，、，，，，，

(1.大連海洋大學(xué) 遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；2.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

1962年，Wolf等[1]第一次成功建立了虹鱒Oncorhynchusmykiss生殖腺細(xì)胞系RTG-2后，越來(lái)越多的魚類細(xì)胞系被建立。其中利用鰭組織建立的細(xì)胞系約為36種，如西伯利亞鱘AcipenserbaeriBrandt[2]、泥鰍Misgurnusanguilicaudatus[3]、稀有鮈鯽Gobiocyprisrarus[4]、斜帶石斑魚Epinepheluscoioides[5]等。細(xì)胞系作為一個(gè)研究平臺(tái)在免疫學(xué)、病毒學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)等方面有著成本低、試驗(yàn)條件可精確控制、試驗(yàn)效果直觀等多種優(yōu)點(diǎn)[6]。

紅鰭東方鲀Takifugurubripes隸屬于鲀形目tetraodontiformers、鲀亞科Tetraodontoidei、鲀科Tetxaodontidae、東方鲀屬Takifugu，是重要的經(jīng)濟(jì)魚類之一[7]。近年來(lái)，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，疾病時(shí)有發(fā)生，尤其是病毒病，已經(jīng)給所屬產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。迄今報(bào)道的魚類病毒已經(jīng)超過(guò)70余種，分別屬于18個(gè)不同的科[8]。與紅鰭東方鲀相關(guān)的病毒有淋巴囊腫病毒(Lymphocystis disease virus, LCDV)、傳染性造血器官壞死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus)、神經(jīng)壞死病毒(Nervous necrosis virus,NNV)、雙鏈DNA棒狀病毒(ds DNA baculovirus)、野田病毒(Nodamura virus)、敗血癥病毒(Viral hemorrhagic septice-mia virus)和白口病病毒(即紅鰭東方鲀吻唇潰爛病毒，Takifugu rubripes snout ulcer virus，TSUV)等。病毒病的研究必須依賴于對(duì)該病毒具有易感性的細(xì)胞。目前，已建立的紅鰭東方鲀細(xì)胞系只有精巢細(xì)胞系，尚未見到其他組織細(xì)胞系建立的報(bào)道。細(xì)胞系的匱乏，極大地限制了紅鰭東方鲀病毒病的診斷與治療，為此，急需其他組織細(xì)胞系的建立來(lái)填補(bǔ)這一空白。本試驗(yàn)中，建立了紅鰭東方鲀鰭細(xì)胞系，旨在為研究該魚病毒的感染機(jī)理、感染途徑、病毒的體外培養(yǎng)和疫苗的研發(fā)制備提供基礎(chǔ)條件。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用紅鰭東方鲀采自大連市天正養(yǎng)魚場(chǎng)，3齡，體長(zhǎng)為11 cm。紅鰭東方鲀運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后在水槽(90 L)中暫養(yǎng)。

試驗(yàn)試劑：0.25%胰蛋白酶溶液、1000 IU/mL和500 IU/mL的青霉素-鏈霉素雙抗溶液均購(gòu)于Hyclone公司；硫酸軟骨素購(gòu)于Wolsen公司；人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和I 型胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I)購(gòu)于Peprotech公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。試驗(yàn)所用的PCR擴(kuò)增引物購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司，基因組DNA提取試劑盒購(gòu)于大連賽拓生物公司。

