，，

(大連海洋大學 海洋科技與環(huán)境學院，遼寧省近岸海洋環(huán)境科學與技術重點實驗室，遼寧 大連 116023)

多環(huán)芳烴(Polycyclic Armomatic Hydrocarbon，PAHs)作為持久性有機污染物質(zhì)的一類，不僅具有較強的致癌、致畸和致突變性，還具有免疫毒性，會擾亂生物體抗氧防御系統(tǒng)的正常功能[1]。海洋中的PAHs多來自海洋溢油、大氣沉降等，目前，隨著經(jīng)濟的發(fā)展海洋中的多環(huán)芳烴含量及對海洋生物的潛在危害越來越引起學者的重視[2]。修蒙[3]研究了PAHs在櫛孔扇貝Chlamysfarreri體內(nèi)蓄積特征與毒性效應；王靜[4]研究了菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum在苯并[a]芘脅迫下的毒性效應；許高鵬等[5]利用雙箱動力學模型研究了三疣梭子蟹Portunustrituberculatus體內(nèi)苯并[a]芘的富集動力學。這些學者為研究水生生物對多芳環(huán)烴的富集提供了一定的基礎。

蝦夷馬糞海膽Strongylocentrotusintermedius為中國北方地區(qū)具有極為重要經(jīng)濟價值和食用價值的經(jīng)濟動物[6]，隨著海洋環(huán)境污染加重，海膽對多環(huán)芳烴的生物富集成為影響海膽生長發(fā)育和威脅人體健康的重要因素。目前，國內(nèi)外對于多芳環(huán)烴在蝦夷馬糞海膽體內(nèi)富集過程的研究較少，由于3,4-苯并[a]芘(BaP)、9,10-二甲基蒽和3-甲基菲是中國海洋溢油優(yōu)先監(jiān)測的幾種PAHs，且在所有水產(chǎn)養(yǎng)殖海域監(jiān)測中均有發(fā)現(xiàn)，故本研究中選擇此3種PAHs作為研究對象，通過蝦夷馬糞海膽在3種不同濃度PAHs溶液中的暴露，應用雙箱模型對生物富集過程進行非線性擬合獲得海膽對3種PAHs的生物富集動力學參數(shù)，旨在為研究PAHs在棘皮動物體內(nèi)的富集機理及毒性風險評估提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用海水為取自大連市黑石礁海域，鹽度為30～31，pH為7.8～8.1，經(jīng)沙濾充分曝氣后使用。試驗用蝦夷馬糞海膽苗殼直徑為(2.0±0.3)cm，購自大連太平洋海珍品有限公司，于實驗室海水養(yǎng)殖循環(huán)系統(tǒng)中暫養(yǎng)一周后，選取健康的海膽用于試驗。

試驗儀器：氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC6890N/MSD5975B，Agilent Co.USA)，加速溶劑提取儀(ASE350，Dionex Co.，USA)，Heidolph旋轉蒸發(fā)儀(Hei-VAP，德國)。

試驗試劑：正己烷、二氯甲烷、丙酮等均為農(nóng)殘級，購自TEDIA公司；硅膠(0.100 mm)購自Merck公司；弗羅里硅土(Florsil，60-100目)購自美國Floridin公司；內(nèi)標(替代內(nèi)標Z-014J中含菲-d10和芘-d12，進樣內(nèi)標為三聯(lián)苯-d14)購自Wellington公司；3,4-苯并[a]芘(BaP)、9,10-二甲基蒽和3-甲基菲購自Sigma公司(Sigma-Aldrich Corporation，USA)，純度分別大于99%、97%和98%，使用時用丙酮作為助溶劑將3種PAHs配制成一定濃度的母液。

