王立慈，王海生，方增軍，張斌，張婕，李娟

(山東大學(xué)第二醫(yī)院，濟(jì)南250033)

研究[1]顯示，黑色素瘤的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢。目前，黑色素瘤的治療方法有放療、化療、手術(shù)治療及免疫療法[2, 3]，但是這些治療方法還存在治療效果差、不良反應(yīng)大等不足[4～6]。樹突狀細(xì)胞(DCs)是專職抗原遞呈細(xì)胞，具有捕獲、加工和遞呈抗原的能力，成熟的DCs能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞活化為腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)，能分泌共刺激分子(CD80、CD86)、主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(MHCⅡ)和細(xì)胞因子IL-12等，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[7]。因CD80、CD86、MHCⅡ、IL-12等細(xì)胞因子只能在成熟DCs中高表達(dá)，又被稱為DCs的成熟標(biāo)志分子。腫瘤組織中浸潤有大量的DCs，即腫瘤浸潤樹突狀細(xì)胞(TIDCs)，然而，腫瘤細(xì)胞及腫瘤微環(huán)境釋放因子會抑制或逆轉(zhuǎn)DCs的成熟及正常功能，導(dǎo)致黑色素瘤組織中的TIDCs處于未成熟狀態(tài)，只能表達(dá)低水平的CD80、CD86[8]、IL-12[9]和跨膜糖蛋白CD11c[10]。DCs也能分泌具有免疫抑制作用的細(xì)胞因子IL-10。腫瘤發(fā)生免疫逃逸主要?dú)w因于腫瘤特異性MHC-Ⅰ限制性CTL的活化不足，而不成熟TIDCs上低表達(dá)的共刺激分子可能是CTL激活失敗的主要原因。因此，TIDCs已成為控制腫瘤逃逸最有希望的靶標(biāo)之一。胸腺五肽(Thymopentin，TP5)是由5個氨基酸組成的短肽，能增強(qiáng)化療或放療患者受抑制的免疫功能，已被作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)劑成功用于惡性腫瘤的臨床輔助治療。報道[11]顯示，TP5能誘導(dǎo)骨髓來源樹突狀細(xì)胞(BMDCs)的成熟，促進(jìn)BMDCs表面成熟標(biāo)志分子的表達(dá)。然而，TP5能否誘導(dǎo)TIDCs的成熟還未有報道。2017年9月10日～2018年7月15日，我們觀察了不同濃度的TP5對黑色素瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的TIDCs的激活作用，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動物、TP5、試劑及儀器 黑色素瘤細(xì)胞B16為本實(shí)驗(yàn)室保存。BALB/c小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司，在室溫以及安靜的環(huán)境下進(jìn)行喂養(yǎng)，日照時間為每天7：00～19：00，由專業(yè)動物飼養(yǎng)人員每日給小鼠提供足夠的食物和水。TP5購自上海強(qiáng)耀生物科技有限公司。DMSO及胰蛋白酶購自碧云天生物技術(shù)有限公司。血清購自GIBCO公司，培養(yǎng)基購自BI公司。ELISA試劑盒購自江蘇科晶生物科技有限公司。PE-CD86、APC-MHCⅡ、FITC-CD11c購自美國Biolegend公司。IL-4、重組鼠粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)購自美國Proteintech公司。小鼠IL-12及IL-10 ELISA試劑盒購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司。二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司。超凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備廠。臺式高速離心機(jī)購自美國Eppendorf公司。倒置相差顯微鏡購自日本olympus公司。電子天平購自上海天平儀器廠。流式細(xì)胞儀購自美國Becton-Dickinson FACS Calibur公司。

