曹琳嬌 李曉杰 焦棒棒 梁毅 馬長生

摘 要：蔬菜在人們?nèi)粘ｏ嬍持姓紦?jù)重要地位，可為人體提供維生素、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)物質(zhì)。顏色是蔬菜育種中重要的感官指標，而蔬菜顏色的形成受不同類型花青苷的影響?；ㄇ嘬赵谥参锷L發(fā)育、延緩機體衰老、預(yù)防心臟病等方面都發(fā)揮重要作用。研究表明，花青苷的生物合成受結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的共同調(diào)控，分子水平上對蔬菜花青苷遺傳機制的研究也在不斷加深。筆者綜述了與蔬菜花青苷生物合成途徑中相關(guān)結(jié)構(gòu)基因及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的研究現(xiàn)狀，并對蔬菜花青苷的研究前景進行了展望。

關(guān)鍵詞：蔬菜;花青苷;結(jié)構(gòu)基因;轉(zhuǎn)錄調(diào)控

Advances in biosynthesis and transcriptional regulation of anthocyanin in vegetables

CAO Linjiao1， LI Xiaojie2， JIAO Bangbang1， LIANG Yi2， MA Changsheng1

（1. College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. Beijing Vegetable Research Center， Beijing Academy of Agriculture and Forestry， Beijing 100097， China）

Abstract： Vegetables occupy an important position in people's daily diet， and its can provide a variety of nutrition material such as vitamins， minerals for human body. Color is an important sensory index in vegetable breeding， and the formation of vegetable color is influenced by different types of anthocyanins. Anthocyanin plays an important role in plant growth and development， delaying aging， preventing heart disease and other aspects of human health. Studies have shown that the biosynthesis of anthocyanin is co-regulated by structural genes and regulatory genes， and the research on the genetic mechanism of anthocyanin in vegetables at the molecular level is deepening. In this paper， the research status of structural genes and transcriptional regulation genes related to vegetable anthocyanin biosynthesis pathway is reviewed， and the research prospect of vegetable anthocyanin is prospected.

Key words： Vegetable; Anthocyanin ;Structural genes; Transcriptional regulatory

蔬菜是一年或多年生草本或木本植物，含有幼嫩多汁的食用器官。從植物學分類上看，我國普遍栽培的蔬菜分為十字花科、傘形科、茄科等20多個科，包括白菜、胡蘿卜、番茄等物種。蔬菜中含有大量的花青素、類胡蘿卜素、番茄紅素、維生素C等營養(yǎng)元素，具有較高的食用價值，還有增加飽腹感、促進消化等作用，是人體吸收膳食纖維、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的主要來源。其中，深色蔬菜（深綠色、紅色、橘紅色、紫紅色等）更具營養(yǎng)優(yōu)勢。這些深色蔬菜由于高度富含花青素而越來越受到消費者的青睞，蔬菜顏色也成為選育和食用蔬菜最重要的品質(zhì)之一。

花青素是植物次生代謝產(chǎn)物，屬于類黃酮物質(zhì)，主要積累在葉片、果實和花瓣表皮細胞的液泡內(nèi)，賦予植物藍、紫、紅等顏色。花青素主要分為天竺葵素、矢車菊素、飛燕草素、芍藥花素、矮牽牛素和錦葵色素[1]，如紫白菜中高度?；吞腔揎椀氖杠嚲账豙2]，洋蔥中的矢車菊色素和飛燕草色素以及心里美蘿卜中的天竺葵素[3]。但花青素在植物內(nèi)不能穩(wěn)定存在，常與糖（葡萄糖、半乳糖、蕓香糖、龍膽三糖等）通過糖苷鍵形成花青苷。

花青苷在調(diào)控生長素運輸、花的發(fā)育等方面發(fā)揮作用?；ㄇ嘬丈锖铣蛇^程中產(chǎn)生的黃酮醇已被認為與生長素轉(zhuǎn)運負調(diào)控有關(guān);花青苷還可能通過增加生長素的細胞內(nèi)濃度，轉(zhuǎn)而促進植物極性生長?；ㄇ嘬漳苁怪参锏幕ǔ尸F(xiàn)五顏六色，有利于吸引昆蟲傳播花粉，也有利于鳥類和動物采食種子以促進種子的傳播和繁育?；ㄇ嘬者€廣泛參與了防御紫外線、植物與微生物的互作、植物抗逆等過程?；ㄇ嘬站哂卸喾N生物活性功能和藥用價值，因其有較強的氧化還原活性，可作為抗氧化劑、自由基清除劑和二價陽離子的螯合劑，用于延緩人類機體衰老。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，花青苷在保護視力、預(yù)防心臟病及降低癌癥等方面發(fā)揮非常重要的醫(yī)療保健功能。

