歐陽夢真 朱磊 孫治強 李勝利 吳幗秀 李陽 何富豪 李嚴曼

摘 要：WRKY轉錄因子是植物中所特有的一類轉錄因子，以基因家族形式存在，并在植物的生長發(fā)育和逆境響應等過程中發(fā)揮重要的作用。采用RT-PCR的方法從西瓜中分離得到一條西瓜ClWRKY54基因。序列分析表明，該基因開放閱讀框全長1 428 bp，編碼475個氨基酸。其編碼蛋白分子量約為51.82 KD，等電點為6.17。該基因蛋白序列中包含2個WRKY保守結構域，鋅指結構為C2H2型，屬于典型的1類WRKY基因。進化樹分析顯示，該基因蛋白序列同葫蘆科作物中的甜瓜、黃瓜、西葫蘆等的WRKY26具有較高的同源性，處于同一分支上。亞細胞定位分析顯示，該基因編碼蛋白定位于細胞核中。對該基因進行熒光定量PCR分析研究其表達特性，結果顯示該基因在西瓜根、莖、葉中均有表達，但是在葉片中表達量最高;H2O2可以誘導該基因的表達，而乙烯處理可以抑制該基因的表達，這說明該基因可能參與逆境下H2O2和乙烯所介導的信號途徑。在模擬干旱下，該基因表達無變化，說明該基因同干旱脅迫抗性不相關。本研究的結果將為進一步的解析ClWRKY54的功能奠定基礎。

關鍵詞：西瓜;ClWRKY54;亞細胞定位;表達分析

Cloning， subcellular localization and expression analysis of ClWRKY54 in Citrullus lanatus

OUYANG Mengzhen， ZHU Lei， SUN Zhiqiang， LI Shengli， WU Guoxiu， LI Yang， HE Fuhao， LI Yanman

（College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： The WRKY transcription factors， uniquely existing in plants in the form of gene family， play important roles in plant growth， development and stress responses. In this study， a WRKY transcription factor gene ClWRKY54 was isolated from watermelon （Citrullus lanatus） leaves using reverse transcription PCR. Sequence analysis showed that the full length of the open reading frame of this gene was 1 428 bp， encoding 475 amino acids. The molecular weight of the encoded protein was about 51.82 KD and the isoelectric point was 6.17. The protein sequence of the gene contained two conserved WRKY domains with a C2H2 type zinc finger structure， respectively， which was a typical feature of the WRKY Group 1. Evolutionary tree analysis showed that the protein sequence of the gene was highly homologous with WRKY26 of Cucurbitaceae crops such as melon， cucumber and zucchini. Subcellular localization analysis showed that the ClWRKY54 was located in the nucleus. The expression characteristics of the gene were analyzed by quantitative RT-PCR. Results showed that the gene was expressed in roots， stems and leaves of watermelon， but the highest expression was found in leaves. H2O2 could induced the expression of ClWRKY54， while ethylene treatment could inhibit its expression， indicating that the gene might participate in the signal pathways mediated by hydrogen peroxide and ethylene under stresses. Under drought， the expression of ClWRKY54 remained unchanged， suggesting that it might not be related to drought stress. The results of this study would lay a foundation for further analysis of the functions of ClWRKY54.

Key words： Citrullus lanatus; ClWRKY54; Subcellular localization; Expression analysis

植物在生長過程中會遭受到各種類型的生物和非生物脅迫。為了抵御環(huán)境脅迫，植物在長期的進化過程中形成了一系列復雜的保護機制。通過這種機制，植物迅速感受和傳遞逆境信號，然后激活一系列抗性基因來提高自身對逆境的抵御能力。近年來，基因組測序工作的完成極大方便了人們對逆境脅迫相關基因的研究。目前已經有許多與逆境相關的基因被分離出來，尤其是WRKY、NAC、MYB、ERF等各種轉錄因子。對這些基因功能的解析將有助于我們揭示植物響應逆境的各種調控網絡。

