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(上海海洋大學 教育部水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用重點實驗室，海洋生物國際科學研究中心，上海 201306)

性腺體衍生因子(Gonadal soma derived factor,GSDF)是TGF-β超家族中的一個特異成員，在魚類性別決定和性別分化過程中均起著至關重要的作用。性腺體衍生因子基因gsdf最初從虹鱒Oncorhynchusmykiss性腺中分離出來，并發(fā)現(xiàn)該基因定位于性腺體細胞, 主要在雄性精原細胞周圍的支持細胞、雌性卵原細胞和卵黃前體的卵母細胞周圍的顆粒細胞表達，且在精巢的表達高于卵巢[1]。gsdf基因在硬骨魚類中是保守存在的，其僅在性腺中表達，目前，在虹鱒[1]、日本青鳉Oryziaslatipes[2]、三斑海豬魚Halichoerestrimaculatus[3]、斑馬魚Daniorerio[4]、鮭魚[5]等中均已克隆得到了gsdf基因。在青鳉中，gsdf基因作為Dmy下游基因對睪丸的早期分化起著至關重要的作用[2]，純合的gsdf-/-突變體青鳉能導致XY性腺往卵巢方向分化，表明gsdf基因在青鳉睪丸發(fā)育過程中起到內(nèi)源性誘導作用[6-7]。同時也有研究表明,gsdf基因對減數(shù)分裂過程中生殖細胞的增殖和分化有重要的影響[8]。

斑馬魚具有繁殖力強、體外受精和發(fā)育、胚胎透明、性成熟周期短、個體小易養(yǎng)殖等諸多特點，特別是可以進行大規(guī)模的正向基因飽和突變與篩選。這些特點使其成為功能基因組時代生命科學研究中重要的模式脊椎動物之一。gsdf基因對于硬骨魚睪丸分化是至關重要的，但對gsdf基因在斑馬魚早期睪丸分化過程中的研究尚缺乏相關報道。為進一步研究gsdf基因在斑馬魚早期精巢發(fā)育過程中的作用和分子調(diào)控機制，本研究中首次構建了以小鼠gamma-crystalin啟動子啟動的斑馬魚gsdf基因與增強型綠色熒光蛋白(Enhanced green flourence protein，EGFP)基因融合的表達質(zhì)粒Crystal-pro-gsdf-2A-egfp，通過具有自我剪切功能的2A肽序列剪切成GSDF蛋白和綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)，最終成功獲得和建立了能穩(wěn)定遺傳和過表達gsdf基因的轉基因斑馬魚模型，旨在為研究gsdf基因在斑馬魚雄性發(fā)育分子調(diào)控機制等方面的作用提供相關生物學數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型斑馬魚購自北京中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所，并置于教育部水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用重點實驗室的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中飼養(yǎng)，水溫為(28.0±0.5)℃，pH 為7.0～7.2，鹽度為0.50～0.53，采用光控系統(tǒng)控制光照周期(黑暗10 h，光照14 h)，投喂孵化的豐年蟲Artemiasalina，便于斑馬魚生長和繁殖產(chǎn)卵。

試驗試劑：In-Fusion HD Cloning Kits(Clontech)、反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)和PCR擴增試劑盒均購自TaKaRa公司,質(zhì)粒測序工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；凝膠回收試劑盒、各種限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司；Crystal-pro-egfp表達質(zhì)粒由教育部水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用重點實驗室保存；大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金公司;質(zhì)粒小提試劑盒(Plasmid Mini Kit)和質(zhì)粒去內(nèi)毒素中量提取試劑盒(Endo-Free Plasmid Midi Kit)購自OMEGA生物公司。

試驗儀器：凝膠成像系統(tǒng)為 Amersham Imager 600；電泳儀購自 Bio-Rad 公司；顯微注射儀器為Eppendorf公司產(chǎn)品；倒置熒光生物顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 通過 Ensemble(http://asia.ensembl.org/index.html)網(wǎng)站獲得斑馬魚gsdf基因的核苷酸序列、氨基酸序列、cDNA，以及外顯子和內(nèi)含子位置信息，并通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站對斑馬魚gsdf基因信息進行補充和核實，通過 ZFIN(http://zfin.org/)網(wǎng)站對基因功能進一步了解，采用Vector NTI 軟件對測序結果與目的基因片段進行比對。

