李霽，張劍鋒，盧俊宇，葉喆，周志兵，羅毅灃，李帥

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南寧530021；2 廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院)

百草枯是一種廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)活動(dòng)中的快速滅生性除草劑。百草枯對(duì)人體的毒性較強(qiáng)，急性中毒可以導(dǎo)致肺、腎、肝等多器官功能損害，尚無(wú)特效解毒劑，是臨床上常見(jiàn)的致死率較高的急危重癥之一，其致死率高達(dá)60%～70%[1]。研究[2]顯示，百草枯中毒致急性腎損傷患者比例>50%，合并急性腎損傷時(shí)患者死亡率>80%。因此，研究百草枯中毒導(dǎo)致的急性腎損傷治療是當(dāng)下救治此類中毒患者的思路之一。我們課題組在前期研究[3]中發(fā)現(xiàn)，百草枯中毒導(dǎo)致急性腎損傷時(shí)會(huì)出現(xiàn)IL-6、NF-κB升高，證實(shí)炎癥反應(yīng)是白草枯中毒導(dǎo)致急性腎損傷的機(jī)制之一。此外，血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)被認(rèn)為是一種重要的炎癥介質(zhì)，介導(dǎo)炎癥的反應(yīng)過(guò)程，急性腎損傷的發(fā)生與腎素——血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的過(guò)度活動(dòng)密切相關(guān)[4]。有研究[5]指出，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)可減少炎癥因子的表達(dá)，而卡托普利是臨床上常用的ACEI，其是否對(duì)白草枯中毒致急性腎損傷有治療作用，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。2017年3月～2018年4月，我們采用百草枯灌胃法建立大鼠急性腎損傷模型，在此基礎(chǔ)上給予卡托普利灌胃治療，并觀察大鼠腎組織病理變化和腎組織中TNF-α、NF-κB表達(dá)及血清IL-6水平變化，探討卡托普利對(duì)百草枯中毒導(dǎo)致的大鼠急性腎損傷可能的治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器 SPF級(jí)雄性SD大鼠54只，體質(zhì)量200 g左右，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。所有大鼠在室溫(20±2)℃下普通飼料飼養(yǎng)，自由進(jìn)水。二氯百草枯結(jié)晶體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，卡托普利粉劑購(gòu)自美國(guó)Solarbio公司。TNF-α、NF-κB一抗分別購(gòu)于GeneTeX公司和CST公司，IgG二抗購(gòu)于美國(guó)Milipore公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司，ELISA試劑盒購(gòu)于華美公司。目的基因引物序列設(shè)計(jì)合成由南寧科迪公司完成，目的基因堿基序列：β-actin上游引物為5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物為5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′；NF-κB上游引物為5′-CAATCAGCCAGCCAACCA-3′，下游引物為5′-CCTTTCCTTTCCTCCCCATC-3′；TNF-α上游引物為5′-GGCGTGTTCATCCGTTCTC-3′，下游引物為5′-CTTCAGCGTCTCGTGTGTTTCT-3′。

1.2 急性腎損傷大鼠模型的建立與卡托普利給予方法 將54只雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字法平均分成卡托普利組(Cap組)、染毒組(PQ組)及對(duì)照組(NS組)，每組18只。實(shí)驗(yàn)首日Cap組和PQ組利用百草枯溶液(100 mg/kg)灌胃法建立急性腎損傷模型，NS組利用等量生理鹽水建立空白對(duì)照；急性腎損傷模型建立后，Cap組大鼠立即使用卡托普利溶液(2 mL/kg)灌胃，PQ組和NS組大鼠立即使用生理鹽水(2 mL/kg)灌胃。每間隔24 h Cap組給予卡托普利溶液(2 mL/kg)灌胃、PQ組和NS組給予生理鹽水(2 mL/kg)灌胃，常規(guī)飼養(yǎng)，觀察大鼠一般情況。于模型建立后第1、3、7天分三批次處置大鼠，每批次6只：麻醉后打開(kāi)大鼠腹腔，取左側(cè)腎臟在4%多聚甲醛中浸泡24 h固定，用于腎組織病理學(xué)觀察；取右側(cè)腎臟組織用于TNF-α、NF-κB檢測(cè)；于腹主動(dòng)脈處用一次性靜脈采血針取血，靜置至分層后離心，取上清液用于血清IL-6水平檢測(cè)。

1.3 各組大鼠腎組織病理學(xué)檢查方法 固定后的左腎組織常規(guī)石蠟包埋、切片，待經(jīng)過(guò)脫蠟處理后，行HE染色，應(yīng)用病理圖像分析系統(tǒng)，使用光學(xué)顯微鏡對(duì)腎組織的病理變化進(jìn)行觀察。根據(jù)劉芙蓉等[6]報(bào)道的評(píng)級(jí)方法，對(duì)大鼠腎組織損傷情況進(jìn)行評(píng)級(jí)：正常腎組織評(píng)定為0級(jí)，腎組織輕度損傷評(píng)定為I級(jí)，腎組織中度損傷評(píng)定為Ⅱ級(jí)，腎組織重度損傷評(píng)定為Ⅲ級(jí)。