1.2 方法

1.2.1 原代培養(yǎng) 參考李霞等[3]的原代啟動(dòng)試驗(yàn)方法。將紅鰭東方鲀放入含0.2% 1000 IU/mL青鏈霉素混合液的新鮮海水中暫養(yǎng)3 h，然后用0.1%的苯甲醇和濃度為0.2%的1000 IU/mL青鏈霉素混合液進(jìn)行麻醉處理，并用75%的乙醇擦拭尾鰭和臀鰭組織。剪取尾鰭和臀鰭鰭末端組織，放入500 IU/mL的青霉素-鏈霉素雙抗溶液中消毒處理60 min, 中間換液1次。用pH值為7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗兩次，再用5%胎牛血清培養(yǎng)液漂洗1次，然后加入0.25%的透明質(zhì)酸酶液和0.1%的Ⅱ型膠原蛋白酶溶液處理30 min；將鰭組織塊剪成1 mm3左右的小塊，均勻涂布到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶20～30個(gè)。倒置24 h之后，翻轉(zhuǎn)并補(bǔ)加培養(yǎng)基至5 mL/瓶。所用培養(yǎng)液為添加bFGF(40 μL/mL)、硫酸軟骨素(10 μg/mL)和 IGF-I(10 μL/mL)的20% FBS-DMEM/F-12 高糖培養(yǎng)基。5～6 d后組織塊中有細(xì)胞遷出，當(dāng)遷出細(xì)胞鋪滿單層培養(yǎng)瓶底時(shí)開始進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 傳代培養(yǎng) 加入PBS漂洗細(xì)胞1次；吸去PBS加入1 mL的胰蛋白酶溶液，約1 min之后，吸掉胰蛋白酶。加入原培養(yǎng)基，吹打。待細(xì)胞脫離培養(yǎng)瓶底部后吸出一半懸液至新培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加新培養(yǎng)基至5 mL/瓶，置于同樣的25 ℃、5% CO2濃度細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所用培養(yǎng)液為20% 胎牛血清DMEM/F12 培養(yǎng)基，添加有硫酸軟骨素(10 μg/mL)、bFGF(10 ng/mL)等生長(zhǎng)因子。 30代以后所用培養(yǎng)液為添加20% 胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基。

1.2.3 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇 參考李霞等[3]的方法。細(xì)胞凍存液為20% FBS、60% DMEM/F-12培養(yǎng)基和20%二甲基亞砜混合溶液，存于 4 ℃冰箱中。取 35代細(xì)胞，以1000 r/min 離心 5 min, 棄上清液, 向沉淀中加入 1 mL 細(xì)胞凍存液，輕輕吹打制成細(xì)胞懸液, 調(diào)整細(xì)胞濃度至 1.0×106cells/mL, 再轉(zhuǎn)至凍存管中。先在4 ℃下存放30 min、-20 ℃下存放2 h，然后于-80 ℃下長(zhǎng)期保存，或24 h后放入液氮(-196 ℃)中長(zhǎng)期保存。

60 d后，將液氮中的細(xì)胞凍存管取出，迅速放入37 ℃水中，水浴解凍，當(dāng)細(xì)胞凍存液融化約2/3后轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)。吸取全部細(xì)胞凍存液置于離心管中，加入等量的 20% FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基，以1000 r/min離心5 min，棄上清液，加入20% FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞充分懸浮。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入新細(xì)胞培養(yǎng)瓶，補(bǔ)加培養(yǎng)基至5 mL/瓶。同時(shí)取100 μL細(xì)胞懸液于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再加入等量臺(tái)盼藍(lán)染液，在顯微鏡下使用血球計(jì)數(shù)板，觀察活細(xì)胞數(shù)量并計(jì)數(shù)，通過(guò)公式計(jì)算細(xì)胞存活率，即

細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.4 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 取生長(zhǎng)狀況良好的37代紅鰭東方鲀鰭細(xì)胞，用胰蛋白酶進(jìn)行消化后制成細(xì)胞懸液。以6.4×104cells/mL的細(xì)胞密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，體積為1 mL，共21個(gè)孔。將培養(yǎng)板置于25 ℃、 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7 d。每隔24 h取3孔細(xì)胞，在顯微鏡下觀察活細(xì)胞，并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，取其平均值，以培養(yǎng)時(shí)間(d)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)量(104cells/mL)為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。參考戴國(guó)俊等[9]的方法，采用SPSS 19.0軟件，將數(shù)據(jù)代入Logistic曲線模型表達(dá)式Nt=A/[1+B×exp(-K×t)]中進(jìn)行擬合，生成生長(zhǎng)曲線公式與相應(yīng)方差。

1.2.5 細(xì)胞大小測(cè)定 選用紅鰭東方鲀35代生長(zhǎng)狀況良好的鰭細(xì)胞，用0.25%的胰酶溶液消化1 min左右，形成細(xì)胞懸液，取100 μL細(xì)胞懸液至青霉素小瓶中。加入等量臺(tái)盼藍(lán)染液，在校正好的目鏡測(cè)微尺的倒置顯微鏡下，測(cè)量100個(gè)圓形活細(xì)胞的直徑，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

