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        雙氯芬酸鈉注射液的溶血性及主動(dòng)全身過敏反應(yīng)試驗(yàn)

        2019-01-11 15:05:01楊亞軍劉希望李世宏孔曉軍焦增華郭玉凡李劍勇
        中國獸醫(yī)雜志 2019年9期
        關(guān)鍵詞:劑量

        秦 哲 , 楊亞軍 , 劉希望 , 李世宏 , 孔曉軍 , 焦增華 , 郭玉凡 , 李劍勇

        (1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所 農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 , 甘肅 蘭州 730050 ; 2. 鄭州百瑞動(dòng)物藥業(yè)有限公司 , 河南 鄭州 450000)

        雙氯芬酸鈉為芳基乙酸類第三代強(qiáng)效非甾體抗炎藥(NSAIDs),具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱和抗風(fēng)濕作用,與同類藥物相比具有療效好、副作用小、長期應(yīng)用無蓄積性、給藥后吸收迅速、有效血藥濃度維持時(shí)間較長等優(yōu)點(diǎn)。在國內(nèi)外獸醫(yī)臨床實(shí)踐中,該藥被用于緩解家畜手術(shù)、外傷、關(guān)節(jié)炎等引起的疼痛,以及細(xì)菌感染和其他疾病繼發(fā)感染引起的高熱[1],受到獸醫(yī)臨床和動(dòng)保企業(yè)的青睞。國內(nèi)目前已有相關(guān)的注射劑被批準(zhǔn)用于豬[2],但是暫未批準(zhǔn)用于奶牛。溶血性試驗(yàn)和主動(dòng)全身過敏反應(yīng)試驗(yàn)是評價(jià)注射劑安全性的重要檢驗(yàn)項(xiàng)目[3]。本研究采用體外試管法,觀察試驗(yàn)24 h內(nèi)5%雙氯芬酸鈉注射液致溶血與紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象,評價(jià)其溶血性。豚鼠主動(dòng)全身過敏試驗(yàn)中通過整體反應(yīng)癥狀判斷過敏反應(yīng)發(fā)生情況及其反應(yīng)程度。為雙氯芬酸鈉注射液的臨床前安全性評價(jià)提供試驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 藥物與試劑 雙氯芬酸鈉注射液(中試產(chǎn)品),規(guī)格10 mL∶0.5 g,批號(hào):20150826;注射液空白溶劑,鄭州百瑞動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn);牛血清白蛋白,生工生物工程(上海)股份有限公司,LJ0525B10011。

        1.2 儀器與設(shè)備 ME235S分析天平,德國賽多利斯公司;SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司;MULTIFUGE X3R離心機(jī),美國賽默飛世爾科技公司。

        1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級雌性日本大耳白兔1只,體重2.5 kg;SPF級雄性Dunkin-Hartley豚鼠60只,體重300~400 g,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(甘)2010-0001。

        1.4 溶血性試驗(yàn)

        1.4.1 紅細(xì)胞混懸液的制備 采用常規(guī)方法制備2%兔血紅細(xì)胞混懸液。

        1.4.2 受試藥物的制備 用0.9%氯化鈉溶液1∶3稀釋雙氯芬酸鈉注射液作為供試品溶液。

        1.4.3 溶血性試驗(yàn) 潔凈試管21支,分7組,各組均加入2%兔紅細(xì)胞混懸液2.5 mL。1~5組分別加入供試品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL,6組為陰性對照組,1~6組用生理鹽水補(bǔ)足5 mL。7組為陽性對照組,加入蒸餾水2.5 mL。輕輕混勻反應(yīng)液,置37 ℃水浴中孵育。觀察并記錄0、0.5、1、2、3、24 h溶血與凝集現(xiàn)象。試驗(yàn)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):紅細(xì)胞全部下沉,上層液無色澄明,判定為無溶血;溶液澄明呈紅色或棕紅色,管底有少量紅細(xì)胞殘留,判定為部分溶血;紅色溶液澄明,管底無紅細(xì)胞殘留,判定為全溶血;溶液中有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀,搖勻后不分散,判定為紅細(xì)胞凝聚。若藥液0.3 mL在0.5 h 內(nèi)引起溶血即不宜作靜脈注射用[3-6]。

        1.5 主動(dòng)全身過敏反應(yīng)試驗(yàn)