1.2.2 引物設計及合成 首先在 NCBI 數(shù)據(jù)庫中查找到斑馬魚的gsdf基因和2A基因，并運用該數(shù)據(jù)庫中的Primer design功能對其編碼序列進行引物設計。由于運用In-Fusion克隆技術，其基礎是Clontech的In-Fusion專利酶,此酶通過識別DNA片段和線性化載體末端15 bp同源序列將DNA片段和線性化載體高效精確地融合在一起,根據(jù)此原理設計得到gsdf基因的上、下游引物：

gsdf-F：5′cttcccatcgattcggcatatgctgctgcgcctcgtcc 3′；

gsdf-R：5′ttgtggcacctgaccccggagggctcatggctg 3′。擴增其編碼區(qū)片段長度為546 bp。

2A基因的上、下游引物：

2A-F:5′cagccatgagccctccggggtcaggtgccacaa 3′；

2A-R:5′cgcccttgctcaccatgggcccagggttttcttc 3′。

擴增片段長度為109 bp。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 斑馬魚gsdf基因和2A基因的擴增 由于gsdf基因主要在斑馬魚精巢中表達，提取斑馬魚精巢總 RNA，逆轉錄合成cDNA，以該 cDNA 為模板，進行斑馬魚gsdf基因和2A基因的PCR 擴增。反應體系為：模板 cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA 聚合酶 2 × Ex TaqMasterMix 12.5 μL，用ddH2O補足至總體系為 25 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并于4 ℃下保存。

1.2.4 Crystal-pro-gsdf-2A-egfp表達載體的構建 斑馬魚gsdf基因和2A基因的PCR產(chǎn)物和報告質(zhì)粒載體Crystal-pro-egfp片段采用膠回收后并純化，使用Clontech公司的In-Fusion HD Cloning Kits試劑盒，按照使用說明書，建立反應體系為5 μL，在50 ℃水浴鍋中水浴15 min。連接產(chǎn)物轉化至感受態(tài)大腸桿菌中，并涂布于固體 LB 培養(yǎng)基(含氨芐西林100 mg/L)中過夜。挑取單菌落于LB 液體培養(yǎng)基(含氨芐西林100 mg/L)中培養(yǎng)12～16 h，用質(zhì)粒小量提取試劑盒(Plasmid Mini Kit，OMEGA)提取質(zhì)粒后，采用PCR鑒定，取陽性克隆進行EcoRI、IsecI酶切驗證，酶切產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結果正確的質(zhì)粒命名為Crystal-pro-gsdf-2A-egfp，采用質(zhì)粒去內(nèi)毒素中量提取試劑盒(Endo-Free Plasmid Midi Kit，OMEGA)提取質(zhì)粒后用于顯微注射。

1.2.5 斑馬魚胚胎的顯微注射和維持 注射前1 d準備好顯微注射用針，將進口毛細玻璃管(TW100F-4，WPI 公司)放置垂直拉針儀加熱環(huán)中央，通過重力作用和加熱原理，將玻璃管分成兩個針頭，將針頭放置磨針儀中央，緩慢旋轉螺母，直至看到針頭倒影，緩慢下移與磨板接觸并成45°角，50 s后可見針頭磨成有一個斜面，即可使用。將性成熟的雌、雄親魚按1∶1比例放入產(chǎn)卵盒中交配，收集受精卵，用無菌水清洗后轉移至15 g/L瓊脂糖的表面皿中，將構建好的質(zhì)粒濃度稀釋為50 ng/μL，在受精后20 min開始顯微注射，注射至斑馬魚受精胚胎1細胞期的動物極中。注射后的受精卵放入盛有無菌水的培養(yǎng)皿中，置于恒溫箱(28.0 ℃±0.5 ℃)中培養(yǎng)，分別在1～3 dpf (days post fertilization)使用倒置熒光顯微鏡觀察并篩選眼部晶狀體有特異性綠色熒光表達的胚胎。