花青苷的生物合成受兩類基因的共同控制，一類是結(jié)構(gòu)基因，編碼其生物合成途徑中所需要的酶;另一類是調(diào)節(jié)基因，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的時空表達[4]。其生物合成途徑是植物中表征較為完善的次級代謝途徑之一，合成途徑中所包含的主要結(jié)構(gòu)基因和許多調(diào)控基因已經(jīng)在擬南芥、玉米、矮牽牛等模式作物中得到了很好的表征。目前對蔬菜花青苷的研究不僅落后于模式作物，也落后于果樹、花卉等園藝作物，但關(guān)于蔬菜花青苷的積累特性、生物合成及調(diào)控機制也取得了一定的進展。筆者概述了蔬菜花青苷生物合成途徑關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的研究現(xiàn)狀。

1 與花青苷合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因

花青苷的生物合成是一系列酶促反應(yīng)（圖1），其生物合成途徑已經(jīng)在馬鈴薯、番茄、茄子、洋蔥、甘藍等蔬菜作物中都有了一定的研究。

1.1 CHS（Chalcone synthase）

CHS是類黃酮代謝途徑中的第一個關(guān)鍵限速酶，位于花青苷合成通路的上游，催化4-香豆酰輔酶A和對香豆酰CoA生成查爾酮。甘薯IbCHS1[7]、茄子SmCHS[8]、辣椒CaCHS04和CaCHS05[9]等基因的表達量與不同顏色品種中花青苷含量呈正相關(guān)，表明這些CHS基因在花青苷合成途徑中起關(guān)鍵作用。然而，胡朝陽等[10]通過RT-PCR分析表明，紫色馬鈴薯StCHS基因主要在莖和葉柄中表達，而在根、塊莖和葉軸中幾乎檢測不到，表明StCHS基因表達具有組織特異性。

1.2 CHI（Chalcone isomerase）

查爾酮經(jīng)CHI催化生成二氫黃酮醇，CHI基因表達量的高低通過影響查爾酮代謝的量間接影響花青苷的合成。CHI基因一般在植物各個組織中都有表達，其中白菜CHI（BrCHI）基因家族的表達還存在一定的器官差異性和時空特異性。如BrCHI1在生殖器官中表達;而BrCHI2主要在發(fā)育早期的種子中表達;BrCHI3在葉、花、蕾和中期種子中表達;而BrCHI4 也是主要在生殖器官中表達，但在種子發(fā)育后期表達量明顯高于其他階段。BrCHI基因各成員間表達的時空特異性表現(xiàn)在：BrCHIl表達量最高，BrCHI4表達量最低。洋蔥CHI基因的失活阻斷了花青苷的生物合成，導致了金色鱗莖的產(chǎn)生，其在番茄中的共表達可以增強花青素和黃酮醇的產(chǎn)生[11]，而且它對擬南芥PAP1調(diào)控基因的協(xié)同作用可以增強番茄皮的花青苷含量[12]。Guo J等[13]的研究結(jié)果表明，IbCHI是甘薯花青苷生物合成途徑中發(fā)揮作用的關(guān)鍵酶，在根發(fā)育的早期階段負責花青苷生物合成的活化。

1.3 F3H（Flavanone 3-hydroxylase）

F3H位于花青苷合成途徑的中樞位點，控制著合成途徑的代謝流向，在種皮和花的顏色形成中具有重要作用。F3H基因在不同的植物或組織中具有底物特異性，可以催化黃烷酮在C3位置羥基化形成無色的黃烷酮醇，也能夠催化圣草酚、柚皮素、5羥基雙氫黃酮等在3位置的羥基化生成二氫黃酮醇。F3H基因在大多數(shù)物種中也僅以單拷貝形式存在，但在洋蔥中以雙拷貝形式存在，并催化柚皮素羥基化以產(chǎn)生二氫山萘酚。BrcF3H在紫色不結(jié)球白菜葉片中的表達量極顯著高于在綠色葉片中的表達量，且其表達水平與不結(jié)球白菜葉片紫色著色程度正相關(guān)，推測此F3H基因為影響不結(jié)球白菜花青苷生物合成的關(guān)鍵基因之一。光在F3H基因的表達中發(fā)揮重要作用，如光可以誘導蕪菁F3H基因的表達;閆瑞霞等[14]也通過葉片遮光處理試驗證明紫山藥DaF3H基因受光調(diào)節(jié)，且DaF3H基因表達與花青苷的積累表現(xiàn)為同步。

