李智杰，劉占悝，李健友，劉澤余，郭利※

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部經(jīng)濟動物疫病重點實驗室，長春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學，長春 130118）

數(shù)字PCR（Digital PCR）是于20 世紀由Vogelstein等[1]提出的用于核酸分子定量精密檢測的一種方法。它是將稀釋后的核酸模板分配到大量不同的反應單元中，使每個反應單元中有一個或沒有核酸。利用PCR擴增的同時，加入可檢測熒光。待擴增結束時，使用泊松分布統(tǒng)計學方法采集每個反應單元出現(xiàn)的熒光次數(shù)，從而定量檢測樣本中的核酸濃度。由于數(shù)字PCR采取先擴增后定量，因此不依賴于擴增曲線的循環(huán)閾值，也不需要制備標準曲線。具有準確度高、可以定量分析的優(yōu)點。

1 數(shù)字PCR原理

數(shù)字PCR 是PCR 擴增和熒光信號采集兩個部分先后交替進行。它的關鍵是模板的稀釋。通過將模板大量稀釋，盡可能使反應單元中只存在1 個或沒有模板，在每次PCR 擴增后，對每個反應單元進行熒光信號計數(shù)。出現(xiàn)熒光的反應單元計數(shù)為1，沒出現(xiàn)熒光信號的計數(shù)為0。理論上，每個反應單元中的模板數(shù)為1 個或0 個，但是實際操作中，很難做到這點，因此就需要應用泊松分布公式來計算樣本初濃度[1]。數(shù)字PCR 采用的是終點檢測熒光數(shù)量，不依賴擴增曲線的循環(huán)閾值，也不需要制備標準曲線，受PCR 擴增效率的影響較小，且對PCR 反應抑制物的耐受能力高，數(shù)據(jù)精密、準確[2]。

2 數(shù)字PCR的分類

數(shù)字PCR 從概念提出到商業(yè)化生產(chǎn)在短短幾十年間經(jīng)歷了飛速發(fā)展。根據(jù)分液方式的不同，數(shù)字PCR主要分為微孔板數(shù)字PCR、微滴數(shù)字PCR以及芯片數(shù)字PCR。最初，分配分子模板是在96/384 孔微孔板中進行[1，3]，面對復雜的樣品仍采用手動稀釋加樣方法，會帶來巨大加樣誤差。由于數(shù)字PCR 技術的準確程度取決于反映單元的總數(shù)，即反映單元數(shù)目越多，越有利于數(shù)字PCR 的準確度。因此，96/384 孔板也無法滿足反應需要。

隨著自動化系統(tǒng)水平日漸完善，在過去的10年中，不同公司正在探索不同的技術和方法來實現(xiàn)數(shù)字PCR 自動化。目前，可用的數(shù)字平臺在分液數(shù)量、液滴生成方法以及所需專用設備方面有所不同。BioMarkTMHD系統(tǒng)提供專用于數(shù)字集成流體回路（IFCs）的矩陣，可將樣品分配在多個單獨的反應室中；QuantStudio 3D系統(tǒng)采用硅芯片，該硅芯片由單個反應孔按一定順序排列組成，可使樣品按其矩陣進行分配；CONSTELLATION數(shù)字PCR 系統(tǒng)采用微孔板，通過利用密封的壓縮軸形成微管將樣本液體通道分離成單獨的微流體室；其他數(shù)字PCR 平臺，如QX200TMDropletDigitalTMPCR 和RainDropplusTM數(shù)字PCR 系統(tǒng)使用油包水乳化進行分區(qū)，水相由引物、探針或熒光染料組成并混合成超預混合物，樣品和礦物油則裝入專門設計的支架中，液滴發(fā)生器使用微流體產(chǎn)生壓力，將水相和油相吸入輸出通道，在此過程中形成液滴，每個液滴在特定的液滴讀取器中逐一讀取；來自Stilla TechnologieTM公司的Naica 系統(tǒng)就是結合了陣列和乳化這兩種方法，在這個系統(tǒng)中，樣品通過芯片的通道并在芯片內部形成液滴，成為較為理想的數(shù)字PCR 技術平臺。

