吳俊豪，王 晶，KHO SETHYKUN，覃 川，王倩倩，余 鵬，馮鳳琴,

（1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2.浙江大學(xué)寧波研究院，浙江寧波 315100；3.余姚市冷江鱉業(yè)有限公司，浙江寧波 315400）

衰老，通俗來(lái)說(shuō)是指生物體的生長(zhǎng)發(fā)育經(jīng)過(guò)成熟期后，隨著年齡的繼續(xù)增長(zhǎng)，生物個(gè)體的器官功能性和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性等發(fā)生不可避免地下降或衰退，從而趨向死亡的過(guò)程與狀態(tài)[1-2]。許多慢性疾病，如風(fēng)濕免疫病、心腦血管疾病和中樞神經(jīng)病等，都與衰老有著密切的聯(lián)系[3-4]。衰老是受基因與環(huán)境等多重因素影響的復(fù)雜表型，其具體機(jī)理目前尚無(wú)定論，而自由基學(xué)說(shuō)是目前衰老研究領(lǐng)域較有說(shuō)服力的理論學(xué)說(shuō)[3]。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為，機(jī)體的自由基水平會(huì)隨著有氧代謝增加，過(guò)剩的自由基會(huì)引發(fā)脂質(zhì)的過(guò)氧化，破壞細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)，造成組織的不可逆損傷，最終導(dǎo)致機(jī)體的衰老[5-7]。隨著社會(huì)發(fā)展和科技進(jìn)步，人們對(duì)于延緩衰老的需求也在增加，開發(fā)天然的抗氧化功能性食品具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。過(guò)往研究表明，抗氧化肽不僅具有優(yōu)良的自由基清除能力，而且穩(wěn)定性好、無(wú)免疫反應(yīng)[8-10]。Chen 等[11]酶解深紅鯛魚魚鱗得到的抗氧化肽能有效延長(zhǎng)果蠅的平均壽命、最高壽命和半數(shù)死亡時(shí)間。Ding 等[12]通過(guò)酶解和純化從鹿茸中提取的抗氧化四肽Trp-Asp-Val-Lys 能有效抑制斑馬魚體內(nèi)活性氧的生成。Tonolo 等[13]研究證實(shí)，四種牛奶衍生肽在細(xì)胞內(nèi)的抗氧化作用主要通過(guò)激活Keap1-Nrf2 信號(hào)通路完成。由此可見，生物活性肽的抗衰老功能研究潛力巨大，開發(fā)新型抗氧化肽是食品與醫(yī)藥領(lǐng)域值得關(guān)注的重點(diǎn)方向。

烏龜肉在我國(guó)有著悠久的食用歷史，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為烏龜肉有潤(rùn)肺滋陰、舒通心氣的作用，兼具了營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值[14-15]。石揚(yáng)等[14]以中華草龜為原料，通過(guò)酶解和葡聚糖凝膠柱層析得到了高純度的抗腫瘤活性肽。楊昭等[15]利用堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對(duì)中華草龜、中華花龜和鱷龜肉進(jìn)行水解，結(jié)果表明龜肉酶解液具有較高的自由基清除率，推測(cè)其具有抗氧化作用?，F(xiàn)階段關(guān)于龜肉蛋白肽的研究主要集中在抗腫瘤活性和體外抗氧化活性方面，但是并未涉及動(dòng)物壽命實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)抗氧化活性以及基因表達(dá)等相關(guān)方向。壽命是評(píng)價(jià)抗衰老作用最為直接的觀測(cè)指標(biāo)[16]，而果蠅有著生活史短、易于繁殖、含有人類75%已知疾病的同源基因等優(yōu)良特性，是抗衰老研究中常用的動(dòng)物模型[17]。本研究以果蠅作為模型，用含不同劑量龜肉蛋白肽的培養(yǎng)基喂養(yǎng)，通過(guò)生存實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)SOD、CAT 活性和MDA 含量的測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)龜肉蛋白肽的抗衰老功能，并通過(guò)測(cè)定抗氧化相關(guān)基因Sod1、Sod2和Cat以及壽命相關(guān)基因mth、Rpn11的表達(dá)來(lái)探究龜肉蛋白肽的抗衰老機(jī)制，期望為開發(fā)龜肉蛋白肽抗衰老功能食品提供相關(guān)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮烏龜肉 余姚市冷江鱉業(yè)有限公司；Canton-S 黑腹果蠅 浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；動(dòng)物蛋白酶A1（200000 U/g） 南寧龐博生物工程有限公司；細(xì)胞色c、抑肽酶、桿菌肽、甘氨-甘氨-色氨-精氨酸和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；總超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、丙二醛試劑盒 南京建成生物工程研究所；FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒、RNA simple 總RNA 提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