1.2 TIDCs的誘導(dǎo)培養(yǎng)及鑒定 將對數(shù)生長期的黑色素瘤細(xì)胞B16在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，收集上清即得B16細(xì)胞條件培養(yǎng)基，經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾后分裝并于-80 ℃保存?zhèn)溆肹12]。BALB/c小鼠脫頸處死，剝離出完整的股骨，從股骨中收集細(xì)胞懸液培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中，加入IL-4和重組鼠GM-CSF，37 ℃培養(yǎng)48 h后去除非貼壁細(xì)胞，重新加入含有IL-4及重組鼠GM-CSF的RPMI1640培養(yǎng)基，隔天換液，誘導(dǎo)培養(yǎng)至第5天時，加入50% B16細(xì)胞條件培養(yǎng)基繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d，用倒置相差顯微鏡拍照鑒定TIDCs。

1.3 TIDCs中CD11c、CD86、MHCⅡ和IL-12、IL-10的檢測方法 將培養(yǎng)鑒定后的TIDCs接種于96孔板中，分別將0、10、20、40 μmol/L的TP5加入TIDCs中，記為0 μmol/L組、10 μmol/L組、20 μmol/L組、40 μmol/L組，37 ℃共同孵育48 h，分離出TIDCs細(xì)胞和上清液。取收集到的TIDCs細(xì)胞，PBS洗滌2遍后加入冰預(yù)冷的PBS 100 μL與大鼠血清10 μL，4 ℃封閉30 min，加入熒光標(biāo)記的CD11c、CD86及MHCⅡ抗體，4 ℃孵育45 min，PBS洗滌2遍，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，以平均熒光強(qiáng)度值表示TIDCs表面CD11c、CD86、MHCⅡ的表達(dá)量。取TIDCs細(xì)胞上清液，按ELISA試劑盒說明書測定TIDCs中IL-2和IL-10。

1.4 TP5 與TIDCs的結(jié)合情況觀察 向TIDCs細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入FITC 標(biāo)記的1μg/mL TP5溶液200 μL，37 ℃孵育2 h，PBS洗滌后用4%中性多聚甲醛溶液固定，然后加入細(xì)胞核染料Hoechst 33342，室溫染色10 min，PBS洗滌后加入抗熒光淬滅劑200 μL，激光共聚焦顯微鏡下觀察TP5與TIDCs的結(jié)合情況。

2 結(jié)果

2.1 TIDCs的誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果 倒置相差顯微鏡低倍鏡下可見細(xì)胞聚集成集落的細(xì)胞群，呈半貼壁狀態(tài)(圖1A)；高倍鏡下可見細(xì)胞已經(jīng)呈現(xiàn)典型的樹突狀形態(tài)(圖1B)，有的細(xì)胞出現(xiàn)短的出芽狀突起，有的細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)長長的突起，提示TIDCs誘導(dǎo)培養(yǎng)成功。

注：A為低倍鏡下(×40)的TIDCs細(xì)胞；B為高倍鏡下(×100)的TIDCs細(xì)胞。

圖1倒置相差顯微鏡下B16細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的TIDCs細(xì)胞形態(tài)

2.2 TIDCs中CD11c、CD86、MHCⅡ和IL-12、IL-10的表達(dá)量比較 結(jié)果見表1。

表1 TIDCs中CD11c、CD86、MHCⅡ和IL-12、IL-10的表達(dá)量比較

注：與0 μmol/L組相比，﹡P<0.05；與10 μmol/L組相比，﹟P<0.05；與20 μmol/L相比，△P<0.05。

2.3 TP5 與TIDCs的結(jié)合情況 激光共聚焦顯微鏡下可見，TIDCs的細(xì)胞核呈橢圓形，F(xiàn)ITC標(biāo)記的TP5分布在細(xì)胞核周圍，提示TP5結(jié)合在TIDCs的細(xì)胞膜上及胞質(zhì)中。