1.4 DFR（Dihydroflavonol 4-reductase）

DFR是花青苷合成后期發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶，是決定無色到有色的重要調(diào)控點，DFR基因在進化中高度保守。Sunggil kim等[15-16]利用RACE技術(shù)克隆了DFR基因，通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)DFR基因僅在紅皮洋蔥中表達，轉(zhuǎn)錄水平上DFR基因的失活導致美國黃洋蔥中缺乏花青苷，并進一步根據(jù)DFR基因的突變設(shè)計了基于PCR的分子標記。Sunggil kim等[17]研究發(fā)現(xiàn)了DFR-A基因的2個新的突變類型也會導致洋蔥表皮花青苷的缺失;Song等[18]研究發(fā)現(xiàn)，至少有9個DFR-A基因獨立的自然突變會導致黃皮洋蔥中花青苷合成的缺失。Zhang Chunsha等[19]通過轉(zhuǎn)錄組測序和代謝分析表明，DFR基因在洋蔥深紅色鱗莖的生物合成中發(fā)揮重要作用，其表達水平可能起到阻止藍色色素沉著的作用。郭晉雅等[20]研究發(fā)現(xiàn)，紫肉甘薯IbDFR在塊根中的表達量與其花青苷含量的變化趨勢一致;Hongxia W等[21]用RNAi方法下調(diào)了轉(zhuǎn)基因甘薯中IbDFR基因的表達，則顯著減少了甘薯幼葉、莖和貯藏根中花青苷的積累。這都表明IbDFR可能是紫甘薯花青苷合成代謝過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶基因。SmDFR基因、BrcDFR基因也分別在茄子和不結(jié)球白菜花青苷生物合成中發(fā)揮重要作用。

1.5 ANS（Anthocyanidin synthase）

ANS是位于花青苷合成通路末端的酶，催化無色花青素向有色花青素的轉(zhuǎn)化，其在基因水平、轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平存在的差異都有可能會影響花青苷的合成。Eun-Young Kim等[22]鑒定出2個新的ANS基因的等位變異，這種變異可以造成洋蔥花青苷合成的缺失。許玉超等[23]發(fā)現(xiàn)，紫色不結(jié)球白菜ANS基因（BrcANS）mRNA表達量與葉片紫色直接相關(guān)，表明其可能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控葉片中紫色的形成。孫玉燕等[24]的研究表明，心里美蘿卜RsANS推導得到的氨基酸序列與白蘿卜存在4個氨基酸的差異，這種差異可能是導致心里美蘿卜和白蘿卜根肉色不同的關(guān)鍵因素之一。

1.6 UFGT（UDP-flavonoid glucosyltransferase）

UFGT是花青苷合成途徑發(fā)揮作用的最后一個關(guān)鍵限速酶。張洪偉等[25]從洋蔥中克隆得到了AcUFGT1基因和AcUFGT2基因，表達分析的結(jié)果表明，這2個基因在紅洋蔥中表達量很高，但在黃洋蔥和白洋蔥中幾乎不表達，這表明AcUFGT1和AcUFGT2與洋蔥鱗莖不同顏色的形成有關(guān)。前人通過紫肉甘薯和黃肉甘薯的RNA測序結(jié)果對比、PCR檢測和Southern blot等方法發(fā)現(xiàn)并證明了UF3GT是甘薯花青苷合成途徑的關(guān)鍵酶之一，且3GT是紫肉甘薯花青苷的重要組分之一。Liu Y等[26]證明了StUFGT1與馬鈴薯塊莖中的花青苷生物合成相關(guān)，還發(fā)現(xiàn)了11個注釋為UFGT的基因在紫色薯塊與薯皮中差異表達;RNA-seq結(jié)果表明，紫色和白色馬鈴薯品種的UFGT基因有涉及功能變化或基因定位的SNP。

2 與花青苷合成相關(guān)的調(diào)節(jié)基因

基因的時空表達受轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平的調(diào)控，而類黃酮生物合成的調(diào)節(jié)點通常發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。參與花青苷生物合成的主要調(diào)節(jié)基因如圖2所示。