1.2.6 細(xì)胞親緣關(guān)系分析 選用紅鰭東方鲀37代生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞作為試驗(yàn)組，以紅鰭東方鲀成體魚鰭組織與鯽Carassiusauratus鰭組織作為對(duì)照組。在超凈工作臺(tái)內(nèi)將紅鰭東方鲀與鯽解剖，分別提取出其鰭組織放入離心管中，加入胰蛋白酶將組織消化為細(xì)胞懸液。之后按照TIANGEN公司的提取DNA試劑盒步驟對(duì)紅鰭東方鲀鰭細(xì)胞系細(xì)胞、紅鰭東方鲀成體魚鰭組織、鯽鰭組織進(jìn)行處理，提取出各自完整的DNA。

PCR引物的制備：參考郝君等[10]的方法，設(shè)計(jì)4對(duì)引物，其退火溫度均為56 ℃(表1)。

微衛(wèi)星位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增：建立了體積為25 μL的反應(yīng)體系，內(nèi)含約50 ng基因組DNA，1 ng/μL引物，1 U Taq DNA聚合酶，18 μL PCR緩沖液。在PE9700型擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃下變性30 s，56 ℃下退火30 s，72 ℃下反應(yīng)30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；再于72 ℃下延伸7 min。

最后將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)含有1% goodview的10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外投射儀下觀察結(jié)果并拍照。

表1 微衛(wèi)星引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 原代培養(yǎng)

將紅鰭東方鲀鰭組織培養(yǎng)3～4 d后，大量的細(xì)胞從組織塊中遷出，可以觀察到明顯的生長(zhǎng)暈(圖1-A)。遷出的細(xì)胞成纖維樣，多突起且貼壁生長(zhǎng)，生長(zhǎng)分裂旺盛(圖1-B)。 6～7 d 后，組織塊周圍形成單層, 培養(yǎng)30 d左右鋪滿培養(yǎng)瓶底部。

2.2 傳代培養(yǎng)及細(xì)胞系的建立

紅鰭東方鲀鰭細(xì)胞系細(xì)胞在傳代后6～7 d可鋪滿培養(yǎng)瓶底部。細(xì)胞透明、均質(zhì)，生長(zhǎng)狀況良好，成纖維細(xì)胞樣。30 代以后停止添加I 型胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I)、人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和硫酸軟骨素等生長(zhǎng)因子, 細(xì)胞生長(zhǎng)及分裂狀況仍然良好(圖2)。目前, 紅鰭東方鲀鰭細(xì)胞系已傳代至40代，成功建立了紅鰭東方鲀鰭組織細(xì)胞系。

2.3 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

在液氮中貯藏60 d的紅鰭東方鲀鰭細(xì)胞凍存復(fù)蘇后，大部分細(xì)胞呈梭形或纖維型，貼壁較好，6～7 d可以長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部。細(xì)胞凍存復(fù)蘇的存活率為84.20%±2.20%。置于超低溫冰箱(-80 ℃)中的紅鰭東方鲀細(xì)胞凍存復(fù)蘇后，情況相似，細(xì)胞形態(tài)未有明顯變化，存活率約為83.22%±4.18%。

注：A為細(xì)胞生長(zhǎng)暈；B為遷出細(xì)胞成纖維樣Note:A,growth halo is appeared;B,cells are fibroblastoid圖1 原代培養(yǎng)第5天時(shí)的紅鰭東方鲀鰭細(xì)胞Fig.1 Fin cells of redfin puffer Takifugu rubripes in primary culture at the fifth day

圖2 紅鰭東方鲀37代鰭組織細(xì)胞Fig.2 Fin cells in the 37 generations of redfin puffer Takifugu rubripes

2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

從第37代紅鰭東方鲀鰭細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(圖3)可知，培養(yǎng)于25 ℃、CO2濃度為5%、20%FBS-DMEM/F12高糖培養(yǎng)基中的紅鰭東方鲀鰭細(xì)胞在0～2 d內(nèi)處于潛伏期，2～4 d時(shí)進(jìn)入對(duì)指數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞處于生長(zhǎng)高峰，4～5 d時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期，5 d后轉(zhuǎn)入衰退期，細(xì)胞數(shù)量開始減少。群體倍增時(shí)間約為50.24 h。