1.2 方法

1.2.1 生物蓄積試驗 通過96 h急性毒性試驗，3,4-苯并[a]芘(以下簡寫為苯并[a]芘)、9,10-二甲基蒽和3-甲基菲3種PAHs對蝦夷馬糞海膽的半致死濃度(LC50)分別為132.3、578.7、723.3 μg/L。以此為依據(jù)設置3種PAHs的生物蓄積試驗所需的濃度。設置苯并[a]芘濃度分別為1、5、20 μg/L，9,10-二甲基蒽的濃度分別為5、10、50 μg/L，3-甲基菲濃度分別為5、10、100 μg/L。另外，設置1組海水對照組和1組丙酮對照組，丙酮濃度為所加入所有體系最大量的0.01%，每組設置3個重復，每個重復中放入海膽10只。試驗期間持續(xù)充氧，使水中溶解氧濃度保持在6 mg/L以上，試驗水溫為18～20 ℃，每天定時投喂1次鮮海帶，投喂量為體質(zhì)量(以第一次稱重為準)的1.5%。以此時為時間起始點，每天換1次新鮮海水，投加相應的污染物至所設置的濃度。試驗進行到第3、7、14天時取樣，每次從每個處理組取海膽3只，用錫箔紙包裹，放入冰箱(-80 ℃)中保存待測。

1.2.2 樣品處理 全量稱取冷凍干燥后的生物樣品，加入無水硫酸鈉和氘代回收率指示物 (Z-014J，10.0 μg/mL)用來控制樣品前處理目標化合物的回收率，用100 mL正己烷和丙酮混合溶液(體積比為1∶1)進行加速溶劑萃取，萃取溫度為100 ℃，加熱時間為5 min，靜止時間為10 min，循環(huán)3次，吹掃時間為60 s。樣品提取液過無水硫酸鈉小柱，加入鹽酸處理過的銅粉進行除硫：生物樣品提取液直接轉入潔凈的燒瓶中，加入一定量(視有機相的透明度而定)的酸性硅膠，磁力攪拌約0.5 h。去除脂肪等大分子雜質(zhì)并將萃取液濃縮至2.0 mL左右，濃縮液過佛羅里土(5.0 g)與硅膠(8.0 g)復合柱凈化，用50 mL正己烷預淋洗，用80 mL正己烷/二氯甲烷(體積比為1∶1)淋洗，接取淋洗液濃縮定容至200 μL，添加1 μL進樣內(nèi)標(三聯(lián)苯-d14，10.0 μg/mL)。上機測定，加入內(nèi)標的作用是為了消除系統(tǒng)誤差及定量目標化合物。樣品采用DB-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)進行氣相分離，采用EI源電離方式進行質(zhì)譜檢測。色譜柱升溫程序為：50 ℃開始，不停留；以4 ℃/min升溫到220 ℃，停留3 min；以10 ℃/min升溫到300 ℃，停留9 min。載氣(氦氣)流速為1.0 mL/min，恒流，進樣口溫度為280 ℃，無分流進樣，進樣量為1 μL；傳輸線溫度為290 ℃，四極桿溫度為150 ℃，離子源溫度為230 ℃，離子掃描為SIM模式。

所有樣品和空白中替代內(nèi)標苯并[a]芘、9,10-二甲基蒽和3-甲基菲的回收率分別為79.7%～93.4%、65.5%～88.3%和71.2%～83.9%，相對標準偏差分別為8.9%、6.7%和7.3%，每個樣品設3個平行測試。空白試驗結果顯示，所有目標物低于方法檢測限，本研究中給出的數(shù)據(jù)均已經(jīng)過回收率校準。

(1) 雙箱動力學模型。雙箱動力學模型是在近幾年發(fā)展起來的一類數(shù)學模型，主要用于重金屬、有機污染物的生物富集研究[7-8]，能較好地描述污染物在水體與生物體間的作用過程，并能模擬出達到生物富集平衡情況下的動力學參數(shù)(圖1)。

圖1 生物富集雙箱動力學模型Fig.1 Two-compartment kinectic model of bioconcentration

雙箱動力學模型生物富集公式為

(1)

