侯亞男 馮昆

摘要：中藥迎來現(xiàn)代化，既是機(jī)遇，也是挑戰(zhàn)。微生物轉(zhuǎn)化定義為指微生物在代謝過程中產(chǎn)生的一類或一系列酶對(duì)底物的催化或修飾反應(yīng)。微生物轉(zhuǎn)化可以將現(xiàn)代生物技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和傳統(tǒng)中藥的優(yōu)勢(shì)融合在一起，通過氧化還原，糖基化，羥基化，水解等主要反應(yīng)對(duì)中藥活性成分進(jìn)行修飾，產(chǎn)生新物質(zhì)，增效減毒，降低成本，改善生物利用度等。盡管微生物轉(zhuǎn)化擁有種類繁多，條件溫和，酶系豐富等優(yōu)勢(shì)，但是也存在菌種選育困難，特異性差，盲目性大等缺點(diǎn)。筆者對(duì)微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用以及該技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行綜述，以期為其廣泛應(yīng)用提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：中藥;微生物轉(zhuǎn)化;酶反應(yīng);減毒增效;反應(yīng)類型

中圖分類號(hào)：R28??文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??文章編號(hào)：1007-2349（2019）12-0066-04

中藥是我國(guó)傳統(tǒng)特有藥物，歷經(jīng)了幾千年的傳承與發(fā)展。近年來，隨著中藥對(duì)各種疾病的預(yù)防與治療作用的顯現(xiàn)，使得中藥及其活性成分成為全世界研究的熱點(diǎn)之一。而中藥現(xiàn)代化戰(zhàn)略的逐步推行，讓中藥發(fā)展迎來了新一輪的挑戰(zhàn)與機(jī)遇[1]。利用生物催化技術(shù)可將現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)中藥的優(yōu)勢(shì)整合到一起，是中藥現(xiàn)代化的實(shí)現(xiàn)過程中一種有效的手段。生物催化是指將天然存在的或人工合成的化合物作為底物，添加到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微生物中，并在合適的條件下培養(yǎng)一定時(shí)間，使得底物與全細(xì)胞中的酶系發(fā)生相互作用，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)改變[2]。生物催化的主要技術(shù)之一便是微生物轉(zhuǎn)化。微生物種類多、數(shù)量大，底物特異性強(qiáng)，在進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化時(shí)反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)品純度高、無環(huán)境污染。最早的微生物轉(zhuǎn)化是使用環(huán)境中野生的微生物來發(fā)酵釀酒。此后，在發(fā)酵過程中進(jìn)一步添加中草藥，以促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)和繁殖，進(jìn)而得到了可以使用的各種藥曲[3]。在上世紀(jì) 80 年代期間，研究的重點(diǎn)定位于單一微生物發(fā)酵，主要是微生物進(jìn)行自身的發(fā)酵以產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的過程，如冬蟲夏草菌絲體以及靈芝菌絲體等。然而如今研究的重點(diǎn)已經(jīng)從單味藥或單一成分轉(zhuǎn)變至復(fù)方成分，且已經(jīng)有相應(yīng)的中藥產(chǎn)品應(yīng)用于臨床，如對(duì)麝香、三七、蛇膽和牛黃等中藥進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化而得到的中成藥片仔癀[4]。筆者以近五年的最新研究進(jìn)展為基礎(chǔ)對(duì)微生物轉(zhuǎn)化在中藥上的應(yīng)用以及其涉及的主要化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行綜述，并對(duì)微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)，以期為微生物轉(zhuǎn)化的進(jìn)一步研發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1?微生物轉(zhuǎn)化在中藥上的應(yīng)用

1.1?增加天然活性先導(dǎo)化合物來源?天然活性先導(dǎo)化合物是指由微生物或動(dòng)植物在代謝過程中產(chǎn)生的一大類天然化合物。雖然其結(jié)構(gòu)新穎、擁有一定的生理活性，但是也具有活性弱、特異性低、毒副反應(yīng)明顯、體內(nèi)代謝不合理等缺陷導(dǎo)致不能直接藥用。通過微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)來修飾天然活性先導(dǎo)化合物，一方面優(yōu)化已知先導(dǎo)化合物的生物學(xué)性質(zhì)，另一方面獲得新的先導(dǎo)化合物。王照華[5]使用刺孢小克銀漢霉（Cunninghamella echinulata）和日根霉（Rhizopus japonicus）對(duì)厚樸酚、和厚樸酚進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到了17個(gè)新的化合物，對(duì)獲得先導(dǎo)化合物有重要意義。Han等[6]發(fā)現(xiàn)，通過藍(lán)色犁頭霉（Absidia coerulea）對(duì)補(bǔ)骨脂素進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化后得到三種代謝物，其中兩種為新的黃烷酮化合物。