由SPSS 19.0軟件輸出結(jié)果可見，曲線擬合的相關(guān)指數(shù) (即擬合度，R2)為

生長(zhǎng)曲線為

圖3 紅鰭東方鲀鰭細(xì)胞37代生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of fin cells in the 37 generations of redfin puffer Takifugu rubripes

2.5 細(xì)胞來(lái)源鑒定

本試驗(yàn)中擴(kuò)增了4對(duì)引物，但是所選用的第1對(duì)微衛(wèi)星引物能擴(kuò)增出效果較好的PCR產(chǎn)物。其他兩條未有明顯條帶。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖4)顯示，本研究中所建立的紅鰭東方鲀鰭細(xì)胞系與紅鰭東方鲀鰭組織電泳結(jié)果清晰，在500～750 bp位置有相同條帶，而鯽鰭組織在此位置并無(wú)條帶產(chǎn)生，說(shuō)明紅鰭東方鲀鰭細(xì)胞與紅鰭東方鲀鰭組織為同一物種，具有相同的微衛(wèi)星位點(diǎn)。

3 討論

3.1 紅鰭東方鲀細(xì)胞系建立方法

用于海水魚類細(xì)胞培養(yǎng)使用的人工合成培養(yǎng)基主要有MEM、 L-15、DMEM/F12、DMEM、Medium 199等。建立線鱧Channastriatus肌肉細(xì)胞系[11]、遮目魚Chanoschanos胚胎細(xì)胞系[5]、斜帶石斑魚Epinepheluscoioides眼細(xì)胞系[5]、紅點(diǎn)石斑魚Epinephelusakaara脾臟細(xì)胞系[12]時(shí)，均使用了L-15培養(yǎng)基。而半滑舌鰨Cynoglossussemilaevis心臟細(xì)胞系[13]的建立采用的培養(yǎng)基則為MEM。本試驗(yàn)中利用的是DMEM/F-12高糖培養(yǎng)基，與Chen等[14]建立的大菱鲆Scophthalmusmaximus胚胎細(xì)胞系，Holen等[15]建立的大西洋鱈Gadusmorhua胚胎細(xì)胞系，Sha等[16]建立的半滑舌鰨胚胎細(xì)胞系所用培養(yǎng)基相同。說(shuō)明不同的魚類細(xì)胞系對(duì)培養(yǎng)基的要求有所不同。

注：M為DL2000 Marker;1為紅鰭東方鲀細(xì)胞樣品；2為紅鰭東方鲀鰭組織樣品；3為鯽鰭組織樣品Note:M,DL2000 Marker;1,redfin puffer fin cell sample; 2,redfin puffer fin tissue sample; 3,crucian carp fin tissue sample圖4 紅鰭東方鲀鰭細(xì)胞與鰭組織及鯽鰭組織PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of amplified PCR of fin cells, and fin tissue in redfin puffer Takifugu rubripes and fin tissue of crucian carp Carassius auratus

為了促進(jìn)細(xì)胞的增殖和貼壁生長(zhǎng)，在原代培養(yǎng)和早期傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)基中會(huì)添加促生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)和胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)等十分常用。成纖維生長(zhǎng)因子通過(guò)影響RNA聚合酶，加強(qiáng)核蛋白體基因的轉(zhuǎn)錄，從而加速細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞的分裂與增殖[17-18]。高首鱘鰭Acipensertransmontanus細(xì)胞系[19]和大菱鲆鰭細(xì)胞系[20]在原代培養(yǎng)和早期傳代培養(yǎng)時(shí)均添加了bFGF因子。毛凝等[21]在探究歐洲鰻鱺Anguillaanguilla胸鰭細(xì)胞的最適培養(yǎng)條件時(shí)，也證明bFGF對(duì)該細(xì)胞的增殖與分裂有促進(jìn)作用。IGFs是一類小分子的單鏈多肽物質(zhì)，是胰島素樣生長(zhǎng)因子家族中的一員。通過(guò)與細(xì)胞膜上的受體IGFR結(jié)合并經(jīng)Ras-Raf通路來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖。由于bFGF作用于G2M期的細(xì)胞，IGF作用于S期、G0期和G1期的細(xì)胞，他們作用的時(shí)間不同，所以聯(lián)合使用應(yīng)可以達(dá)到更好的促增殖效果[18]。本試驗(yàn)中參考前人的工作，在原代和早期培養(yǎng)階段，添加了上述兩種因子，收到很好的效果，進(jìn)一步證實(shí)成纖維細(xì)胞因子和胰島素樣生長(zhǎng)因子在細(xì)胞培養(yǎng)中具有促進(jìn)細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)的作用。