        1.5.1 致敏試驗(yàn) 雙氯芬酸鈉注射液對奶牛的臨床用藥量為2.2 mg/kg·bw,經(jīng)體表面積折算,豚鼠的臨床等效用藥量為28.15 mg/kg·bw[7]。本試驗(yàn)中雙氯芬酸鈉注射液給藥劑量分別為50、25、12.5、6.25、3.125 mg/kg·bw。陽性對照組給予10%牛血清白蛋白-生理鹽水溶液0.5 mL/只。陰性對照組給予注射液空白溶劑。腹腔注射給藥,隔日1次,共3次[6]。

        1.5.2 激發(fā)試驗(yàn) 豚鼠于末次致敏后第14、21天,以2倍致敏劑量于股四頭肌快速注射進(jìn)行兩次激發(fā)。觀察動(dòng)物反應(yīng)3 h,致敏期間每日觀察動(dòng)物癥狀。

        1.5.3 結(jié)果判定 豚鼠全身致敏性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[3,6]:“-”,過敏反應(yīng)陰性(癥狀:正常);“+”,過敏反應(yīng)弱陽性(癥狀:躁動(dòng)、豎毛、顫抖、搔鼻);“+ +”,過敏反應(yīng)陽性(癥狀:噴嚏、咳嗽、呼吸急促、排尿、排糞、流淚);“+ + +”,過敏反應(yīng)強(qiáng)陽性(癥狀:呼吸困難、哮鳴音、紫癜、步態(tài)不穩(wěn)、跳躍、喘息、痙攣、旋轉(zhuǎn)、潮式呼吸);“+ + + +”,過敏反應(yīng)極強(qiáng)陽性(癥狀:死亡)。計(jì)算過敏反應(yīng)發(fā)生率,結(jié)合癥狀發(fā)生程度進(jìn)行綜合判斷。

        2 結(jié)果

        2.1 溶血性試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果顯示,反應(yīng)加液完畢后,7組即出現(xiàn)完全溶血現(xiàn)象,其他各組均為紅色不透亮液體;37 ℃水浴孵育0.5 h,5組呈現(xiàn)完全溶血現(xiàn)象;水浴孵育1 h, 4組呈現(xiàn)完全溶血現(xiàn)象;水浴孵育2 h,3組呈現(xiàn)完全溶血現(xiàn)象;水浴孵育3 h,2組呈現(xiàn)部分溶血現(xiàn)象,為紅色不透亮液體,管底有紅細(xì)胞沉淀,與生理鹽水對照組一致。4 ℃靜置過夜,1、6組上層溶液無色透明,紅細(xì)胞全部沉積到管底,振搖可分散,顯微鏡下觀察紅細(xì)胞均為單個(gè)分離,發(fā)亮,形態(tài)飽滿。其他各組均呈完全溶血現(xiàn)象,為紅色透亮液體,管底無紅細(xì)胞沉淀。各組均無紅細(xì)胞凝聚現(xiàn)象。試驗(yàn)結(jié)果表明,該藥物可導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解,不宜用作靜脈注射。

        2.2 主動(dòng)全身過敏反應(yīng)試驗(yàn)

        2.2.1 致敏藥物劑量篩選試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果顯示,將10% BSA溶液以1 mL/kg·bw腹腔注射豚鼠進(jìn)行3次致敏,沒有出現(xiàn)死亡情況。藥物劑量6.25、12.5 mg/kg·bw動(dòng)物死亡率均為50%,藥物劑量25 mg/kg·bw動(dòng)物死亡率為83.3%,藥物劑量50 mg/kg·bw動(dòng)物死亡率為100%,藥物劑量3.125 mg/kg·bw,在觀察期內(nèi)豚鼠采食飲水、行為活動(dòng)、呼吸、排便等一般狀況良好,未見全身不良反應(yīng),無死亡現(xiàn)象。故確定該劑量為豚鼠主動(dòng)全身過敏反應(yīng)試驗(yàn)致敏劑量,并以該劑量作為陰性對照組的致敏劑量(0.0625 mL/kg·bw)。

