陳靜 魏增江 林卓立 廣東省藥品監(jiān)督管理局審評(píng)認(rèn)證中心 （廣東 廣州 510080）

內(nèi)容提要： 地中海貧血是我國(guó)長(zhǎng)江以南各省高發(fā)遺傳病之一，基因檢測(cè)是診斷金標(biāo)準(zhǔn)，文章從地中?；驒z測(cè)試劑質(zhì)量管理規(guī)范核查的角度進(jìn)行研究，旨在為現(xiàn)場(chǎng)檢查和審評(píng)提供參考，把控產(chǎn)品的安全性和有效性。

根據(jù)《6840體外診斷試劑分類(lèi)子目錄（2013版）》[4]，地中海貧血基因檢測(cè)試劑屬于三類(lèi)體外診斷試劑的范疇。根據(jù)《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》的規(guī)定，境內(nèi)第二類(lèi)、第三類(lèi)醫(yī)療器械注冊(cè)質(zhì)量管理體系核查，由省、自治區(qū)、直轄市食品藥品監(jiān)督管理部門(mén)開(kāi)展[5]。截止2019年2月，經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站查詢，廣東省地中海貧血基因檢測(cè)試劑有效期內(nèi)注冊(cè)證超過(guò)全國(guó)注冊(cè)證60%，廣東省對(duì)地貧基因檢測(cè)試劑質(zhì)量管理規(guī)范核查具有豐富經(jīng)驗(yàn)，本文就地貧基因檢測(cè)試劑質(zhì)量管理規(guī)范核查的主要問(wèn)題和重點(diǎn)關(guān)注事項(xiàng)進(jìn)行闡述，旨在為現(xiàn)場(chǎng)檢查和審評(píng)提供參考，規(guī)范行業(yè)發(fā)展，確保產(chǎn)品的安全性、有效性、可靠性[6,7]。

1.主要原材料

地中海貧血基因檢測(cè)試劑的主要原材料包含引物、探針、酶、dNTP、參考品等。具體如下。

1.1 引物和探針

著重關(guān)注引物和探針的設(shè)計(jì)原則，引物、探針核酸序列、模板核酸序列及二者的對(duì)應(yīng)情況。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)至少包括純度檢查、功能性試驗(yàn)等。如為外購(gòu)，應(yīng)包含合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明。如帶有熒光標(biāo)記物的探針，應(yīng)明確標(biāo)記的熒光基團(tuán)。

1.2 酶

地中海貧血基因檢測(cè)試劑主要包括DNA聚合酶，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)包括DNA聚合酶活性、熱啟動(dòng)能力、熱穩(wěn)定性，是否具有內(nèi)切或外切酶活性。如其他工具酶，應(yīng)包含質(zhì)檢證明和驗(yàn)證資料。

1.3 脫氧三磷酸核苷（dNTP）

包含dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括純度檢查及（或）功能性實(shí)驗(yàn)等。

1.4 產(chǎn)品研制所用參考品

參考品是產(chǎn)品性能溯源的根源，應(yīng)關(guān)注如下內(nèi)容：①陽(yáng)性參考品：包括全部缺失/突變類(lèi)型。臨床常見(jiàn)突變/缺失基因位點(diǎn)的陽(yáng)性參考品可使用含人類(lèi)基因組的臨床樣本或其核酸提取液，臨床少見(jiàn)的缺失/突變基因位點(diǎn)可使用細(xì)胞系或質(zhì)粒樣品。②陰性參考品：使用經(jīng)鑒定無(wú)相應(yīng)靶突變序列的質(zhì)粒樣品、含人類(lèi)基因組的臨床樣本或其核酸提取液。③檢測(cè)限參考品：參考陽(yáng)性參考品，需包含所有的突變類(lèi)型。④重復(fù)性參考品：使用臨床常見(jiàn)缺失/突變基因位點(diǎn)的質(zhì)粒、細(xì)胞系、臨床樣本核酸提取液等。

2.主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系

2.1 主要生產(chǎn)工藝

地中海貧血基因檢測(cè)試劑類(lèi)產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝主要包括PCR反應(yīng)液制備、質(zhì)控品制備、膜條和/或顯色相關(guān)配套試劑制備等，關(guān)鍵工序應(yīng)準(zhǔn)確識(shí)別，評(píng)價(jià)關(guān)鍵工藝參數(shù)需設(shè)置過(guò)程控制點(diǎn)。

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2.2 反應(yīng)體系重點(diǎn)關(guān)注

樣本用量、采集和處理方式等；引物/探針、酶、dNTP、緩沖離子的濃度和用量等；擴(kuò)增程序的確定；溫度、時(shí)間等關(guān)鍵參數(shù)的確認(rèn)。

3.性能評(píng)估

地貧基因檢測(cè)試劑的性能評(píng)估主要包括：準(zhǔn)確性、特異性、檢測(cè)限、重復(fù)性、核酸提取效率等。性能指標(biāo)和檢驗(yàn)方法應(yīng)符合YY/T 1527-2017《α/β-地中海貧血基因分型檢測(cè)試劑盒》的要求。

4.臨床試驗(yàn)

臨床試驗(yàn)符合《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》[5]和《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》[8]等法規(guī)的要求。

4.1 試驗(yàn)機(jī)構(gòu)