1.4 各組大鼠腎組織中TNF-α、NF-κB蛋白的檢測(cè) 采用免疫組化法。取各組腎組織切片，高壓修復(fù)，血清封閉，分別滴加TNF-α一抗(1∶400)、NF-κB一抗(1∶800)孵育過(guò)夜，次日沖洗后加二抗孵育、顯色、封片，使用光學(xué)顯微鏡檢測(cè)TNF-α、NF-κB蛋白的表達(dá)情況。每張切片使用400倍光學(xué)顯微鏡取5個(gè)不同的視野，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。陽(yáng)性細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)：胞漿內(nèi)可見(jiàn)棕黃色顆粒。

1.5 各組大鼠腎組織中TNF-α、NF-κB mRNA的檢測(cè) 采用qRT-PCR法。使用TRIzol試劑對(duì)腎組織總RNA進(jìn)行提取，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄RNA成cDNA。內(nèi)參選用β-actin，選擇20 μL體系進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，40個(gè)循環(huán)(95 ℃變性10 s，60 ℃退火、延伸30 s)。用2-△△Ct表示受檢組織中TNF-α、NF-κB mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 各組大鼠血清IL-6檢測(cè) 血清解凍后離心，使用ELISA試劑盒對(duì)血清IL-6進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書的具體操作要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，NS組大鼠進(jìn)食正常，毛發(fā)良好，精神狀態(tài)良好，行動(dòng)靈活，口鼻無(wú)分泌物。PQ組大鼠進(jìn)食、飲水量較NS組減少，毛發(fā)蓬松稀疏，精神疲、行動(dòng)緩慢，易激惹，口唇及鼻部偶見(jiàn)血性分泌物。Cap組大鼠可見(jiàn)與PQ組類似的中毒癥狀，但癥狀較PQ組輕。

2.1 各組大鼠腎組織病理學(xué)變化 光鏡下NS組可見(jiàn)清晰完整的腎單位結(jié)構(gòu)，腎間質(zhì)未見(jiàn)水腫、充血及炎性細(xì)胞，評(píng)級(jí)0級(jí)。PQ組染毒第1天即可見(jiàn)腫大的腎小管上皮細(xì)胞，偶見(jiàn)浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞及空泡變性，同時(shí)伴有管腔狹窄；染毒后第3、7天腎小管上皮細(xì)胞可見(jiàn)大片空泡變性、壞死，腎間質(zhì)可見(jiàn)明顯充血水腫，伴有大量浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞，評(píng)級(jí)Ⅲ級(jí)。Cap組在卡托普利干預(yù)后第1天與PQ組病理改變類似，第3天與第1天相比仍存在壞死及空泡變性的腎小管上皮細(xì)胞，同時(shí)伴有管腔狹窄，腎間質(zhì)可見(jiàn)浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞及大量的充血水腫，但情況稍有改善；第7天與第3天比較，腎間質(zhì)水腫減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，管腔呈現(xiàn)輕度狹窄，同時(shí)腎小管上皮細(xì)胞情況改善，可見(jiàn)壞死、空泡變性減少，評(píng)級(jí)Ⅱ級(jí)。上述各組各時(shí)間點(diǎn)病理結(jié)果如圖1所示。

2.2 各組大鼠腎組織中TNF-α、NF-κB蛋白和mRNA的表達(dá)比較 Cap組和PQ組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)腎組織中TNF-α、NF-κB蛋白和mRNA的表達(dá)量均高于NS組(P均<0.05)；Cap組第3、7天大鼠腎組織中TNF-α、NF-κB蛋白和mRNA的表達(dá)量明顯低于PQ組(P均<0.05)。Cap組第7天大鼠腎組織中TNF-α、NF-κB 蛋白和mRNA的表達(dá)量較第1、3天明顯降低(P均<0.05)，總體呈現(xiàn)出一定的下降趨勢(shì)；PQ組第3天大鼠腎組織中TNF-α、NF-κB蛋白和mRNA的表達(dá)量較第1、7天明顯升高(P均<0.05)，達(dá)峰值；詳見(jiàn)表1。

圖1 大鼠腎組織病理學(xué)變化

2.3 各組大鼠血清IL-6水平比較 Cap組和PQ組在各時(shí)間點(diǎn)大鼠血清IL-6水平均高于NS組(P均<0.05)；Cap組第3、7天大鼠血清IL-6水平明顯低于PQ組(P均<0.05)。Cap組第7天大鼠血清IL-6水平較第1、3 d明顯降低(P均<0.05)，總體呈現(xiàn)出一定的下降趨勢(shì)；PQ組第3天大鼠血清IL-6水平較第1、7天明顯升高(P均<0.05)，達(dá)峰值；詳見(jiàn)表2。