其中:CA為生物體中PAHs濃度(ng/g)；C0為試驗開始前生物體內(nèi)PAHs濃度(ng/g)；K1為吸收速率常數(shù)；K2為釋放速率常數(shù)；CW為水體中PAHs濃度(μg/L)；t*為富集時間(d)。由方程(1)進行非線性擬合可得到K1、K2。

理論平衡狀態(tài)下，富集系數(shù)(BCF)和生物半衰期(t1/2)計算公式為

(2)

(3)

當富集達到平衡時，生物體內(nèi)最大PAHs含量(Cmax)計算公式為

Cmax=BCF×CW。

(4)

(2) 模型的擬合優(yōu)度檢驗。應用MatLab2014A對數(shù)據(jù)進行非線性擬合，結合判定系數(shù)R2來評價該模型的擬合優(yōu)度，并采用F檢驗對模型整體的顯著性進行檢驗，以此驗證雙箱模型用于海膽對PAHs的生物富集研究的可行性。

2 結果與分析

2.1 海膽對苯并[a]芘的生物蓄積

PAHs在3 d、7 d和14 d時的生物富集動力學參數(shù)見表1。從圖2和表1可見，對照組和丙酮對照組檢測出少量的苯并[a]芘，由于對照組并未加入該污染物，故可以判定對照組中的苯并[a]芘來自環(huán)境本底值。隨著苯并[a]芘濃度的升高，苯并[a]芘在海膽體內(nèi)的蓄積量明顯增加。隨著暴露時間的延長，苯并[a]芘在海膽體內(nèi)的蓄積量也有所增長，說明海膽體內(nèi)只有少部分苯并[a]芘代謝出體外，隨暴露時間的延長，海膽體內(nèi)的蓄積量越來越多。在1 μg/L苯并[a]芘濃度條件下，雖然符合雙箱動力學模型，但其K1值達到129.7，明顯大于其他濃度的K1值，可能是由于此濃度過低，海膽蓄積毒物的時間到達第14天時，海水中苯并[a]芘含量較少，使海膽蓄積毒物受到濃度限制，因此，低濃度下K1值不太準確。而在5、20 μg/L濃度條件下，海膽的苯并[a]芘蓄積量明顯增加，完全符合雙箱動力學模型，K1分別為25.93和21.68，K2分別為0.083和0.291，R2分別為0.986和0.960(95%置信區(qū)間)。苯并[a]芘作為一種強致癌多環(huán)芳烴，具有較強的脂溶性，可以通過呼吸、體表滲透和食物鏈等多種途徑進入海洋生物體內(nèi)。被吸收的苯并[a]芘迅速溶入脂肪，由于其性質(zhì)穩(wěn)定，難以被生物分解代謝，因此，苯并[a]芘在生物體內(nèi)富集系數(shù)較高。本研究中發(fā)現(xiàn)，水體中的苯并[a]芘在海膽體內(nèi)富集量可以達到1.530 μg/g(濃度為20 μg/L，14 d)，富集系數(shù)BCF最高為230.0(濃度為1 μg/L，14 d)。

注：標有不同字母者表示同一濃度下不同時間組有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同Note: The means with different letters in the same concentration are significant differences in different time group at the 0.05 probability level, and the means with the same letters are not significant differences, et sequentia圖2 海膽對不同濃度苯并[a]芘的生物蓄積Fig.2 Bioaccumulation of different concentrations of benzo [a] pyrene in sea urchins

2.2 海膽對9,10-二甲基蒽的生物蓄積

從圖3和表1可見，在5 μg/L 9,10-二甲基蒽濃度下，海膽對9,10-二甲基蒽的富集量第7天與第14天間無顯著性差異(P>0.05)，說明海膽對9,10-二甲基蒽富集在第7天時達到了平衡。在5 μg/L 9,10-二甲基蒽濃度下，海膽符合雙箱動力學模型，K1=9.93，K2=0.088，R2=0.907(95%置信區(qū)間)。在10 μg/L濃度下，隨著9,10-二甲基蒽濃度的升高，9,10-二甲基蒽在海膽體內(nèi)的蓄積量明顯增加；第14 天時，9,10-二甲基蒽10 μg/L濃度組的富集系數(shù)明顯高于其他兩個濃度組；其雙箱動力學模型參數(shù)分別為K1=14.05，K2=0.071，R2=0.913(95%置信區(qū)間)。在50 μg/L濃度下，海膽體內(nèi)的9,10-二甲基蒽隨著暴露時間的延長蓄積量也有所增長，此濃度下K1=12.88，K2=0.524，R2=0.892(95%置信區(qū)間)。