2.1 R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子

MYB蛋白是高度保守的，所以調(diào)控基因的特異性較高，該結(jié)構(gòu)域通常包括1～4個氨基酸重復(fù)（R基序）。MYB蛋白每個R基序中第3個α螺旋在與DNA接觸過程中起到識別DNA的功能，該α螺旋可以結(jié)合到DNA雙螺旋的大溝結(jié)構(gòu)內(nèi)，能使MYB蛋白精確的結(jié)合到特定DNA序列上。根據(jù)R基序的不同，可以將MYB分為R2R3-MYB、1R-MYB、3R-MYB和4R-MYB這4類。其中，編碼R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的基因被認為是決定植物中黃酮類化合物空間和時間發(fā)生的關(guān)鍵?，F(xiàn)已從許多蔬菜中分離并鑒定了參與調(diào)控花青苷合成的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，如洋蔥AcMYB1、白菜BrMYB2和BrMYB4、甘薯IbMYB1等。

Schwinn Kathy E等[29]證明了AcMYB1是洋蔥產(chǎn)生花青苷的正向調(diào)節(jié)因子，是洋蔥鱗莖產(chǎn)生紅色表型的關(guān)鍵;短暫過表達AcMYB1基因時可誘導洋蔥組織中花青苷的產(chǎn)生，且通過RNAi瞬時抑制其表達時可以減少色素沉著。穆春等[30]的研究表明，白菜BrMYB2和BrMYB4及甘薯IbMYB1也在花青苷積累中發(fā)揮正調(diào)控作用，其中BrMYB2還參與白菜花青苷生物合成的激活過程;IbMYB1被認為可能參與調(diào)控了IbCHI、IbDFR等與花青苷合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因。Chu H等[3]隨后發(fā)現(xiàn)，甘薯IbMYB1a基因的表達可以誘導擬南芥中的花青素積累，且其可以誘導ANS基因表達上調(diào)。大部分R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子對結(jié)構(gòu)基因的表達起正調(diào)控作用，還有少數(shù)起負調(diào)控作用。如草莓FaMYB1（R2R3-MYB）在煙草中的異源表達就會抑制煙草花瓣中花青素及槲皮素的積累，并影響ANS、UFGT基因的表達活性[32]。

2.2 bHLH（basic helix-loop-helix）

bHLH是根據(jù)其蛋白保守結(jié)構(gòu)域命名的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物中廣泛存在，通過調(diào)控花青苷合成途徑的一些結(jié)構(gòu)基因的表達，使花青苷在植物細胞中積累[33]。在bHLH結(jié)構(gòu)域的堿性氨基酸序列中，HER（His5-Glu9-Arg13）基序具有高度的保守性，可結(jié)合啟動子序列中的六核苷酸E-box基序，進而調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄。白菜BrTT8的表達量與花青苷積累程度保持一致，如在紅菜薹花青苷高度積累的組織中表達量較高，在無花青苷積累的紅菜薹組織和少花青苷積累的小白菜中的表達量較低。BrTI8的表達模式與ANS基因在紅菜薹花青苷合成過程中的表達模式相一致，表明BrTI8可能參與調(diào)控ANS基因的表達。

有些bHLH也對花青苷積累起抑制作用。如玉米INI（其編碼的蛋白與玉米bHLH部分同源）缺失突變體中，UFGT基因表達量和花青苷含量明顯提高。楊琳等[34]的研究表明，bHLH可能通過與bHLH蛋白形成異源二聚體或與無活性的MYB蛋白結(jié)合，又或者與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的下游靶基因直接結(jié)合干擾活性bHLH-MYB的形成或阻礙MYB復(fù)合物發(fā)揮激活功能而抑制花青苷合成。

2.3 WD40

WD40是一類含4～10個隨機WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)家族，該結(jié)構(gòu)域由總長約40個以色氨酸（W）和天冬氨酸（D）結(jié)尾的氨基酸序列組成。Wei Dong等[35]從甘薯分離得到的IbWD40基因的表達與不同甘薯品種的花青素積累呈正相關(guān);該基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗中表達上調(diào)并積累了花青苷，表明IbWD40在紫色肉質(zhì)甘薯花青苷生物合成的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。Yongfeng G等[36]發(fā)現(xiàn)，番茄SlAN11基因過表達時會抑制SlFLS的表達從而減少花青苷合成途徑中間產(chǎn)物黃酮醇或其糖基化衍生物的積累;還發(fā)現(xiàn)了SlAN11與bHLH蛋白互作（SlAN11不與MYB蛋白互作，而bHLH與MYB互作），并對番茄黃酮類化合物的合成和種子休眠具有重要的調(diào)控作用。