1.2?增強(qiáng)中藥藥效?中藥經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化后可提高藥效，其作用機(jī)理是提高其有效成分的含量及比例，或是其有效成分與微生物在轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)生了協(xié)同作用。石鳳敏等[7]用靈芝菌對(duì)茯苓的微生物轉(zhuǎn)化研究顯示，茯苓不僅對(duì)靈芝菌生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，并且靈芝菌總多糖和總?cè)频暮匡@著增加。Yang等[8]發(fā)現(xiàn)，利用光合細(xì)菌（Phtosynthetic bacteria）對(duì)槲寄生的活性成分進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，槲寄生在體內(nèi)和體外的抗腫瘤活性效果都得到顯著的提升。

1.3?降低毒性?某些中藥的毒副作用大大的影響了其在臨床上的使用。通過安全性較高的藥用真菌對(duì)中藥進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化可以分解中藥里的有毒物質(zhì)，從而達(dá)到降低毒性的效果。馬兜鈴酸A因較強(qiáng)的腎毒性及致癌性而限制了馬兜鈴屬的使用，曹藝等[9]發(fā)現(xiàn)，通過枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）對(duì)馬兜鈴酸A生物轉(zhuǎn)化，可降低該物質(zhì)的含量。有研究發(fā)現(xiàn)，以靈芝菌株作為發(fā)酵真菌、生川烏為藥性基質(zhì)，經(jīng)固體微生物轉(zhuǎn)化后，酵制川烏呈低弱的毒性和更為顯著的抗腫瘤活性[10]。除此之外，謝少朵等[11]從雷公藤莖中分離出4株對(duì)雷公藤提取物具有轉(zhuǎn)化活性的菌株，以達(dá)到增效減毒的效果。

1.4?改善生物利用度?大部分中藥被制為湯劑經(jīng)口服進(jìn)入體內(nèi)后，其有效成分被腸道微生物轉(zhuǎn)化，成為藥理活性更強(qiáng)、生物利用度更高的代謝產(chǎn)物。柚皮素是柚皮苷的苷元，具有抗菌、抗炎和抗癌等生物活性。陳靜等[12]從健康人腸道微生物菌群中分離出四株能將柚皮苷高效轉(zhuǎn)化為柚皮素的菌株。楊艷等[13]發(fā)現(xiàn)，腸道微生物酶可轉(zhuǎn)化多酚成為小分子酚酸，后者能被腸道直接吸收，顯著提高了多酚的生物利用度。桑尚源等[14]發(fā)現(xiàn)，在腸道微生物的作用下，大豆皂苷Ⅱ被轉(zhuǎn)化為大豆皂苷Ⅳ，最終被轉(zhuǎn)化為大豆苷元B，這一過程表明其糖基被逐步水解成相對(duì)分子量更小，更易被吸收的代謝物。

1.5?降低成本?隨著基因工程和微生物工程的快速發(fā)展，也帶動(dòng)了微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的進(jìn)步，酶的大量體外表達(dá)已經(jīng)成為可能，這便使得藥物生產(chǎn)所用的成本進(jìn)一步降低。鄭晨等[15]利用黑曲霉JH-2菌株微生物轉(zhuǎn)化燈盞乙素得到野黃芩素，該酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物降解性低弱，專一性較高，并且能顯著提高野黃芩素的轉(zhuǎn)化得率和產(chǎn)率，避免了現(xiàn)有野黃芩素生產(chǎn)方法的不足，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。此外，梅建鳳等[16]選育出一株桔青霉（Penicillium citrinum）LB菌株，能轉(zhuǎn)化連翹苷為連翹素，其轉(zhuǎn)化率高達(dá)94.1%，具有方法簡(jiǎn)便、產(chǎn)物易純化、副產(chǎn)物少和成本較低等優(yōu)點(diǎn)。本課題組運(yùn)用靈芝菌對(duì)參芪藥渣進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化后制得生物飼料添加劑，能顯著提高家禽的抗氧化能力，既解決了中藥渣存在的浪費(fèi)問題，又降低了飼料的生產(chǎn)成本。