3.2 培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)

生長(zhǎng)曲線可用來(lái)測(cè)定細(xì)胞的絕對(duì)生長(zhǎng)數(shù)值，直觀的表現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的數(shù)量變化，也是細(xì)胞試驗(yàn)中基本的試驗(yàn)參數(shù)之一。通過(guò)潛伏期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、平臺(tái)期等階段的時(shí)間長(zhǎng)短總結(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂規(guī)律，預(yù)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)趨勢(shì)。魚類鰭細(xì)胞潛伏期多為1～2 d，指數(shù)生長(zhǎng)期為2 d左右，平臺(tái)期為1 d左右，之后細(xì)胞數(shù)量減少，進(jìn)入衰退期。如肖藝等[22]報(bào)道的錦鯉Cyprinuscarpio鰭細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線顯示，0～1.5 d為潛伏期, 1.5～3.5 d處于對(duì)數(shù)期, 3.5～4.5 d為平臺(tái)期, 4.5 d后進(jìn)入衰退期,錦鯉鰭細(xì)胞的群體倍增時(shí)間為43.5 h。樊廷俊等[20]報(bào)道的大黃魚Larimichthyscrocea鰭細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線顯示，接種后1 d為潛伏期，1～3 d為對(duì)數(shù)期，3～4 d為平臺(tái)期。群體倍增時(shí)間為50.96 h。樊廷俊等[23]報(bào)道的褐點(diǎn)石斑魚Epinephelusfuscoguttatus鰭細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線顯示，生長(zhǎng)周期為5～6 d時(shí)，群體倍增時(shí)間為50.6 h。本試驗(yàn)中紅鰭東方鲀鰭細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線顯示，0～2 d內(nèi)處于潛伏期，2～4 d時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)期。4～5 d時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期，5 d后開始轉(zhuǎn)入衰退期。紅鰭東方鲀鰭細(xì)胞系的倍增時(shí)間為50.24 h，與已有的報(bào)道相似。說(shuō)明在相近的培養(yǎng)條件下魚類鰭細(xì)胞的生長(zhǎng)基本一致。

3.3 細(xì)胞來(lái)源分析方法

微衛(wèi)星DNA序列是DNA分子中一段高度重復(fù)序列，由2～6 bp的重復(fù)單位構(gòu)成的DNA序列，一般有100～300 bp不等。微衛(wèi)星DNA數(shù)量多且均勻分布在基因組中，具有高度的多態(tài)性、結(jié)果穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的遺傳標(biāo)記，已普遍應(yīng)用于水生生物遺傳多樣性的分析、種質(zhì)鑒定、親緣關(guān)系鑒定、遺傳圖譜建立當(dāng)中。劉海金等[24]利用微衛(wèi)星分析了牙鲆Paralichthysolivaceus的遺傳關(guān)系；趙程等[25]利用微衛(wèi)星技術(shù)鑒定了5種不同鱖魚屬的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，探究了鱖魚的遺傳潛能和遺傳改良的可能性；任昆等[26]利用微衛(wèi)星進(jìn)行了草魚Ctenopharyngodonidellus親子關(guān)系的鑒定。以往對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)源的鑒定大多利用染色體制備和數(shù)量、核型分析方法，但是端粒會(huì)隨著細(xì)胞有絲分裂次數(shù)的不斷增加而不斷地縮短，端粒的丟失會(huì)使傳代細(xì)胞染色體變異的可能性增高。另外，制片過(guò)程中染色體的丟失，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性也會(huì)產(chǎn)生影響。

本試驗(yàn)中采用微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測(cè)，確定紅鰭東方鲀鰭細(xì)胞和紅鰭東方鲀鰭組織之間的親緣關(guān)系，試驗(yàn)結(jié)果誤差更小，準(zhǔn)確高效，觀察直觀，操作簡(jiǎn)單，實(shí)用性更好。