2.4 MBW

MBW（MYB-bHLH-WD40）轉(zhuǎn)錄復(fù)合物通常由R2R3-MYB、bHLH和WD40共同組成。R2R3-MYB通常需要與bHLH和WD40蛋白相互作用來充分發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控花青苷合成的功能，其R3內(nèi)的[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R基序能與bHLH 結(jié)合并互作;bHLH中也有與MYB結(jié)合的重要結(jié)構(gòu)域;而WD40則起著增強MBW復(fù)合體穩(wěn)定性的作用。王冠杰[37]通過酵母雙雜交試驗表明，蕪菁BrMYB75與BrTT8互作，并通過瞬時轉(zhuǎn)染煙草葉片表明BrMYB75與BrTT8協(xié)同調(diào)控蕪菁CHS基因的表達。Wenjun Huang等[38]的研究發(fā)現(xiàn)并證明了EsMYB1可以與幾個bHLH調(diào)控因子互作并激活DFR和ANS基因的表達，通過上調(diào)DFR和ANS基因的表達來實現(xiàn)對花青苷合成的調(diào)控。Yanjie Zhang等[39]的試驗表明，區(qū)域特異性組裝的功能性MBW（由BrTT8、SlAN2和SlAN11組成）蛋白復(fù)合物使Pro35S：BrTT8番茄果實在強光誘導下顯示不均勻的花青苷色素沉著。

2.5 其他調(diào)控因子

花青苷生物合成途徑會受到R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子和N / NO（3）（-）誘導的LBD（lateral organ boundary domain）轉(zhuǎn)錄因子家族的負調(diào)控。R3-MYB通過擾亂MBW復(fù)合物形成而抑制花青苷合成;Albert N W等[40]通過酵母三雜交試驗也證實了MYB激活因子和抑制因子可同時與相同的bHLH結(jié)合。擬南芥MBW轉(zhuǎn)錄激活物的復(fù)合物激活擬南芥同源域蛋白基因GLABRA2（GL2），促進毛狀體形成和抑制根毛形成;此MBW復(fù)合物還可以激活R3-MYB基因，被激活的R3-MYB通過與R2R3-MYB蛋白競爭結(jié)合bHLH蛋白而發(fā)揮負反饋作用，阻斷MBW復(fù)合物的形成[41]。LBD轉(zhuǎn)錄因子家族包括LBD37、LBD38和LBD39基因;當沒有N / NO（3）（-）存在時，3種LBD基因中的任意一個過表達都會強烈抑制擬南芥花青苷合成基因PAP1和PAP2的表達[42]。董慧杰等[43]研究表明，不結(jié)球白菜中花青苷負調(diào)控基因BrcLBD39與葉片中花青苷的積累密切相關(guān)，在花青苷的生物合成過程中起著重要的調(diào)控作用。

3 展 望

關(guān)于茄子、白菜、洋蔥、馬鈴薯等蔬菜花青苷生物合成及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究已經(jīng)取得了一些進展，克隆和鑒定出很多和花青苷合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因，但仍有很大的發(fā)展空間。與模式作物相比，參與蔬菜花青苷合成的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因可能更具復(fù)雜性和多變性。

且高通量測序技術(shù)、蛋白質(zhì)組學和代謝組學等多組學分析技術(shù)的發(fā)展也為蔬菜花青苷的研究提供了更多的思路和方法。此外，光、溫度等環(huán)境因素也影響了花青苷的形成。蔬菜花青苷的研究應(yīng)當緊密聯(lián)系實際，為分子改良富含高花青苷的新品種和改良蔬菜顏色等夯實遺傳基礎(chǔ);并通過分子設(shè)計育種的手段加速育種進程，培育高品質(zhì)、有特色的新品種，為研究相關(guān)蔬菜作物的花青苷合成分子機制提供重要的理論價值?？偠灾?，蔬菜花青苷生物合成途徑及其調(diào)控機制還需要不斷地探索和研究，以便充分發(fā)揮花青苷的食用功能，創(chuàng)造更大的價值。

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