2.3 海膽對3-甲基菲的生物蓄積

從圖4和表1可見：在5 μg/L 3-甲基菲濃度下，雙箱動力學模型參數(shù)K1=12.76，K2=0.063，R2=0.869(95%置信區(qū)間)；在10 μg/L濃度下，3-甲基菲在海膽體內(nèi)的蓄積量明顯增加，但此條件下，K2=-0.033為負值，并不符合雙箱動力學模型；在高濃度100 μg/L條件下，海膽體內(nèi)的3-甲基菲隨著暴露時間的延長蓄積量迅速增加，富集系數(shù)在第7天時已達到116.4，第14天時富集系數(shù)趨于穩(wěn)定。綜上得出，海膽在低濃度5 μg/L和高濃度100 μg/L時符合雙箱動力學模型。

圖3 海膽對不同濃度9,10-二甲基蒽的生物蓄積Fig.3 Bioaccumulation of different concentrations of 9,10-dimethyl anthracene in sea urchin

圖4 海膽對不同濃度3-甲基菲的生物蓄積Fig.4 Bioaccumulation of different concentrations of 3-methyl phenanthrene in sea urchin

Tab.1BioaccumulationkineticparametersandenrichmentfactorsinseaurchinexposedtothreePAHsin3,7dand14d

PAH濃度/(μg·L-1)concentrationK1K2自由度 dfR23 d BCF7 d BCF14 d BCFCmax/(μg·g-1)t1/2/d苯并[a]芘benzo[a]pyrene1129.70.08330.986198.9172.8230.00.2308.35525.930.08330.98666.5153.0220.01.1008.352021.680.29130.96047.263.276.51.5302.38平均值59.100.150104.2129.6175.50.9536.369,10-二甲基蒽9,10-dimethyl anthracene59.930.08830.90722.567.284.00.4207.881014.050.07130.91325.093.8124.01.2409.765012.880.52430.89220.423.626.01.3001.32平均值12.290.22822.661.578.00.9876.323-甲基菲3-methyl phenanthrene512.760.06330.86927.6102.2128.40.64211.0010——3—18.881.1153.61.536—10023.560.16330.86140.3116.4124.512.4504.25平均值18.160.11328.999.9135.54.8767.60

注：-表示無雙箱模型擬合數(shù)據(jù)

Note：-means no data

3 討論

3.1 海膽對3種多環(huán)芳烴的生物蓄積機理

海膽是大連地區(qū)擁有高經(jīng)濟價值和食用價值的海洋生物之一，而PAHs又是一種典型的持續(xù)性有機污染物，一旦PAHs通過各種途徑進入水生生物體內(nèi)，易積累于生物脂肪中，通過不斷的累積形成生物富集，對生物體造成巨大的傷害[9]。苯并[a]芘、9,10-二甲基蒽、3-甲基菲是3種典型的多環(huán)芳烴，也是中國優(yōu)先監(jiān)測的多環(huán)芳烴。本研究結果表明，海膽能夠從暴露溶液中快速吸收苯并[a]芘、9,10-二甲基蒽、3-甲基菲，第14 天時這3種PAHs最大濃度組蓄積量分別達到1.530、1.300、12.450 μg/g。同時，隨著PAHs濃度的升高，海膽對3種PAHs生物富集量迅速增加，呈現(xiàn)指數(shù)增長趨勢。低濃度(1、5、5 μg/L)條件下，海膽對3種PAHs富集需要在第14天時達到富集平衡，而在高濃度條件下(20、50、100 μg/L)需要在7天時達到吸收平衡。其原因有二：一是海膽剛暴露在3種多環(huán)芳烴水溶液中，環(huán)境水相中的PAHs迅速分配到脂質(zhì)中，故初期富集量迅速增加，而后由于3種PAHs在環(huán)境水相-脂質(zhì)相之間的分配逐漸達到平衡，因此，在低濃度條件下達到平衡需要時間較長(14 d)，而在高濃度條件下達到平衡需要的時間較短(7 d)；其次，PAHs有較高的正辛醇/水分配系數(shù)，水溶性差，具有良好的脂溶性，同時低分子量PAHs比高分子量PAHs脂溶性高，而本試驗中使用了丙酮作為助溶劑，使得3種PAHs水溶性發(fā)生改變，提高了其生物可利用性。