WRKY轉錄因子是植物所特有的一類轉錄因子，以基因家族形式存在。目前WRKY轉錄因子的基因已經陸續(xù)在不同作物中被分離和鑒定出來，包括葡萄、番茄、水稻、黃瓜等[1-4]。在不同的植物中WRKY家族所包含的基因數(shù)目不一樣，例如番茄中包含81個WRKY轉錄因子[2]，而水稻含有100多個[5]，在西瓜中分離到了57個WRKY轉錄因子基因[6]。所有的WRKY轉錄因子基因蛋白序列中包含1個或2個有60個氨基酸的WRKY結構域，其C端含有C2H2或者C2HC類型的鋅指結構[7]。許多研究表明，WRKY轉錄因子家族基因在植物對逆境的響應過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，過量表達黃瓜CsWRKY46的擬南芥植株同對照相比，其耐低溫能力得到了顯著提高，同時其能通過ABA信號途徑來調控植物的耐低溫性[8]。棉花中的研究發(fā)現(xiàn)，GhWRKY3可以被各種逆境信號分子（SA、MeJA、ABA、GAs 和ET）、機械損傷以及病原菌侵染等所誘導表達，而6-BA、生長素、干旱、NaCl和低溫（4 ℃）處理對其表達卻沒有影響[9]。過表達菊花DgWRKY1的煙草植株表現(xiàn)出較強的耐鹽性[10]。PEG、NaCl、低溫和H2O2均可以誘導水稻中的TaWRKY10基因表達，其在煙草中的過量表達可以提高煙草的耐鹽和耐旱性[11]。這些研究說明，WRKY家族基因可能在多種逆境中發(fā)揮重要的調控作用，同時可能參與多種逆境信號途徑。

西瓜（Citrullus lanatus），屬于葫蘆科西瓜屬，一年生蔓生藤本。由于營養(yǎng)豐富和美味，廣受世界各地消費者的喜愛，而我國是世界上西瓜種植面積最大的國家。西瓜在生長過程中容易受到各種逆境的影響，極大影響其產量和品質，因此對于西瓜抗逆性的研究具有重要的經濟價值。前期研究中，根據西瓜基因組測序信息，已經將西瓜中所有的WRKY基因序列下載下來，對所有WRKY家族基因進行鑒定、分類和命名，并系統(tǒng)分析了所有西瓜WRKY家族基因對低溫的響應情況[6]。筆者以西瓜葉片為材料，利用RT-PCR將ClWRKY54克隆出來，通過構建GFP和ClWRKY54的融合表達載體，轉化煙草對該基因編碼蛋白進行亞細胞定位分析，采用熒光定量PCR（qRT-PCR）的方法研究該基因在不同組織中的表達情況，以及在逆境脅迫和信號分子作用下，該基因在西瓜葉片中的響應特點，可以為下一步通過轉基因的方法揭示ClWRKY54在西瓜逆境調控中的作用機制奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

西瓜材料‘砧木西瓜（ZXG01016）種子由中國農業(yè)科學院鄭州果樹研究所提供。2018年5月于河南農業(yè)大學園藝學院人工氣候室進行育苗。

1.2 方法

1.2.1 西瓜ClWRKY54基因的CDS克隆 采用北京華越洋生物的快速通用植物RNA提取試劑盒3.0提取西瓜葉片總RNA，然后采用ABM公司的5X All-In-One RT MasterMix （with AccuRT Genomic DNA Removal Kit）試劑盒將RNA反轉錄cDNA。根據前期從西瓜數(shù)據庫中下載的ClWRKY54基因（Gene ID：Cla018026）序列設計特異性引物（ClWRKY54-CDS-F：5′-ATGAATAACATAAATCAAACGA-3′;ClWRKY54-CDS-F-R：5′-CTAA

GATAGAAATGAGTTGATGAA-3′）。以西瓜葉片cDNA為模板進行反轉錄PCR擴增，將ClWRKY54基因的CDS區(qū)域克隆出來。PCR反應體系為25 ?L，Prime STAR MAX Premix（2×）12.5 ?L，模板cDNA 1 ?L，上下游引物各1 ?L，dd H2O 9.5 ?L，總體積為25 ?L。PCR擴增程序為94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，35個循環(huán);72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