Legend Micro 高速臺(tái)式離心機(jī) 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；RE-3000A 型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；Ultimate3000 高效液相色譜儀 美國(guó)Dionex 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 龜肉蛋白肽的制備 參考張永進(jìn)等[18]的方法稍作修改，將新鮮烏龜肉洗凈切塊、去除脂肪，蒸煮3 h 后勻漿，加入動(dòng)物蛋白酶A1，50 ℃恒溫酶解6 h后取出，立即置于沸水浴中滅酶20 min，然后過(guò)濾并離心，取上清液蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥得到龜肉蛋白肽粉末。

1.2.2 龜肉蛋白肽的營(yíng)養(yǎng)成分分析 參照GB 5009-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》中相應(yīng)的方法測(cè)定龜肉蛋白肽的水分、灰分、蛋白質(zhì)、酸溶蛋白質(zhì)等含量。

1.2.3 龜肉蛋白肽分子質(zhì)量及分布測(cè)定 參照GB 5009-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》，利用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。樣品處理方法：精確稱取0.02 g 龜肉蛋白肽樣品，定容到10 mL 并混勻，使用微孔濾膜（0.22 μm）過(guò)濾后進(jìn)樣檢測(cè)。

色譜條件：TSK gel 2000 SWXL 分析柱（300 nm×7.8 mm），柱溫30 ℃，流動(dòng)相按照乙腈:水:三氟乙酸=450:550:1（v/v/v）的比例配制，進(jìn)樣體積20 μL，流速0.5 mL/min，于220 nm 檢測(cè)波長(zhǎng)下運(yùn)行30 min。分別以高純度標(biāo)準(zhǔn)品甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（189 Da）、甘氨-甘氨-色氨-精氨酸（451 Da）、桿菌肽（1450 Da）、抑肽酶（6512 Da）以及細(xì)胞色c（12400 Da）的保留時(shí)間對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到y(tǒng)=-0.2187x+6.7329（R2=0.9901），進(jìn)一步計(jì)算得到龜肉蛋白肽的分子質(zhì)量，單位為Da。

1.2.4 龜肉蛋白肽的氨基酸組成測(cè)定

1.2.4.1 樣品前處理 參考史晉源等[19]方法，取20 mg龜肉蛋白肽粉末置于15 mL COD 消解瓶，滴加1 mL鹽酸溶液（6 mol/L），同時(shí)充入適量氮?dú)?，立刻密封消解瓶?50 ℃恒溫加熱1.5 h，隨后冷卻至室溫。取各氨基酸對(duì)照品10 mg，超聲溶解于0.1 mol/L 鹽酸溶液，定容至25 mL 得到氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.4.2 氨基酸衍生化反應(yīng) 流動(dòng)相A 為乙酸鈉溶液（0.1 mol/L，pH6.5）；流動(dòng)相B 為經(jīng)過(guò)超聲脫氣的80%乙腈溶液；按乙醇:水:三乙胺=2:2:1（v/v/v）的比例配制再干燥液；按異硫氰酸苯酯:乙醇:三乙胺:水=1:7:1:1（v/v/v/v）的比例配制衍生溶液；按流動(dòng)相A:流動(dòng)相B=9:1（v/v）的比例配制樣品稀釋液。將不同量的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液（1、5、10、15、20 μL）分別與6 μL 水解液加入1.5 mL 離心管中，依次加入10 μL 再干燥液和20 μL 衍生溶液，渦旋混勻，期間多次使用氮?dú)飧稍铮来渭尤?0 μL 流動(dòng)相B 和450 μL 流動(dòng)相A，渦旋混勻，經(jīng)膜過(guò)濾后進(jìn)樣上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4.3 高效液相色譜的測(cè)定條件 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫38 ℃，進(jìn)樣體積10 μL，流速1 mL/min，于254 nm 波長(zhǎng)下運(yùn)行。以乙酸鈉溶液（0.1 mol/L，pH6.5）作為流動(dòng)相A，經(jīng)過(guò)超聲脫氣的80%乙腈溶液作為流動(dòng)相B，梯度洗脫時(shí)間見表1。以各氨基酸的峰面積為橫坐標(biāo)，氨基酸標(biāo)液的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，分別進(jìn)行線性回歸分析，得到各氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于龜肉蛋白肽樣品中各氨基酸的定性和定量分析。