2 結果與分析

2.1 斑馬魚gsdf和2A基因的擴增

由于gsdf基因主要在斑馬魚精巢組織中表達，提取斑馬魚精巢總RNA，逆轉錄合成 cDNA，以其為模板，PCR 擴增得到gsdf基因的編碼區(qū)，PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明，在 500 bp 附近有一特異性明亮條帶，其大小與預期546 bp 相符(圖1)；2A基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結果與預期109 bp相符(圖2)。

注：1、2分別為精巢組織cDNA樣品；M為DL10000 MarkerNote:1 and 2,cDNA in testis;M,DL10000 Marker圖1 gsdf 基因PCR 擴增產(chǎn)物結果Fig.1 PCR product of zebrafish gsdf gene

注：1、2分別為精巢組織cDNA樣品；M為DL10000 MarkerNote:1 and 2,cDNA in testis;M,DL10000 Marker圖2 2A基因PCR 擴增產(chǎn)物結果Fig.2 PCR product of zebrafish 2A gene

2.2 重組質(zhì)粒Crystal-pro-gsdf-2A-egfp的構建

對P817-egfp載體和割膠回收的斑馬魚gsdf基因和2A肽基因的PCR產(chǎn)物采用Clontech的In-Fusion無縫連接產(chǎn)品進行連接，連接產(chǎn)物轉化至E.coliDH5α 感受態(tài)細胞中，挑取陽性克隆進行菌落 PCR 驗證(圖3)，菌株1～3號均擴增出與預期大小一致的目的基因條帶。挑取其中菌株1和2保存菌種后提取質(zhì)粒。

將重組質(zhì)粒Crystal-pro-gsdf-2A-egfp分別進行EcoRI和IsecI酶切驗證。挑選的陽性克隆質(zhì)粒1和2的酶切結果中均有與目的基因大小一致的條帶。同時，將這兩個陽性克隆測序，通過vector NTI 軟件對測序結果與目標基因片段進行比對，結果完全一致，本研究中將此重組表達質(zhì)粒命名為Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)。

注：1、2、3分別為3個重組質(zhì)粒菌落樣品，M為DL10000 MarkerNote:1，2 and 3,recombinant plasmid colony;M,DL10000 Marker圖3 重組質(zhì)粒Crystal-pro-gsdf-2A-egfp的菌落 PCR電泳結果Fig.3 PCR product of recombinant plasmid Crystal-pro-gsdf-2A-egfp in E.coli DH5α

2.3 轉基因的效率統(tǒng)計結果

將構建好的重組質(zhì)粒Crystal-pro-gsdf-2A-egfp(圖4)濃度稀釋為50 ng/μL，通過顯微注射技術注射至斑馬魚受精胚胎1細胞期的動物極中。

試驗中注射了8792個胚胎，有綠色熒光蛋白(GFP)表達的性成熟的嵌合體轉基因斑馬魚共119尾。其中，有17尾可將egfp基因遺傳給下一代，即生殖系嵌合體轉基因斑馬魚，嵌合子F0代，其與野生型(WT)斑馬魚雜交得到F1代，飼養(yǎng)至性成熟的F1代與野生型斑馬魚雜交得到F2代，轉基因的效率統(tǒng)計結果如表1所示。

圖4 重組質(zhì)粒Crystal-pro-gsdf-2A-egfp圖譜Fig.4 Map of recombinant plasmid Crystal-pro-gsdf-2A-egfp

世代generation卵/粒egg孵化/ind.hatched轉基因/ind.GFP+lens轉基因魚占孵化魚比例/%ratioF0879236121193.3F11536126888770.0F286579657472.1

2.4 轉基因斑馬魚系的建立

由于重組質(zhì)粒Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)的啟動子是一段小鼠的晶體蛋白基因，在眼部晶狀體特異性表達，因此，通過倒置熒光顯微鏡觀察，如斑馬魚眼部晶狀體有特異性綠色熒光即為目的基因gsdf表達的轉基因魚。觀察發(fā)現(xiàn),F0代胚胎眼部晶狀體有特異性綠色熒光，即嵌合體(圖5)。