1.6?建立中藥藥代動(dòng)力學(xué)研究的體外模型?某些中藥的有效成分在微生物中的轉(zhuǎn)化途徑不僅與在哺乳類動(dòng)物體內(nèi)的代謝機(jī)制類似，而且其轉(zhuǎn)化所得產(chǎn)物的分離純化過程相對(duì)簡(jiǎn)單。因此，微生物轉(zhuǎn)化體系有助于中藥代謝產(chǎn)物的微量甚至痕量分析，為藥物體內(nèi)代謝研究及毒理學(xué)的體外模型構(gòu)建提供科學(xué)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)研究表明，將大鼠腸道菌群和小檗堿進(jìn)行體外厭氧共培養(yǎng)，通過一系列反應(yīng)后，小檗堿被轉(zhuǎn)化為小檗紅堿，藥根堿等5種代謝產(chǎn)物[17]。周立華[18]發(fā)現(xiàn)，短刺小克銀漢霉（Aureobasidium blakesleeana）可將雷諾嗪轉(zhuǎn)化為羥基化雷諾嗪、雷諾嗪硫酸酯結(jié)合物等9種代謝產(chǎn)物，此轉(zhuǎn)化結(jié)果與哺乳動(dòng)物體內(nèi)代謝的結(jié)果相似，故可作為哺乳類動(dòng)物代謝的體外模型。

2?微生物轉(zhuǎn)化主要反應(yīng)類型

微生物在轉(zhuǎn)化過程中常對(duì)中藥有效成分分子結(jié)構(gòu)中的糖苷基、羥基、?；戎饕鶊F(tuán)進(jìn)行修飾。由于微生物的酶系豐富，且具有特異性，因此可以對(duì)同一化合物進(jìn)行不同位點(diǎn)、不同基團(tuán)的結(jié)構(gòu)修飾，從而得到更多的衍生化合物。例如，環(huán)化酶誘導(dǎo)環(huán)化反應(yīng)的發(fā)生，通過改變結(jié)構(gòu)來增強(qiáng)活性;糖基化酶催化底物產(chǎn)生糖化反應(yīng)形成糖苷鍵;羥基化酶可特異性的在反應(yīng)底物的特定基團(tuán)上插入羥基。除此以外，大部分微生物體內(nèi)含有多種酶系，能誘導(dǎo)多種類型的反應(yīng)發(fā)生，獲得一系列的相關(guān)衍生物。如短刺小克銀漢霉在對(duì)不同的底物進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化時(shí)能催化不同的反應(yīng)類型（見表1），以期產(chǎn)生不同的效果。

2.1?氧化還原反應(yīng)?檸檬烯是一種天然的功能性單萜化合物，在臨床上可用于利膽，溶石，祛痰，以及治療癌癥，主要存在于植物精油中。因此臺(tái)亞楠等[22]通過微生物轉(zhuǎn)化檸檬烯來獲得含氧衍生物，進(jìn)而制備單萜芳香產(chǎn)品。此外，利用棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）產(chǎn)生的氧化還原酶對(duì)甜菊糖進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化使之成為甜菊醇，后者是甜菊糖的苷元，結(jié)構(gòu)為對(duì)映-貝殼杉烯型四環(huán)二萜，是新藥研究的骨架之一[23]。

2.2?水解反應(yīng)?薯蕷皂苷素是甾體激素工業(yè)中的重要起始物質(zhì)，具有抗炎、抗癌以及避孕等多種生物活性。馬迎迎等[24]發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元能通過利用赤霉菌（Gibberella intermedia）WX-12轉(zhuǎn)化薯蕷皂苷獲得，分離純化出該菌株的糖苷酶后發(fā)現(xiàn)其只能水解甾體皂苷上C-3位的糖苷鍵。ZHOU等[25]通過擬青霉（Paecilomyces bainier）sp.229從人參皂苷Rb1的放大發(fā)酵中純化出三種化合物，分別是已知的3-酮衍生物和兩種新的脫氫代謝物。此外，姚磊等[26]發(fā)現(xiàn)納豆菌能將漢黃芩苷和黃芩苷中的β-葡萄糖醛酸水解成生成漢黃芩素和苷元黃芩素。