表1 梯度洗脫時(shí)間Table 1 Gradient elution time

1.2.5 果蠅培養(yǎng)基的制備 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方為105 g 玉米粉、40 g 酵母粉、75 g 白砂糖、7.5 g 瓊脂、10 mL 丙酸及1000 mL 純凈水。樣品培養(yǎng)基配制方法和劑量選擇參考史晉源等[19]的方法，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同劑量龜肉蛋白肽，將實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基配成對(duì)照組（空白）、低劑量組（0.2%）、中劑量組（0.4%）和高劑量組（0.8%），按40 g/瓶分裝于玻璃瓶中用于果蠅擴(kuò)種，按5 g/管分裝于玻璃試管中用于果蠅的壽命分析。

1.2.6 果蠅擴(kuò)種 果蠅的飼養(yǎng)環(huán)境為溫度25 ℃，濕度60%～70%，晝夜12 h 交替。將果蠅從保種瓶轉(zhuǎn)移到新的擴(kuò)種瓶中，通入CO2使其全部麻醉，在果蠅挑取板上區(qū)分雌雄性別，按照雌:雄=40:20 轉(zhuǎn)入含基礎(chǔ)培養(yǎng)基的瓶中進(jìn)行交配產(chǎn)卵。5 d 后放出初代果蠅，培養(yǎng)約10 d，羽化的果蠅即為親代果蠅。將親代果蠅按照雌雄比40:20 接入實(shí)驗(yàn)飼料組，第5 d 放飛親代果蠅，約第10 d 飛出的果蠅即為接種果蠅。

1.2.7 果蠅生存試驗(yàn) 將24 h 內(nèi)羽化的果蠅轉(zhuǎn)入空瓶，通入CO2麻醉以區(qū)分雌雄性別。各試驗(yàn)組試管飼養(yǎng)30 只雌性或雄性果蠅，重復(fù)10 次。每隔3 d 給各試管果蠅換新培養(yǎng)基，觀測(cè)各試管果蠅的存活數(shù)，計(jì)算果蠅實(shí)驗(yàn)常用的壽命指標(biāo)[20]（半數(shù)死亡時(shí)間、平均壽命、平均最高壽命、平均壽命延長(zhǎng)率以及存活率），同時(shí)繪制雌雄果蠅的生存曲線。各項(xiàng)壽命指標(biāo)的計(jì)算公式如下：

1.2.8 果蠅抗氧化活性實(shí)驗(yàn) 參考Xin 等[21]和張明等[22]的方法，分別于20 d 果蠅青年期和40 d 果蠅老年期時(shí)，使用CO2麻醉果蠅并加生理鹽水制成10%組織勻漿，置于低溫離心機(jī)中離心15 min（4 ℃，8000 r/min），取上清液，使用試劑盒分別測(cè)定每組雌、雄果蠅的總SOD、CAT 活性和MDA 含量。

1.2.9 果蠅基因表達(dá)實(shí)驗(yàn) 參考張曉寒等[23]的實(shí)驗(yàn)方法稍作修改，選取基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照組，選取果蠅生存實(shí)驗(yàn)和抗氧化活性實(shí)驗(yàn)的最佳劑量，即0.8%龜肉蛋白肽為實(shí)驗(yàn)劑量，選擇生存實(shí)驗(yàn)延壽效果較好的雌性果蠅為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，重復(fù)上述果蠅培養(yǎng)和擴(kuò)種實(shí)驗(yàn)，在第21 d 時(shí)，參照相關(guān)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行果蠅總RNA 提取和cDNA 合成。以cDNA 為模板，利用熒光實(shí)時(shí)PCR 檢測(cè)其抗氧化相關(guān)基因Sod1、Sod2和Cat，以及壽命調(diào)節(jié)相關(guān)基因mth、Rpn11的mRNA表達(dá)水平。引物序列見表2，以rp49為內(nèi)參基因，基因表達(dá)以PCR 的2-ΔΔCt值表示。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究使用SPSS 22.0 軟件分析統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各項(xiàng)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用Graphpad Prism 9 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 龜肉蛋白肽營(yíng)養(yǎng)成分分析