表1 第1、3、7天各組大鼠腎組織中TNF-α、NF-κB蛋白和mRNA的表達(dá)比較

注：與NS組相比，﹡P<0.05；與PQ組相比，﹟P<0.05；與同組第1天相比，△P<0.05；與同組第3天相比，☆P<0.05。

注：與NS組相比，﹡P<0.05；與PQ組相比，﹟P<0.05；與同組第1天相比，△P<0.05；與同組第3天相比，☆P<0.05。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用百草枯灌胃法構(gòu)建大鼠急性腎損傷模型，病理形態(tài)學(xué)可見(jiàn)各時(shí)間點(diǎn)腎組織細(xì)胞損傷程度不同，腎小管上皮細(xì)胞可見(jiàn)大片空泡變性、壞死，腎間質(zhì)可見(jiàn)明顯水腫充血，伴有大量浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞；腎組織中NF-κB、TNF-α蛋白和mRNA表達(dá)量及血清IL-6水平顯著升高，表明百草枯中毒大鼠急性腎損傷模型建立成功。

炎癥反應(yīng)是百草枯中毒的主要機(jī)制之一。Xu等[7]發(fā)現(xiàn)，百草枯中毒導(dǎo)致急性腎損傷通過(guò)激活多種炎癥因子參與到腎臟炎癥的發(fā)生，如TNF-α、IL-6等。IL-6能上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞活化、分化，同時(shí)刺激B細(xì)胞表達(dá)抗體，激活急性期炎癥反應(yīng)[8]。IL-6循環(huán)水平的升高是炎癥反應(yīng)的可靠標(biāo)志。單核巨噬細(xì)胞可以表達(dá)TNF-α，TNF-α對(duì)細(xì)胞增殖及分化存在一定的促進(jìn)作用，同時(shí)，它能夠刺激并啟動(dòng)NF-κB相關(guān)信號(hào)通路的傳導(dǎo),因此，TNF-α被認(rèn)為是調(diào)控百草枯中毒導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)的重要因子[9]。活化的NF-κB可通過(guò)對(duì)其下游相關(guān)的炎癥因子進(jìn)行調(diào)控及其他可以激活炎癥反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)通路形成復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)[10]，通過(guò)NF-κB刺激TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18等炎癥細(xì)胞因子的合成和釋放，進(jìn)而推動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起全身炎癥反應(yīng)綜合征。腎臟是百草枯中毒損傷的主要靶器官之一，同樣存在潛在的損害[11]。NF-κB可在多種細(xì)胞內(nèi)被激活，對(duì)協(xié)調(diào)炎癥趨化因子和細(xì)胞因子基因的表達(dá)起關(guān)鍵性調(diào)控作用，是激活并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)較為關(guān)鍵的信號(hào)通路[12]。而炎癥細(xì)胞因子的釋放會(huì)對(duì)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生正反饋效應(yīng)，進(jìn)一步激活NF-κB，同時(shí)觸發(fā)局部炎癥，激活中性粒細(xì)胞，加快炎癥反應(yīng)的進(jìn)展，造成腎小管細(xì)胞的壞死[13]。本研究結(jié)果顯示，各時(shí)間點(diǎn)PQ組腎組織中NF-κB、TNF-α蛋白和mRNA的表達(dá)量、血清IL-6水平較NS組均明顯升高，這與上述研究所描述的結(jié)果一致，證實(shí)百草枯中毒導(dǎo)致急性腎損傷有炎癥反應(yīng)的參與。

Ang Ⅱ作為RAS中的主要活性物質(zhì)之一，主要作用于血管緊張素Ⅱ 1型受體(AT1R)，與其結(jié)合發(fā)揮作用。被Ang Ⅱ激活的AT1R可以直接活化NF-κB進(jìn)而激活炎癥反應(yīng)[14]。同時(shí)，Ang Ⅱ還可以調(diào)控其他能夠參與炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路，激活NF-κB，刺激IL-6、TNF-α等炎癥因子的釋放[15]。因此，Ang Ⅱ被認(rèn)為是一種重要的炎癥因子?？ㄍ衅绽堑谝活怉CEI藥物，在臨床上廣泛使用，它能有效阻止血管緊張素Ⅰ(Ang Ⅰ)轉(zhuǎn)換為Ang Ⅱ，降低Ang Ⅱ水平。研究[16～18]指出，應(yīng)用卡托普利可以抑制NF-κB的信號(hào)傳導(dǎo)，降低IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)。本研究Cap組結(jié)果顯示，與PQ組大鼠相比，卡托普利可以明顯降低第3、7天腎組織中NF-κB、TNF-α蛋白和mRNA的表達(dá)量以及血清IL-6的水平，這與上述研究報(bào)道的結(jié)果相符。此外，Cap組大鼠NF-κB、TNF-α、IL-6的含量呈逐漸下降趨勢(shì)，第3天減低不明顯，但第7天明顯減低，可以認(rèn)為卡托普利在逐漸緩解腎臟炎癥，延緩急性腎損傷病程，對(duì)百草枯中毒導(dǎo)致的急性腎損傷存在一定程度的保護(hù)作用。

綜上所述，百草枯致急性腎損傷時(shí)，卡托普利可以抑制腎組織中NF-κB、TNF-α蛋白和mRNA的表達(dá)并降低血清IL-6的水平，改善腎臟炎癥反應(yīng)，從而減輕腎臟損傷，這可能是卡托普利治療百草枯中毒導(dǎo)致急性腎損傷的作用機(jī)制之一。