圖5 gsdf轉基因F0代與野生型(WT)斑馬魚胚胎的眀場、綠色熒光顯微圖Fig.5 Bright and fluorescence micrography of embryos in gsdf transgenic F0 generation and wild-type (WT) zebrafish

通過F0代嵌合體與野生型(WT)斑馬魚雜交，獲得眼部晶狀體有特異性綠色熒光的F1代，如圖6所示。 F1代中眼部晶狀體有特異性綠色熒光的個體與野生型斑馬魚(WT)雜交，獲得眼部晶狀體有特異性綠色熒光的F2代，如圖7所示。

圖6 gsdf轉基因F1代與野生型(WT)斑馬魚的眀場、綠色熒光顯微圖Fig.6 Bright and fluorescence micrography of embryos in gsdf transgenic F1 generation and wild-type (WT) zebrafish

圖7 gsdf轉基因F2代與野生型(WT)斑馬魚的眀場、綠色熒光顯微圖Fig.7 Bright and fluorescence micrography of embryos in gsdf transgenic F2 generation and wild-type (WT) zebrafish

本試驗結果表明，gsdf基因能在斑馬魚的眼部晶狀體中特異表達并穩(wěn)定遺傳，這表明在斑馬魚上成功構建了gsdf基因轉基因品系，從而為觀察和研究gsdf基因在斑馬魚雄性發(fā)育中的具體分子機制提供了良好的試驗模型，同時也為深入研究斑馬魚雄性性腺發(fā)育提供了重要的生物學資料。

3 討論

3.1 2A肽的作用及優(yōu)點

2A自切割肽(2A)于1991年在口蹄疫病毒(FMDV)中發(fā)現(xiàn)，是一種寡肽，通常由19～22個氨基酸組成[9]?？谔阋卟《镜?A自切割肽通過自我切割產(chǎn)生成熟的病毒蛋白，切割位點位于其C端的最后一個甘氨酸和2B下游蛋白的第一個脯氨酸之間[10-11]。迄今為止，已經(jīng)成功地從許多病毒mRNA分子中鑒定出2A樣序列，包括豬瘟病毒-1 2A(P2A)、馬鼻炎A病毒2A(E2A)、細胞質(zhì)多角體病毒(BmCPV 2A)和軟化病病毒(BmIFV 2A)等。2A肽具有許多優(yōu)點： 2A分子量較小，較容易在切割多種蛋白質(zhì)的同時盡量減少它們失去功能的可能性； 2A的切割活性僅依賴于核糖體，故與2A連接的蛋白質(zhì)可以在所有的細胞類型中表達等。由于2A在真核生物中的結構高度保守[12]，因此，基于2A序列的多基因表達系統(tǒng)(MGES)已被廣泛應用在創(chuàng)建新的功能性或具有抗性的植物和動物研究中[13]。此外，研究人員已經(jīng)使用2A序列來研究基因在小鼠[14]、斑馬魚[15]、豬[16]和綿羊[17]中的功能。

3.2 小鼠晶狀體蛋白在轉基因斑馬魚上的應用

本研究中首次以小鼠gamma-crystalin為啟動子，在斑馬魚上成功建立了Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)轉基因模型，發(fā)現(xiàn)斑馬魚的眼部晶狀體有綠色熒光，表明小鼠gamma-crystalin能夠驅動GSDF-2A-GFP融合蛋白在斑馬魚眼部晶狀體表達，說明斑馬魚和哺乳動物小鼠間的晶狀體存在高度的組織相似性，該研究目前國內(nèi)外尚未有相關報道。利用GFP綠色熒光在斑馬魚眼部晶狀體中的表達，便于直觀和快捷地對gsdf轉基因斑馬魚進行篩選，為后期對轉基因斑馬魚的鑒定工作節(jié)省了時間。