龜肉蛋白肽的部分成分含量見表3。龜肉的蛋白酶解產(chǎn)物中含有大量蛋白質(zhì)，占總營(yíng)養(yǎng)成分的86.49%，其中85.98%為酸溶蛋白，而且水解度高達(dá)32%。酸溶蛋白含游離氨基酸和小肽，具有較低的分子量，可以很好地溶于酸性溶液中[24]，說(shuō)明龜肉蛋白肽在體內(nèi)容易被消化吸收。

表3 龜肉蛋白肽的營(yíng)養(yǎng)成分Table 3 Nutrient content of PTPDP

2.2 龜肉蛋白肽分子質(zhì)量分布

蛋白酶解產(chǎn)物中，分子量相對(duì)較小的肽鏈片段往往會(huì)表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性[25]。申彩虹[26]通過(guò)酶解法制備得到了海參寡肽（130～2000 Da）和海參多肽（2000～5000 Da），前者的抗氧化能力顯著強(qiáng)于后者。另一研究也顯示，鱸魚肉水解所得肽段中抗氧化活性最強(qiáng)的肽段同時(shí)相對(duì)分子質(zhì)量也最小[27]。龜肉蛋白肽分子量分布情況見表4，其中分子量為180～500 Da 的肽段含量最大，占60.39%。龜肉蛋白肽中94.71%的肽段為1000 Da 以下的小肽，因此推測(cè)其具有潛在的抗氧化功能。

表4 龜肉蛋白肽分子量分布Table 4 Molecular weight distribution of PTPDP

2.3 龜肉蛋白肽氨基酸組成

過(guò)往研究表明，甘氨酸和谷氨酸是內(nèi)源性抗氧化劑谷胱甘肽的組成氨基酸[28]，谷氨酸還參與紅細(xì)胞的生產(chǎn)，具有抵抗記憶力減退、改善腦細(xì)胞等抗衰老作用[29]；精氨酸與細(xì)胞增殖、信號(hào)傳導(dǎo)等多種生物學(xué)功能相關(guān)，可改善多種衰老相關(guān)疾病[19,30]；支鏈氨基酸，包括纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸在內(nèi)，可以有效延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)小鼠的各項(xiàng)壽命指標(biāo)，具有抗氧化、延緩衰老的作用[31]；此外，丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸也被廣泛認(rèn)為具有抗氧化功效[19]。龜肉蛋白肽由16 種氨基酸組成（見表5），上述10 種具有抗氧化、抗衰老功能的氨基酸共占80.30%，其中甘氨酸（15.79%）、谷氨酸（14.70%）和脯氨酸（9.73%）的相對(duì)含量最高。因此推測(cè)龜肉蛋白肽可能具有抗氧化、延緩衰老的作用。

2.4 龜肉蛋白肽對(duì)果蠅壽命的影響

壽命是評(píng)價(jià)抗衰老作用的生物實(shí)驗(yàn)中最直接的觀測(cè)指標(biāo)，果蠅實(shí)驗(yàn)中，通常用半數(shù)死亡時(shí)間、平均壽命、平均最高壽命和平均壽命延長(zhǎng)率作為觀測(cè)指標(biāo)[16]。不同劑量龜肉蛋白肽對(duì)雌、雄果蠅壽命的影響如表6 所示，除低劑量組果蠅的半數(shù)死亡時(shí)間外，各實(shí)驗(yàn)組果蠅的各項(xiàng)壽命指標(biāo)均較對(duì)照組有所上升，且對(duì)壽命的延長(zhǎng)效果隨喂食龜肉蛋白肽的含量增加而升高。對(duì)于雄性果蠅，高劑量組的平均壽命極顯著增加（P＜0.01），平均最高壽命顯著增加（P＜0.05）。對(duì)于雌性果蠅，低劑量組的平均最高壽命顯著增加（P＜0.05），中劑量組的平均最高壽命極顯著增加（P＜0.01），高劑量組半數(shù)死亡時(shí)間、平均壽命和平均最高壽命均極顯著增加（P＜0.01）。綜上所述，0.8%龜肉蛋白肽培養(yǎng)基喂養(yǎng)果蠅對(duì)其壽命的延長(zhǎng)效果最佳。

表6 不同劑量龜肉蛋白肽對(duì)雌、雄果蠅壽命的影響Table 6 Effects of different doses of PTPDP on the lifespan of female and male D. melanogaster