3 數(shù)字PCR的檢測方法

與熒光定量PCR 相似，數(shù)字PCR 主要使用核酸分子染料和水解探針這兩種方式來檢測核酸[4]。這兩種檢測方法都會得到與核酸量成比例的熒光信號。核酸分子染料插入雙鏈DNA，并與雙鏈DNA 相互作用后，呈現(xiàn)激發(fā)態(tài)，產(chǎn)生強烈的熒光。核酸分子染料是非特異性的，無論DNA分子序列如何，都可以與其相互作用。相比之下，水解探針與序列結合是特異性的。熒光標記的寡核苷酸探針在與靶序列雜交后可以被DNA聚合酶的5'至3'端外切核酸酶切割，此時，位于寡核苷酸探針5'末端的熒光報告染料就被釋放并產(chǎn)生熒光信號。

4 數(shù)字PCR的風險與優(yōu)勢

4.1 假陽性

目前，所有的數(shù)字PCR平臺都會受到污染及其帶來的假陽性結果[5-10]。Kiselinova 等[8]在測定HIV-1RNA的陰性對照的3個孔中仍然檢測到陽性液滴（0.16～0.22拷貝/反應）。經(jīng)查證后發(fā)現(xiàn)，這些液滴與患者樣品中的真正陽性液滴具有相似的熒光強度。這些假陽性現(xiàn)象出現(xiàn)的原因仍不清楚，人們對此提出了各種假設。錯誤的陽性結果可能來自不良的檢測設計或由于PCR循環(huán)數(shù)量較多而檢測到其他非目的條帶。另外，假陽性液滴可能由污染物或混合在一起時的液滴產(chǎn)生，它們的相互作用形成具有較高亮度熒光液滴，導致假陽性熒光出現(xiàn)。

4.2 優(yōu)勢

除了假陽性問題之外，數(shù)字PCR在很多方面與熒光定量PCR 結果相同或更好。這兩種PCR 之間的主要區(qū)別是其對于測量靶序列數(shù)量的方法不同。在熒光定量PCR整個擴增過程中都有監(jiān)測反應，并且定量是基于指數(shù)階段熒光信號的分析。數(shù)字PCR 是通過終點測量收集熒光信號，并使用總量上的陽性分區(qū)數(shù)來倒推出目標濃度。數(shù)字PCR 不依賴于校準曲線進行樣品定量，避免了與反應效率變化相關的缺陷[11]。數(shù)字PCR是對核酸進行絕對定量的一種方法，依賴于終點熒光信號的檢測和兩點分布（反應中熒光的不存在或存在）[12]。用于執(zhí)行樣品分配以及單個分子擴增的數(shù)字PCR 理論上優(yōu)于熒光定量PCR。但實際上，在已經(jīng)發(fā)表的文章中顯示，熒光定量PCR平臺具有更高的敏感性，這可能與樣品量有關[13-14]。在連接目的DNA雙鏈的數(shù)字PCR 實驗中，觀察到少數(shù)分區(qū)，在2 個反應孔中只有1 個孔顯示擴增[15]。造成這種結果是因為DNA 連接酶和目標模板結合后的鈍性分離還是真正的擴增失敗，現(xiàn)在仍然不清楚。推測原因可能是存在特異性模板擴增抑制劑，模板降解或有三級結構。此外，如果真的不能擴增，目前還不清楚是否僅與使用數(shù)字PCR 有關，還是在熒光定量PCR 的情況下是也存在類似的機制。

5 數(shù)字PCR技術應用

數(shù)字PCR以其極高的靈敏度主要應用于疾病檢測診斷和微生物檢測分析上。

5.1 疾病診斷

Furuya D 等[16]使用QuantStudio 3D 數(shù)字PCR 檢測到Wilms tumor 1（WT1）因子在造血系統(tǒng)腫瘤中過表達。結果與實時熒光定量PCR 進行對比后發(fā)現(xiàn)，實驗結果相關性非常強（R=0.99）。但數(shù)字PCR 能夠準確檢測至更低的WT1 含量，可用于準確預測WT1/ABL1 的表達水平，因此，可用于診斷或評價白血病患者的藥物效率。

5.2 細菌活菌計數(shù)