2.3?糖基化反應(yīng)?微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的生物活性經(jīng)糖基化修飾后會(huì)得到優(yōu)化，如轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄?、結(jié)合態(tài)化合物，從而進(jìn)一步提高其生物利用度。蓋曉紅等[27]以二氫去氫雙松柏醇為反應(yīng)底物，以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為轉(zhuǎn)化菌株將底物完全轉(zhuǎn)化，得到二氫去氫雙松柏醇-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等三種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。α和γ-mangostin是山竹果皮中主要的氧雜蒽酮類化合物，生物活性顯著，但是其水溶性較差，導(dǎo)致生物利用度低，賀巒[21]選用短刺小克銀漢霉（Aureobasidium blakesleeana）對(duì)其進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，得到四個(gè)化合物均為新的氧雜蒽酮類衍生物，且微生物轉(zhuǎn)化均為發(fā)生在底物C3位上的特異性糖基化反應(yīng)。此外，林福建[28]使用花斑曲霉（Aspergillus versicolor）優(yōu)化人參三醇型皂苷以及人參二醇型皂苷特定位點(diǎn)上的糖基結(jié)構(gòu)，使得含量相對(duì)較高的人參皂苷糖基被定向轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷或苷元。

2.4?羥基化反應(yīng)?馬媛等[19]通過絲狀真菌短刺小克銀漢霉（Aureobasidium blakesleeana）CGMCC-3.970對(duì)甘草次酸進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化研究，獲得3-酮基-15α-羥基-18β-甘草次酸（1）等6個(gè)產(chǎn)物，暗示短刺小克銀漢霉對(duì)甘草次酸具有選擇性酮基化及羥基化作用。香青藤中含有大量的阿樸菲生物堿，董建偉等[29]采用克隆氏菌（Clonostachys rogersoniana）發(fā)酵后能夠轉(zhuǎn)化為相對(duì)應(yīng)的4R-羥基阿樸菲生物堿。此外，丁中濤等[30]也發(fā)現(xiàn)通過Clonostachys sp.發(fā)酵可完全轉(zhuǎn)化荷包牡丹堿成為（4S，6aR）4羥基荷包牡丹堿。

3?微生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)勢(shì)與不足

3.1?微生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)勢(shì)?微生物的大量存在帶來了豐富的酶，其反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)類型廣泛，在轉(zhuǎn)化中藥上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，具體如下：（1）微生物種類繁多，可供大規(guī)模地篩選。（2）微生物在生活史中會(huì)產(chǎn)生各種各樣的酶，包括蛋白水解酶、甘油酯水解酶、淀粉酶、纖維素酶、木質(zhì)素酶等，這些酶系是高效生物催化體系的核心物質(zhì)，多用于催化一些難以進(jìn)行化學(xué)合成的反應(yīng)。（3）微生物轉(zhuǎn)化具有高度反應(yīng)特異性，對(duì)映體特異性和區(qū)域特異性。（4）利用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)來改變反應(yīng)底物特定官能團(tuán)時(shí)不需要對(duì)其他基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，顯示出極高的選擇性。（5）微生物轉(zhuǎn)化所需要的反應(yīng)條件十分溫和。一般在中性pH，室溫，常壓下即可完成反應(yīng)，使中藥的有效成分在轉(zhuǎn)化過程中得到保護(hù)，能有效的打破中藥在傳統(tǒng)制備過程中無法完全提取有效成分的局限。（6）通過優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件能提高產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率。一方面可適當(dāng)添加誘導(dǎo)物、底物、表面活性劑、酶抑制劑，另一方面調(diào)整微生物在生長(zhǎng)代謝過程中所需的能量比例，以此來解決在轉(zhuǎn)化中藥時(shí)遇到的某些成分溶難溶、底物和產(chǎn)物抑制酶活性、副產(chǎn)物多、產(chǎn)物被生物降解等難題。此外，微生物轉(zhuǎn)化中藥的反應(yīng)可連續(xù)進(jìn)行[31]。（7）可進(jìn)行氧化、環(huán)氧化、還原、羥基化、酮基化、?；⑼榛?、糖基化、酯化、水解等多種類型的反應(yīng)，產(chǎn)生新物質(zhì)并且為中藥活性成分結(jié)構(gòu)修飾提供新途徑。（8）合理利用中藥，節(jié)省藥材資原，一般不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。（9）很大程度上推動(dòng)了中藥現(xiàn)代化的進(jìn)程和新藥的開發(fā)，尤其是在改進(jìn)中藥劑型、提高中藥療效等方面提供了新的思路和技術(shù)手段，符合中藥發(fā)展戰(zhàn)略。