果蠅的生存曲線見圖1，20 d 之前，各實(shí)驗(yàn)組相比空白對(duì)照無(wú)顯著性差異（P＞0.05），20 d 后高劑量組雌、雄果蠅的存活率均逐漸高于對(duì)照組。各劑量龜肉蛋白肽喂養(yǎng)下，雌雄果蠅存活率歸零的時(shí)間均較對(duì)照組變晚，其中0.8%龜肉蛋白肽組最晚?？傮w來(lái)說(shuō)，龜肉蛋白肽可以增加雌雄果蠅的存活率，其中0.8%龜肉蛋白肽的效果最好。

圖1 雌性（A）和雄性（B）果蠅的生存曲線Fig.1 The survival curves of female (A) and male (B) D.melanogaster

本實(shí)驗(yàn)中，龜肉蛋白肽對(duì)雌性果蠅的延壽效果好于雄性：喂食0.8%龜肉蛋白肽的雌性果蠅半數(shù)死亡時(shí)間較對(duì)照組極顯著延長(zhǎng)（P＜0.01），而雄性果蠅則無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；0.2%、0.4%龜肉蛋白肽喂養(yǎng)的雌性果蠅平均最高壽命分別顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）、極顯著延長(zhǎng)（P＜0.01），而同組雄性果蠅不呈顯著性差異（P＞0.05）；0.8%龜肉蛋白肽組雌性果蠅的平均最高壽命較對(duì)照組極顯著延長(zhǎng)（P＜0.01），而同組雄性果蠅并未呈現(xiàn)極顯著差異（0.01＜P＜0.05）。以往同類研究表明[19,32]，由于對(duì)受試藥物的適應(yīng)性與敏感性不同，雌、雄果蠅的壽命實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)存在差異，因此可推測(cè)本實(shí)驗(yàn)中雌性果蠅對(duì)龜肉蛋白肽更為敏感。

2.5 龜肉蛋白肽對(duì)果蠅體內(nèi)抗氧化活性的影響

抗氧化酶如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）可以清除機(jī)體的多余活性氧，從而實(shí)現(xiàn)體內(nèi)自由基的動(dòng)態(tài)平衡[32-34]，二者的活性是評(píng)價(jià)機(jī)體自由基清除能力的間接指標(biāo)。丙二醛（malondialdehyde，MDA）是多不飽和脂肪酸等脂質(zhì)在氧自由基作用下發(fā)生氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性，通常會(huì)隨年齡的增大而增多[35]，其含量是間接反應(yīng)脂質(zhì)氧化程度的重要指標(biāo)[36]。

如表7 所示，隨著果蠅年齡的增長(zhǎng)，40 d 時(shí)SOD活性較20 d 普遍降低。0.4%龜肉蛋白肽組雌性果蠅20 d 和40 d 的SOD 活性均較對(duì)照組顯著增強(qiáng)（P＜0.05），同組雄性果蠅20 d 的SOD 活性顯著增強(qiáng)（P＜0.05），但40 d 時(shí)無(wú)顯著差異（P＞0.05）。0.8%龜肉蛋白肽組雌、雄果蠅20 d 和40 d 的SOD 活性均較對(duì)照組顯著增強(qiáng)（P＜0.05），其中雌性果蠅20 d 時(shí)極顯著增強(qiáng)（P＜0.01）。綜上所述，龜肉蛋白肽能有效提高果蠅SOD 活性，最佳劑量為0.8%，且對(duì)雌性果蠅SOD 活性的提升效果好于雄性。

表7 不同劑量龜肉蛋白肽對(duì)果蠅體內(nèi)SOD 活性的影響Table 7 Effects of different doses of PTPDP on SOD activity of D. melanogaster

如表8 所示，0.2%和0.4%龜肉蛋白肽喂養(yǎng)雌性果蠅20 d 和40 d 的CAT 活性較對(duì)照組分別顯著增加（P＜0.05）、極顯著增加（P＜0.01），而同劑量喂養(yǎng)的雄性果蠅CAT 活性則沒有顯著增強(qiáng)（P＞0.05）。0.8%龜肉蛋白肽組雌性果蠅20 d 和40 d 的CAT活性極顯著增加（P＜0.01），雄性果蠅20 d 時(shí)顯著增加（P＜0.05），40 d 時(shí)極顯著增加（P＜0.01）。綜上所述，龜肉蛋白肽能有效提高果蠅CAT 活性，最佳劑量為0.8%，對(duì)雌性果蠅作用效果較好。