1.2.2 西瓜ClWRKY54基因的生物信息學分析 通過ExPASy軟件（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/Protparam）進行蛋白質分子量和等電點的預測。利用在線軟件Plant-PLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）預測其編碼蛋白的亞細胞位置。通過 MEGA 6.0軟件進行不同序列的進化樹分析，采用的方法是Neighbor-joining。通過Clustalx 2對不同序列進行多重比對分析。

1.2.3 西瓜ClWRKY54基因編碼蛋白的亞細胞定位 亞細胞定位所用的載體為pH7LIC5.0-ccdB rc-N-eGFP載體。首選將GFP載體進行Stu I酶切，獲得線性化片段。通過ClWRKY54特異引物和高保真酶Prime STAR MAX進行擴增獲得ClWRKY54基因的CDS序列，并送樣測序。選取測序正確的菌液為模板，在ClWRKY54特異引物的前端加上15個GFP載體同源序列（wrky54-GFP-F：TACGCCGAGGCCTGCATGAATAACATAAATCAAAC;wrky54-GFP-R：TTAGGGAAGAGGCCTCTAAGATAGAAATGAGTTGATGA），然后采用高保真酶進行PCR擴增，獲得帶有Stu I酶切位點的ClWRKY54序列。將獲得的載體線性化片段和帶有Stu I酶切位點的ClWRKY54基因的PCR產物，進行純化回收。按照摩爾比1︰2的比例，并利用In-Fusion的同源重組技術進行連接反應，轉化DH5a菌株，擴繁和檢測陽性克隆。最后提取質粒，并進行檢測。將GFP和ClWRKY54重組載體轉入農桿菌GV3101后，于28 ℃ YEB培養(yǎng)基中揺培，離心后用農桿菌滲透液重懸菌體，最終使OD600值達到0.8，25 ℃黑暗放置2～3 h。選取長勢良好的本氏煙植株，將上述菌體懸浮液用2.5 mL的一次性注射器吸取出來，從煙草葉片下表皮慢慢注射，讓菌液充滿整個煙草葉片，黑暗培養(yǎng)2 d后使用激光共聚焦顯微鏡觀察煙草葉片中綠色熒光蛋白的表達情況。

1.2.4 ClWRKY54基因熒光定量PCR分析 西瓜幼苗長至2葉1心時，選取生長一致的西瓜，分別進行模擬干旱和信號（乙烯和H2O2）分子處理。干旱處理為將苗的根部浸入400 mmol·L-1的甘露醇溶液中。乙烯和H2O2處理分別為對西瓜全株噴灑濃度為5 mmol·L-1的乙烯和10 mmol·L-1的H2O2溶液。在0、6、12、24和48 h分別采集各處理下的葉片樣品。將清水處理的西瓜幼苗葉片設置為對照。為了分析ClWRKY54基因的組織表達特性，分別采集2葉1心時期西瓜根、莖、葉的部分組織。采集的樣品用液氮速凍，-80 ℃冰箱備用。每個處理設 3 次重復，每次重復3株幼苗。

采用北京華越洋生物的快速通用植物RNA提取試劑盒3提取西瓜葉片的總RNA，然后采用Takara公司PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。以elongation factor 1-a作為內參基因[12]。ClWRKY54熒光定量PCR引物為ClWRKY54-F：CATCGGTA

GTCATTCTTTCC;ClWRKY54-R：TATGTCATCTCTGGCTTCTT。采用ABM公司EvaGreen 2X qPCR MasterMix熒光定量試劑盒，在Applied Biosystems StepOne and StepOnePlus Real-Time PCR Systems（ABI，美國）進行熒光定量PCR反應。熒光定量采用20 ?L PCR反應體系：cDNA模板2 ?L，F(xiàn)orward primer 1 ?L，Reverse primer 1 ?L，Premix TaqTM 10 ?L，ddH2O 6 ?L。反應程序為95 ℃，30 s;95 ℃，30 s;60 ℃，20 s;72 ℃，延伸30 s;40個循環(huán)。熒光定量試驗結果最后采用2?ΔΔCT的方法進行計算[13]。具體計算過程如下：用目的基因Ct值減去自身內參基因Ct值，得到的數(shù)就是ΔCt;用所有樣本的ΔCt減去對照組樣本的ΔCt，得到ΔΔCt;對所有ΔΔCt結果前面加上負號即取負數(shù)，得到的結果就是-ΔΔCt。最后，對-ΔΔCt進行2的冪運算，即2-ΔΔCt。