臨床試驗(yàn)選擇至少3家（含3家）國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械臨床試驗(yàn)備案的臨床機(jī)構(gòu)，同時(shí)出具醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)意見(jiàn)[9]。根據(jù)地中海貧血具有地域性的特性，應(yīng)綜合不同地區(qū)、民族等人群差異，以及流行病學(xué)背景，選擇具有一定地域代表性的試驗(yàn)機(jī)構(gòu)和受試者。

4.2 試驗(yàn)方法

地貧基因檢測(cè)試劑的臨床試驗(yàn)所選對(duì)比試劑在預(yù)期用途、適用人群、樣本類(lèi)型等方面應(yīng)與申報(bào)產(chǎn)品具有較好的可比性。性能指標(biāo)不低于對(duì)比產(chǎn)品。對(duì)檢測(cè)結(jié)果不相符的樣本，應(yīng)選擇合適的方法（如第三方試劑、臨床普遍認(rèn)為靈敏度和特異性較好的核酸序列測(cè)定方法等）進(jìn)行確證。

4.3 受試對(duì)象

明確納入/排除標(biāo)準(zhǔn)、樣本剔除標(biāo)準(zhǔn)等。例如，受試人群應(yīng)盡可能包含預(yù)期用途所聲稱的所有適用人群，不同區(qū)域、不同年齡段以及不同性別的受試者應(yīng)盡量均勻分布。

4.4 樣本量

臨床試驗(yàn)樣本量至少1000例。地中海貧血基因檢測(cè)試劑臨床試驗(yàn)的樣本量與多種因素相關(guān)，如檢測(cè)的可重復(fù)性、干擾因素、亞組間的差異性、地貧基因類(lèi)型的人群攜帶率等，需結(jié)合產(chǎn)品的具體情況進(jìn)行臨床驗(yàn)證，如有需要，建議細(xì)化各種亞組別/類(lèi)型樣本的例數(shù)要求。

4.5 臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

地貧基因檢測(cè)試劑一般為定性檢測(cè)，其臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)一般涉及：陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總符合率等。建議使用四格表卡方或kappa檢驗(yàn)進(jìn)行一致性分析。

5.采購(gòu)環(huán)節(jié)

采購(gòu)環(huán)節(jié)關(guān)注主要原材料的采購(gòu)，具有制定供應(yīng)商管理制度。包括與供應(yīng)商簽訂質(zhì)量協(xié)議；建立供應(yīng)商審核制度。主要原材料按批次進(jìn)行進(jìn)貨查驗(yàn)，記錄完整并確保整個(gè)過(guò)程具有可追溯性。

6.生產(chǎn)管理環(huán)節(jié)

人員：具備相關(guān)專(zhuān)業(yè)知識(shí)、工作技能，經(jīng)過(guò)培訓(xùn)并通過(guò)考核。

設(shè)備/器具：設(shè)備/器具應(yīng)在驗(yàn)證/校準(zhǔn)合格期內(nèi)，且與生產(chǎn)批量匹配，精準(zhǔn)度應(yīng)滿足要求，并在生產(chǎn)一定周期后進(jìn)行再確認(rèn)。生產(chǎn)過(guò)程中使用的移液器應(yīng)與生產(chǎn)批量相適應(yīng)，首選量程相近的微量移液器。

物料：生產(chǎn)時(shí)所使用的原材料應(yīng)與設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)輸出的原材料要求一致，且經(jīng)過(guò)驗(yàn)收/檢驗(yàn)。生產(chǎn)過(guò)程中主要原輔料應(yīng)物料平衡。

生產(chǎn)環(huán)境：地中海基因檢測(cè)試劑的生產(chǎn)和檢驗(yàn)應(yīng)當(dāng)在獨(dú)立空間內(nèi)進(jìn)行，防止擴(kuò)增時(shí)的氣溶膠造成交叉污染。其配制、分裝、點(diǎn)膜、干燥、切割以及內(nèi)包裝等生產(chǎn)區(qū)域滿足相應(yīng)的潔凈度級(jí)別[7]。

生產(chǎn)工藝：根據(jù)設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)輸出的生產(chǎn)工藝規(guī)程進(jìn)行生產(chǎn)，對(duì)于生產(chǎn)過(guò)程的關(guān)鍵控制點(diǎn)進(jìn)行監(jiān)控。

標(biāo)識(shí)：生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)對(duì)設(shè)備、產(chǎn)品及其檢驗(yàn)狀態(tài)作出標(biāo)識(shí)。

追溯：生產(chǎn)過(guò)程中持續(xù)保持相關(guān)記錄并符合可追溯性要求。

7.質(zhì)量控制環(huán)節(jié)

檢驗(yàn)要求：菌種的來(lái)源、驗(yàn)收、儲(chǔ)存、保管、使用、銷(xiāo)毀，應(yīng)執(zhí)行國(guó)家有關(guān)規(guī)定，菌種傳代應(yīng)有記錄，并具有可追溯性。

追溯：應(yīng)有批檢驗(yàn)記錄，并滿足可追溯要求。

不合格品控制：建立不合格品控制程序。

留樣：應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品和工藝特點(diǎn)制定留樣制度。

放行：應(yīng)按產(chǎn)品放行審核程序的要求對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行放行管理。

8.小結(jié)

基因診斷對(duì)于地貧確診是必須的，是高風(fēng)險(xiǎn)胎兒產(chǎn)前診斷的有效手段。為了保障地貧基因檢測(cè)試劑的安全性，有效性，本文從地貧基因檢測(cè)試劑質(zhì)量管理規(guī)范核查的角度出發(fā)，規(guī)范行業(yè)發(fā)展，也為檢查和審評(píng)提供參考。