3.2 海膽與其他水生生物對多環(huán)芳烴的生物蓄積

本研究表明，海膽對3種PAHs的生物富集遠比排除系數(shù)要高，因此，在14 d內(nèi)主要表現(xiàn)為生物富集，如果進行生物排除試驗研究可以進一步分析討論對3種PAHs的代謝過程。這與其他學者的研究結果類似，如李天云[10]研究了河蜆Corbiculafluminea對太湖梅梁灣沉積物中PAHs的富集過程，發(fā)現(xiàn)河蜆對PAHs的生物-沉積物生物富集因子(BSAF)為0.09～0.44，其中含量最多的4種PAHs依次為芘、萘、菲和熒蒽。水生動物中，除貝類外，其他無脊椎動物(如甲殼類)雖然對PAHs有一定的代謝消除能力，但代謝速率較低，因此，其對PAHs具有很高的濃縮系數(shù)[11-16]。如李磊等[17]研究了苯并[a]芘、菲在縊蟶體內(nèi)的生物富集與釋放過程，發(fā)現(xiàn)苯并[a]芘、菲在縊蟶體內(nèi)有較強的富集能力，富集過程符合雙箱動力學模型。水生脊椎動物魚類由于其代謝系統(tǒng)相對完善，其對PAHs的代謝消除能力較強，PAHs在魚體內(nèi)的殘留量通常較無脊椎動物低，Baussant等[7，18]研究了比目魚Scophthalmusmaximus幼魚和貽貝Mytilmsedulis對PAHs的積累，結果顯示，在原油中暴露一段時間后，貽貝體內(nèi)PAHs與原油中更相近，而比目魚幼魚體內(nèi)多芳環(huán)烴復雜，且放清水一段時間后，幼魚體內(nèi)多芳環(huán)烴含量明顯減少。但也有報道顯示，PAHs在魚體內(nèi)有較高的富集系數(shù)BCF，如朱必鳳等[19]在其研究中，通過放射性同位素示蹤的方法發(fā)現(xiàn)鯽Carassiusauratus對PAHs的富集系數(shù)達到1600。本試驗中由于使用了丙酮作為助溶劑大大提高了3種PAHs的水溶性，因此，生物富集能力可能得到了進一步加強。海膽與其他水生生物相比(表2)，對PAHs的富集能力依次為三疣梭子蟹>棱鯔>圓海鰺≈蝦夷馬糞海膽>花鱸>河蜆。海膽對PAHs的富集系數(shù)為18.8～230.0，雖不屬于對多芳環(huán)烴具有強富集能力的生物，但可預測海膽體內(nèi)沒有或者只有少量代謝途徑，屬于低富集能力、低代謝能力的生物，且海膽對于多芳環(huán)烴的富集系數(shù)隨時間和濃度呈指數(shù)增長。由此推斷，對于低濃度多芳環(huán)烴污染海域，海膽受其影響可能并不嚴重。但如果是高濃度多芳環(huán)烴污染海域，海膽富集能力增強，且難以代謝，會造成十分嚴重的后果。

表2 不同水產(chǎn)動物對PAHs的生物富集系數(shù)比較Tab.2 Bioconcentration factor comparison of various aquatic animals for PAHs