表8 不同劑量龜肉蛋白肽對(duì)雌、雄果蠅體內(nèi)CAT活性的影響Table 8 Effects of different doses of PTPDP on CAT activity of female and male D. melanogaster

如表9 所示，與空白對(duì)照相比，0.2%龜肉蛋白肽飼養(yǎng)的果蠅體內(nèi)MDA 含量無(wú)顯著性變化（P＞0.05）。0.4%龜肉蛋白肽組雄果蠅40 d 的MDA 含量與對(duì)照組相比顯著減少（P＜0.05）。喂食0.8%龜肉蛋白肽的雌、雄果蠅在20 d 和40 d 的體內(nèi)MDA 含量均顯著減少（P＜0.05）。綜上所述，0.8%龜肉蛋白肽能有效降低果蠅體內(nèi)MDA 含量。

表9 不同劑量龜肉蛋白肽對(duì)雌、雄果蠅體內(nèi)MDA含量的影響Table 9 Effects of different doses of PTPDP on MDA content of female and male D. melanogaster

2.6 龜肉蛋白肽對(duì)果蠅基因表達(dá)的影響

Sod1、Sod2和Cat基因的表達(dá)分別影響超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性，是評(píng)價(jià)生物體抗氧化能力的常用指標(biāo)[4,37]。mth基因的表達(dá)量被認(rèn)為與壽命呈負(fù)相關(guān)性，研究表明mth發(fā)生突變會(huì)使成年果蠅的平均壽命會(huì)延長(zhǎng)35%[38]。Rpn11基因的表達(dá)可以減少衰老相關(guān)的泛素化蛋白在體內(nèi)積累，從而延長(zhǎng)果蠅壽命[39]。

如圖2 所示，與對(duì)照組相比，使用0.8%龜肉蛋白肽培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)組雌性果蠅體內(nèi)的抗氧化相關(guān)基因Sod1、Sod2和Cat的表達(dá)量均有上升，其中Sod1和Sod2基因的表達(dá)量顯著上升（P＜0.05），Cat基因的表達(dá)量極顯著上升（P＜0.01）。壽命相關(guān)基因mth基因的表達(dá)量極顯著下降（P＜0.01），而Rpn11的表達(dá)量極顯著上升（P＜0.01）。綜上所述，0.8%龜肉蛋白肽通過(guò)上調(diào)抗氧化相關(guān)基因Sod1、Sod2、Cat和壽命相關(guān)基因Rpn11的表達(dá)，以及下調(diào)壽命相關(guān)基因mth的表達(dá)來(lái)延長(zhǎng)果蠅壽命。

圖2 0.8% PTPDP 喂養(yǎng)的雌性果蠅基因表達(dá)Fig.2 Gene expressions of female D. melanogaster fed by 0.8% PTPDP

3 結(jié)論

本研究酶解烏龜肉得到大量1000 Da 以下的小分子肽段，龜肉蛋白肽富含甘氨酸、谷氨酸和脯氨酸等多種具有抗氧化活性的氨基酸。0.2%、0.4%和0.8%的龜肉蛋白肽都可以有效延長(zhǎng)果蠅壽命，提高果蠅體內(nèi)多項(xiàng)抗氧化活性指標(biāo)，其中喂食0.8%龜肉蛋白肽的作用效果最佳。同等劑量下，相較雄性果蠅，雌性果蠅對(duì)龜肉蛋白肽更為敏感。0.8%的龜肉蛋白肽通過(guò)上調(diào)抗氧化相關(guān)基因Sod1、Sod2、Cat和壽命相關(guān)基因Rpn11的表達(dá)，以及下調(diào)壽命相關(guān)基因mth的表達(dá)來(lái)延長(zhǎng)果蠅壽命。綜上所述，本研究的結(jié)果表明龜肉蛋白肽具有潛在的抗衰老功效，為后續(xù)相關(guān)醫(yī)藥產(chǎn)品或保健食品的開發(fā)與應(yīng)用提供了一定的參考。由于衰老的機(jī)制較為復(fù)雜，且果蠅與人類在許多層面上差異較大，后續(xù)研究可以使用小鼠等哺乳動(dòng)物作為模型，為深度探究龜肉蛋白肽的抗衰老功能和作用機(jī)制，提供更詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。