使用平板計數(shù)來統(tǒng)計益生菌數(shù)量是目前較為普遍的細菌計數(shù)方法，但該方法實驗時間長，不能區(qū)分細菌菌株。Hansen SJZ 等[17]使用基于芯片的數(shù)字PCR 來檢測雙歧桿菌屬的亞種，利用不同基因序列設計引物和探針，使用單丙酰疊氮預處理以防止誤擴增死亡的益生菌DNA，使用玻璃珠震蕩破碎細菌，使DNA 從具有完整膜的細胞中釋放。該優(yōu)化的測定法都能成功地檢測每個菌株。芯片數(shù)字PCR 方法對于乳酸菌Bl-04 和嗜酸乳桿菌NCFM分別具有4%和5%的相對標準偏差，比平板計數(shù)更精確。由于其準確性、應變特異性和在數(shù)小時內就可以獲得結果的優(yōu)點，使得數(shù)字PCR 有可能取代傳統(tǒng)的平板計數(shù)。

5.3 噬菌體研究

目前，噬菌體的研究方法很少，原因是噬菌體可培養(yǎng)性的限制以及通用的基因標記的缺乏。Morella NM等[18]運用液滴數(shù)字PCR 檢測到丁香假單胞菌和針對其捕食的兩種噬菌體在使用培養(yǎng)基共培養(yǎng)和番茄感染過程中，隨時間推移，噬菌體跟蹤細菌過程和噬菌體的密度，比較噬菌體附著率，并探索噬菌體-噬菌體競爭動態(tài)。結果證明，液滴數(shù)字PCR 可研究菌體內、外細菌-噬菌體動力學。使用液滴數(shù)字PCR 方法與更傳統(tǒng)的噬菌斑形成單位（PFU）的計數(shù)結果相同，但使用數(shù)字PCR能更快得出結果，更低的浪費和更高通量的研究噬菌體與細菌相互作用的方式，使得數(shù)字PCR將成為噬菌體研究中的一種新的有價值的工具。

5.4 癌癥的早期研究

循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）是活腫瘤細胞釋放的DNA，半衰期約為1.5h。對循環(huán)腫瘤DNA 進行及時監(jiān)測分析，不僅有利于早期發(fā)現(xiàn)癌癥，還能監(jiān)測癌癥復發(fā)情況，這對癌癥患者的發(fā)病率和死亡率產(chǎn)生重大影響。與腫瘤組織活檢相比，血液循環(huán)腫瘤DNA 分析具有微創(chuàng)性，可以定期隨訪癌癥患者監(jiān)測癌癥。然而，使用ctDNA進行早期癌癥診斷也并不容易，因為血液中存在的腫瘤DNA 的量較少，并且腫瘤DNA 會被源自非腫瘤細胞的DNA 稀釋。基于液滴的數(shù)字PCR 等新技術的開發(fā)大大提高了檢測稀有序列的靈敏度、特異性和精確度，為癌癥的早期研究和診斷奠定基礎[19]。

6 展望

數(shù)字PCR 作為一種新興技術，與熒光定量PCR等定量分析的PCR技術相比，具有非常高的準確性和靈敏度。數(shù)字PCR 在核酸檢測定量、抗病毒治療監(jiān)測、預后判斷具有重要的意義。它的出現(xiàn)，為研究者提供新的檢測方法和實驗思路。但從實際操作角度來說，數(shù)字PCR 的實驗設備費用高昂、實驗操作復雜這些還不足以完全取代熒光定量PCR。此外，由于檢測癌癥或者腫瘤是依靠檢測血液中的癌癥標記物而進行的，但是癌癥或者腫瘤釋放的可用于檢測的生物標記物是隨機的，因此，如何選擇相應的標記物來預測癌癥還需要進行大量研究。其次，由于數(shù)字PCR 靈敏度非常高，對于診斷未知和復雜的案例可能會出現(xiàn)假陽性，因此，還需要結合案例的實際情況加以判斷。對于檢測稀有核酸種類樣本，可能存在抽樣偏差，導致待分析的目的基因片段未出現(xiàn)在取樣樣本中，從而導致假陰性出現(xiàn)。相信隨著數(shù)字PCR 技術的發(fā)展和商品化程度的提高，數(shù)字PCR 的診斷會更加正確，通量將會更高，成本更低，未來在科學研究領域將會發(fā)揮更重要的作用。