3.3 gsdf基因在性別決定和分化中的作用

自然界中，從低等生物到高等生物，雌雄的性別分化是一種較為普遍的現(xiàn)象，生物界實現(xiàn)性別差異的途徑有許多種，其過程也相當復雜。在雌雄異體的硬骨魚類中，表型性別可以通過遺傳(基因型性別決定，GSD)或環(huán)境決定[18]。斑馬魚是一種主要的模式生物，但當前對于斑馬魚的性別決定機制還不是非常清楚。在馴化的斑馬魚中，性別決定似乎是受多基因和多種遺傳因素影響的，并且還受到環(huán)境因素的影響。在目前的研究中，野生斑馬魚的基本性別決定似乎受到ZZ/ZW遺傳系統(tǒng)的調(diào)控，但所涉及的基因尚未確定[19]。與此同時，一些研究表明，最常用的馴養(yǎng)斑馬魚品系不受任何主要的遺傳性決定因素影響，而是依靠一種多基因遺傳系統(tǒng)的調(diào)控[20-21]，幼年時期的斑馬魚被歸類為雌雄同體，在這個發(fā)育期間，性腺是雙向的[22]。斑馬魚的性別在此階段具有可塑性，Gautier等[23]研究表明，gsdf基因在斑馬魚雙向性腺未分化之前就已經(jīng)表達并僅限于在性腺中表達，這種表達是可檢測的。在羅非魚Oreochromismossambicus中，gsdf基因是第一個在XY性腺分化的關鍵時期中表現(xiàn)出雙向性腺形態(tài)的基因，在雄性決定和分化中起著重要的作用[6]，但在斑馬魚中gsdf基因在雙向性腺階段發(fā)揮的具體作用尚不可知。在經(jīng)歷此階段后，成為雄性個體的卵母細胞將通過凋亡過程而失去，而雌性的卵母細胞會繼續(xù)成熟[24]。本研究中構建的Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)模型可以用來研究gsdf基因在斑馬魚雙性腺雌雄同體時期的作用。

gsdf基因的表達也受到外部環(huán)境的影響，據(jù)報道，高溫能激活gsdf基因的表達與睪丸分化的啟動[25]。本研究中建立的Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)模型可以用來研究gsdf基因的過表達在不同溫度條件下對雄性發(fā)育的影響，近期有研究表明，通過gsdf基因遺傳功能喪失研究和啟動子分析，gsdf基因為尼羅羅非魚雄性通路中dmrt1的下游基因，是睪丸分化所必需的，并且似乎通過抑制雌激素產(chǎn)生而起作用[26]，因此,本研究中構建的該轉基因模型可以用來研究gsdf基因在斑馬魚的過表達與其他生殖相關基因的關系。隨著研究內(nèi)容的不斷豐富，近期有研究人員發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚中，gsdf基因能調(diào)節(jié)卵巢卵泡成熟和類固醇物質(zhì)合成，同時，對肥胖、糖尿病和雌性生育力相關基因的表達也有調(diào)節(jié)作用，因此，其可以作為模擬人類多囊卵巢綜合征(PCOS)的卵巢和卵巢外表型的模型，用來研究相關TGF-β信號分子與人類多囊卵巢綜合征的病因關系[27]。

如今，轉基因斑馬魚在生物醫(yī)學研究、疾病模型構建、藥物篩選等領域中發(fā)揮著越來越重要的作用[28]。本研究中首次在斑馬魚上構建了以小鼠gamma-crystalin啟動子啟動的Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)熒光素酶報告質(zhì)粒，通過倒置熒光顯微鏡觀察斑馬魚眼部晶狀體有特異性綠色熒光即可篩選出含有目的基因表達的斑馬魚個體，具有方便、快速和高效等優(yōu)點，提高了建立轉基因斑馬魚模型的效率。

綜上所述，在斑馬魚上建立Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)轉基因品系，為研究和觀察gsdf基因在斑馬魚精巢發(fā)育過程和分子調(diào)控機制方面的作用提供了新的方法。同時為研究外部環(huán)境對斑馬魚生殖的影響和研究與其生殖相關基因的功能提供了較好的模型。