3.2?微生物轉(zhuǎn)化的不足?由于中藥現(xiàn)代化歷程尚為短暫，且中藥成分復(fù)雜，使得微生物轉(zhuǎn)化中藥仍然處于研究初期階段，并存在一些需要改進(jìn)的不足之處。（1）菌種的選育與分離篩選是中藥微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。自然界分離篩選的效率低下。（2）現(xiàn)階段的微生物轉(zhuǎn)化尚具有較大的盲目性。微生物轉(zhuǎn)化主要是通過底物與微生物混合體系發(fā)酵進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，這個(gè)過程變量多、體系復(fù)雜、難以進(jìn)行分解研究，在合成上無法進(jìn)一步闡述真正催化化學(xué)反應(yīng)的酶系特點(diǎn)。（3）特異性差。若菌株發(fā)生變異，酶系類型也可能發(fā)生變化?，F(xiàn)階段微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物并不能提前預(yù)測(cè)反應(yīng)結(jié)果，更難以從底物合成目標(biāo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化后的成分鑒定和純化工作繁雜。（4）若轉(zhuǎn)化的底物有毒性，會(huì)殺死微生物導(dǎo)致轉(zhuǎn)化無法進(jìn)行。

針對(duì)以上不足，我們可以綜合運(yùn)用物理化學(xué)誘變技術(shù)、基因重組工程技術(shù)和原生質(zhì)體融合技術(shù)選育優(yōu)良菌種。同時(shí)，應(yīng)增加對(duì)微生物轉(zhuǎn)化菌株酶系的研究，利用多種生化手段，對(duì)轉(zhuǎn)化酶系的分離、提純、表征和功能進(jìn)行研究，闡明底物在特定酶系下的轉(zhuǎn)化過程和轉(zhuǎn)化機(jī)制，最終實(shí)現(xiàn)微生物轉(zhuǎn)化的機(jī)制清楚和目標(biāo)可控的目標(biāo)[32]。

4?展望

二十一世紀(jì)以來，微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)加快了中藥現(xiàn)代化建設(shè)的進(jìn)程，但由于我國(guó)對(duì)于微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的系統(tǒng)研究歷程較短以及中藥的成分十分復(fù)雜，導(dǎo)致微生物轉(zhuǎn)化中藥的應(yīng)用還處于一個(gè)研究初級(jí)階段，對(duì)于大規(guī)模的工業(yè)化研究生產(chǎn)上不適用。隨著交叉學(xué)科及技術(shù)的發(fā)展，微生物轉(zhuǎn)化這一新興技術(shù)在中藥新藥研究開發(fā)中占有越來越重要的地位，對(duì)形成具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新藥具有極其廣闊的前景，微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)對(duì)中藥的應(yīng)用也越發(fā)廣泛。在接下來的研究中，要合理的聯(lián)合基因、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、代謝工程和固定化酶等技術(shù)進(jìn)行篩選，培育以及改建菌株來獲取對(duì)我們有益的微生物，并深入探討該微生物發(fā)生轉(zhuǎn)化的機(jī)理與途徑，從而進(jìn)一步簡(jiǎn)化中藥有效成分的分離純化過程，高效率、高產(chǎn)率地獲得目標(biāo)產(chǎn)物，達(dá)到微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)大規(guī)模應(yīng)用于中藥工業(yè)化生產(chǎn)與制備的目的。綜上所述，微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)為加快中藥走向現(xiàn)代化及國(guó)際化，增強(qiáng)中藥的國(guó)際影響力發(fā)揮了重要的作用，值得進(jìn)一步探究。

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（收稿日期：2019-07-19）