2 結果與分析

2.1 西瓜ClWRKY54基因的CDS克隆

前期研究中，筆者已經根據西瓜基因組測序信息下載下來西瓜WRKY基因家族所有基因序列，并根據染色體分布位置將57個家族基因分別進行命名，根據其中的ClWRKY54序列設計特異性引物，以西瓜葉片cDNA為模板進行RT-PCR擴增，得到西瓜ClWRKY54基因的ORF全長序列（圖1）。其ORF全長1 428 bp，編碼475個氨基酸。通過軟件進行預測，發(fā)現(xiàn)其編碼蛋白分子質量約為51.82 kD，等電點為6.17。將ClWRKY54在NCBI上進行Blastx比對，發(fā)現(xiàn)與其他物種的WRKY26和WRKY33具有較高的相似性。與甜瓜（Cucumis melo）、黃瓜（Cucumis sativus）、西葫蘆（Cucurbita pepo subsp. pepo）等的WRKY26相似性達到86%以上。

2.2 西瓜ClWRKY54的同源性分析

將ClWRKY54蛋白序列與在NCBI上與其相似性相對較高的WRKY基因編碼的蛋白質序列進行多序列比對（圖2）。結果發(fā)現(xiàn)，這些蛋白均具有WRKY基因家族中第1類WRKY轉錄因子的典型特征，序列中均含有2個WRKY蛋白結構域，其鋅指結構類型均為C2H2類型。同時不同物種WRKY蛋白序列在N和C末端相對來說保守性較差，而在WRKY結構域保守性卻非常高。

將其他物種中與ClWRKY54相似性較高的18個蛋白序列下載下來，將ClWRKY54蛋白序列與這18個基因編碼的氨基酸序列一起進行進化分析，構建系統(tǒng)進化樹（圖3）。進化樹分析表明，所有序列明顯分為2個大類，其中所有的WRKY33和辣椒的CaWRKY26位于一個大的分支上，而西瓜ClWRKY54與苦瓜McWRKY26、甜瓜CmWRKY26、黃瓜CsWRKY26、南瓜CmWRKY26位于另一個分支上，這些同屬于葫蘆科植物，說明ClWRKY54同這些基因的氨基酸序列具有較近的親緣關系，同時說明ClWRKY54可能同這些基因具有相似的功能。

2.3 西瓜ClWRKY54的亞細胞定位分析

首先通過Plant-PLoc軟件預測了ClWRKY54編碼蛋白的亞細胞位置，結果定位于細胞核中。為了驗證預測的結果，構建35S：ClWRKY54-GFP的融合表達載體，注射到煙草下表皮細胞中，在激光共聚焦顯微鏡上觀察綠色熒光蛋白在細胞中的位置，發(fā)現(xiàn)重組質粒侵染的細胞，只有在細胞核上可以觀測到熒光信號。這說明ClWRKY54是一個核定位蛋白，這與其作為轉錄因子的功能特點相符（圖4）。

2.4 西瓜ClWRKY54的表達分析

由圖5可以看出，西瓜ClWRKY54在干旱條件下表達量同對照相比沒有顯著差異。植物信號分子在植物對逆境的響應過程中參與復雜的調控網絡，為了研究ClWRKY54可能參與的信號途徑，分析了該基因在乙烯和H2O2處理下的表達情況，結果表明，H2O2早期可以顯著誘導ClWRKY54基因表達，而乙烯可以顯著抑制ClWRKY54基因表達。對ClWRKY54基因進行組織表達分析發(fā)現(xiàn)，ClWRKY54在西瓜不同組織中均有表達，在葉片中表達量最高，其次是莖和根。