        2.2.2 豚鼠主動(dòng)全身過敏反應(yīng)試驗(yàn) 按照預(yù)試驗(yàn)篩選出的藥物致敏劑量進(jìn)行豚鼠致敏,分別于末次致敏后第14、21天,股四頭肌注射相應(yīng)劑量藥物激發(fā),觀察3 h。豚鼠行為學(xué)觀察結(jié)果顯示,陰性對照組和藥物組的豚鼠均表現(xiàn)為安靜正常,未出現(xiàn)躁動(dòng)、豎毛、搔鼻、顫抖、噴嚏、咳嗽、呼吸急促等癥狀,過敏反應(yīng)發(fā)生率均為0。而BSA組中有2只豚鼠可見明顯的抓鼻、顫抖、噴嚏、潮式呼吸、哮鳴音等一過性過敏反應(yīng),過敏反應(yīng)發(fā)生率為33.3%。依據(jù)全身性致敏評價(jià)標(biāo)準(zhǔn),BSA組的豚鼠呈過敏反應(yīng)陽性,過敏反應(yīng)程度為++。兩次激發(fā)結(jié)果顯示,出現(xiàn)過敏反應(yīng)的豚鼠數(shù)量和反應(yīng)程度均基本一致。

        3 討論

        注射劑和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血反應(yīng)的其他藥物制劑均應(yīng)進(jìn)行溶血性試驗(yàn)[6]。已有研究表明,雙氯芬酸鈉對低滲[8]、2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽介導(dǎo)的過氧化應(yīng)激[9]導(dǎo)致的紅細(xì)胞溶解有較好的抑制作用,說明雙氯芬酸鈉沒有溶血性。但是由于雙氯芬酸鈉在水中的溶解度較小,達(dá)不到劑量設(shè)計(jì)濃度要求。同時(shí),雙氯芬酸鈉分子結(jié)構(gòu)中含有易被氧化的羧酸基團(tuán),在注射液中穩(wěn)定性較差,因此在制劑中需添加增溶或提高穩(wěn)定性的成分[10]。研究報(bào)道,雙氯芬酸鈉滴眼液溶血性較強(qiáng)是由于藥物中含有的聚氧乙烯(35)蓖麻油所致[11]。本試驗(yàn)采用常規(guī)體外試管法檢測評價(jià)雙氯芬酸鈉注射液的溶血性[12]。試驗(yàn)結(jié)果表明,雙氯芬酸鈉注射劑稀釋液在低濃度(0.1 mL)下不會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解,但是在較高濃度下可導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解,且隨著藥物濃度增加,溶解紅細(xì)胞作用速度加快,溶血程度增強(qiáng),因此該注射液不宜用作靜脈注射。

        雙氯芬酸鈉通過與環(huán)氧化酶(COX)結(jié)合,阻斷花生四烯酸向前列腺素E2的轉(zhuǎn)化。同時(shí)可促進(jìn)花生四烯酸與甘油三酯結(jié)合,降低細(xì)胞內(nèi)游離的花生四烯酸濃度[12],間接抑制白三烯的合成[13]。進(jìn)而對各種發(fā)熱性、炎性疼痛性疾病發(fā)揮治療作用。然而,雙氯芬酸鈉對COX的作用為非選擇性抑制,其對COX-1的抑制作用能夠激發(fā)機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答,這也是其引起過敏反應(yīng)的重要原因之一[14]。調(diào)查研究表明,在眾多NSAIDs口服藥物中雙氯芬酸類藥物引起過敏反應(yīng)的比率最高[15]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,雙氯芬酸鈉注射液不會(huì)引起豚鼠的主動(dòng)全身過敏反應(yīng)。陽性對照組豚鼠的過敏反應(yīng)發(fā)生率為33.3%,過敏反應(yīng)程度為++。對比第14天和第21天激發(fā)結(jié)果出現(xiàn)過敏反應(yīng)的豚鼠數(shù)量一致,程度未見增強(qiáng)。本試驗(yàn)中由于雙氯芬酸鈉注射液具有較強(qiáng)的溶血性,故沒有通過靜脈注射激發(fā)過敏反應(yīng),而是參考藥物的臨床給藥方式,采用肌肉注射進(jìn)行激發(fā)。試驗(yàn)結(jié)果的差異性是否與激發(fā)途徑有關(guān),有待進(jìn)一步研究。

        4 結(jié)論

        雙氯芬酸鈉注射液不會(huì)引起豚鼠主動(dòng)全身過敏反應(yīng),但在一定程度上可導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解,不宜用作靜脈注射。

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