定程度的升高IgG1的水平，但對(duì)IgG、IgG2a以及sIgA無(wú)顯著影響。一方面與豬肺炎支原體低免疫原性相關(guān)，另一方面也可能與豬肺炎支原體在小鼠呼吸道難以感染增殖而加強(qiáng)免疫應(yīng)答相關(guān)。而Gel 01聯(lián)合活疫苗免疫小鼠的BALF中抗原特性抗體（IgG、IgG1、IgG2a）的水平顯著高于單獨(dú)疫苗組，特別是對(duì)黏膜抗體sIgA的促進(jìn)作用尤為顯著。結(jié)果提示Gel 01聯(lián)合豬肺炎支原體活疫苗黏膜免疫能夠增強(qiáng)局部呼吸道體液免疫應(yīng)答水平。

研究表明B細(xì)胞受抗原刺激所產(chǎn)生的抗體種類與CD4+T細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子密切相關(guān)。CD4+T細(xì)胞經(jīng)樹(shù)突細(xì)胞提呈的MHC-外源性抗原肽復(fù)合物活化后，可分化為Th1、Th2和Th17等細(xì)胞亞型。其中Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ、IL-2和TNF-β等細(xì)胞因子，IFN-γ可促使B細(xì)胞分泌抗原特應(yīng)性的IgG2a抗體；而Th2細(xì)胞分泌的IL-4，可促進(jìn)抗體類別向IgG1和IgE轉(zhuǎn)化[16]。Th17細(xì)胞分泌IL-17可促進(jìn)B細(xì)胞分化為IgA分泌細(xì)胞，提高sIgA的水平[17]。因此，為了探明Gel 01對(duì)黏膜局部細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響，本研究檢測(cè)了免疫后小鼠BALF中相關(guān)因子的水平。結(jié)果顯示，Gel 01聯(lián)合豬肺炎支原體活疫苗免疫后能顯著上調(diào)BALF中Th1（IFN-γ）、Th2（IL-4）和Th17（IL-17）型細(xì)胞因子的表達(dá)，這些細(xì)胞因子水平的升高也與之前檢測(cè)的抗體水平的升高相一致。以上結(jié)果表明Gel 01能夠同時(shí)增強(qiáng)局部的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)較強(qiáng)的黏膜免疫。

研究表明，全身的細(xì)胞免疫對(duì)于豬肺炎支原體的感染保護(hù)可能也起著重要的作用[18]。本研究結(jié)果也顯示 Gel 01佐劑配合豬肺炎支原體滴鼻免疫能夠顯著促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖分化，從而提高機(jī)體的細(xì)胞免疫水平。

綜上所述，利用黏膜免疫佐劑 GEL01 配合豬肺炎支原體活疫苗經(jīng)黏膜接種能夠顯著提高小鼠呼吸道局部的黏膜免疫應(yīng)答水平，并可激活全身循環(huán)系統(tǒng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，提示GEL01可作為豬肺炎支原體活疫苗的有效黏膜佐劑預(yù)防豬肺炎支原體感染。