3 討論與結論

WRKY轉錄因子是植物所特有的一類轉錄因子，WRKY轉錄因子家族也是包含基因最多的轉錄因子家族之一。其家族基因不僅在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，同時也參與植物對各種逆境的抗性反應過程[14-16]。目前關于WRKY轉錄因子的功能也是研究的熱點，在許多植物中的生物學功能已經得到了廣泛的研究和闡述，而關于西瓜WRKY基因家族基因功能的研究相對較少。西瓜是我國重要的經濟作物，其產量和品質在生產中常常受到各種環(huán)境因子的影響。前期研究中，筆者對西瓜的WRKY家族基因進行了鑒定、分類、命名及低溫表達分析，其中ClWRKY54是一條對低溫響應較為敏感的基因[6]，因此在本研究中對西瓜ClWRKY54的生物學功能進行重點研究。

對蛋白質序列進行分析發(fā)現(xiàn)，ClWRKY54具有典型的WRKY家族結構特征，包含2個WRKY結構域，屬于WRKY家族I家族的成員。進化樹分析顯示，ClWRKY54同葫蘆科作物植物中的苦瓜McWRKY26、甜瓜CmWRKY26、黃瓜CsWRKY26、南瓜CmWRKY26表現(xiàn)出較高的相似性，這說明ClWRKY54可能與這些基因具有相似的功能。筆者首先通過Plant-PLoc軟件預測了ClWRKY54蛋白的亞細胞位置，結果顯示其可能位于細胞核中。為了進一步驗證預測結果，通過GFP熒光定位方法對其進行亞細胞定位，結果發(fā)現(xiàn)其位于細胞核中。這與許多前人研究結果一致[8，10]。作為一種轉錄調節(jié)因子，WRKY可能是通過與其他基因的啟動子區(qū)域進行結合而調節(jié)其他基因的表達。

雖然很多研究表明WRKY廣泛參與植物對逆境的抗性反應，同時調節(jié)植物的生長發(fā)育過程。但是WRKY家族中每個基因功能各異。因此，為了進一步研究其功能，筆者采用熒光定量PCR分析了ClWRKY54基因的表達特性，實時熒光定量PCR結果表明，在干旱條件下，ClWRKY54基因表達無顯著變化，表明ClWRKY54可能不參與植物對干旱脅迫的抗性。同時許多研究發(fā)現(xiàn)，WRKY受各種信號分子的誘導，參與植物對逆境響應的各種信號途徑[9]?；钚匝酰≧OS）可以影響許多基因的表達，進而影響植物對逆境的響應，而H2O2是其中一個關鍵的信號分子[17-18]。乙烯是一種重要的逆境響應信號分子，可以調控植物對逆境的抗性反應[19]。棉花中的研究發(fā)現(xiàn)，乙烯和H2O2均可以誘導GhWRKY3基因的表達[9]，葡萄的乙烯響應轉錄因子VaERF092可以通過結合到VaWRKY33啟動子區(qū)域從而調控其表達，進而提高植物的抗冷性[20]。水稻中的研究發(fā)現(xiàn)，TaWRKY51轉錄因子可以通過負調控乙烯的生物合成進而影響側根的形成[21]。因此，本研究中筆者分析了其對H2O2和乙烯的響應情況，結果發(fā)現(xiàn)，H2O2在早期可以誘導其表達，說明其可能參與H2O2所有誘導的信號途徑。乙烯處理卻可以顯著抑制ClWRKY54表達，這表明ClWRKY54基因可能同乙烯信號途徑存在負調控關系，具體功能還需進一步的研究確定。對ClWRKY54基因進行組織表達分析發(fā)現(xiàn)，其在根、莖、葉中均有表達，在葉片中的表達量最高，而在根中的表達量最低，說明該基因在不同組織中的表達具有差異，這與在其他植物中的研究結果相一致[8，22]，同時說明該基因的功能可能涉及到多個方面。

綜上所述，筆者從西瓜葉片克隆到西瓜的ClWRKY54基因，其蛋白序列中包含2個WRKY結構域，同時其鋅指結構類型均為C2H2，屬于WRKY基因家族中1類家族的典型特征。該基因編碼蛋白定位于細胞核中?；虮磉_分析顯示，該基因在根、莖、葉中均有表達，在葉中表達量最高。該基因表達受乙烯抑制，受H2O2誘導，ClWRKY54可能參與多種逆境信號途徑，干旱模擬對其表達無影響。

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