3 討論

腫瘤的治療是世界性的難題，這主要與腫瘤細(xì)胞所處的復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境有關(guān)。腫瘤微環(huán)境中不僅有腫瘤細(xì)胞，還有很多免疫細(xì)胞，如效應(yīng)T細(xì)胞、TIDCs、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等。研究[13]發(fā)現(xiàn)，腫瘤病灶中的TIDCs并不能產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)而影響腫瘤的生長，說明腫瘤組織中的TIDCs 出現(xiàn)功能受損。TIDCs 的功能受損是多方面的，如表達(dá)于TIDCs上的共刺激分子B7-H3能夠抑制CD4+T 淋巴細(xì)胞活化以及IFN-γ、IL-4等細(xì)胞因子的產(chǎn)生發(fā)揮抑制作用[14]；γδTreg 細(xì)胞可以誘導(dǎo)DC細(xì)胞衰老，從而影響其功能[15]；腫瘤細(xì)胞可以通過釋放IL-10、IL-6、GM-CSF、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、VEGF等細(xì)胞因子阻礙DCs的分化和抗原提呈功能。此外，腫瘤細(xì)胞一方面可以直接激活髓樣抑制細(xì)胞(MDSC)使腫瘤細(xì)胞逃逸免疫監(jiān)視[16]，另一方面能通過分泌吲哚-2, 3-雙加氧酶等多種因子促使DCs分化成高分泌IL-6、TNF-α的細(xì)胞，促進(jìn)2型輔助性T細(xì)胞(Th2)分化，影響細(xì)胞免疫在抗腫瘤中的作用。因此，應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑來促進(jìn)TIDCs的成熟與活化在抵抗腫瘤生長方面具有重要意義。TP5保留了胸腺生成素Ⅱ的生物活性，具有雙向調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能，能使過強(qiáng)或受到抑制的免疫反應(yīng)趨向于正常，同時其對機(jī)體免疫功能低下、自身免疫疾病具有很好的調(diào)節(jié)作用。對于癌癥或感染性疾病患者而言，TP5是有效的細(xì)胞因子，體外和體內(nèi)的早期研究[17]結(jié)果已證明其在宿主和適應(yīng)性細(xì)胞免疫應(yīng)答中具有免疫調(diào)節(jié)的作用。

DCs能夠分泌多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子在促進(jìn)DCs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用方面具有重要作用。CD11c是高表達(dá)于DCs上的跨膜糖蛋白，其作為靶向受體，參與腫瘤抗原的捕捉和呈遞，并能有效刺激 CD4+T細(xì)胞增殖、活化，分泌 IL-2。研究[18]顯示，CD11c還可誘導(dǎo) CD8+T細(xì)胞活化，分泌高水平的干擾素 IFN-γ，從而增強(qiáng) T 細(xì)胞的細(xì)胞毒功能，抑制腫瘤的形成和進(jìn)展。CD86是表達(dá)于DCs、單核細(xì)胞及激活的T細(xì)胞上的分子，能提供T細(xì)胞活化所需的共刺激信號，在誘導(dǎo)CTLs的產(chǎn)生及功能的發(fā)揮方面具有重要作用。MHCⅡ表達(dá)于B細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞和DCs等抗原遞呈細(xì)胞上，其功能主要是在免疫應(yīng)答的始動階段將經(jīng)過處理的抗原片段遞呈給CD4+T細(xì)胞，MHCⅡ的表達(dá)量體現(xiàn)了細(xì)胞抗原遞呈能力的強(qiáng)弱。IL-12主要由DCs、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和B細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞分泌，是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的紐帶[19]。IL-10是一種Th2型細(xì)胞因子，是目前發(fā)現(xiàn)的一個重要的免疫抑制性下調(diào)因子，能直接抑制T細(xì)胞的功能，還能抑制CD86、CD80等共刺激分子的表達(dá)，從而抑制抗原遞呈的功能。在本研究中，TIDCs經(jīng)TP5作用后表達(dá)共刺激分子的能力顯著提高，IL-12分泌量逐漸提高，說明TIDCs被TP5活化。相反，IL-10的分泌量卻隨TP5濃度的升高而逐漸減少，可能原因是TP5促進(jìn)了IL-12的分泌，增加的IL-12進(jìn)而抑制了IL-10的分泌。

本研究結(jié)果顯示，TP5可促進(jìn)TIDCs表面成熟標(biāo)志分子CD11c、CD86及MHCⅡ的表達(dá)，促進(jìn)TIDCs分泌IL-12及抑制IL-10的分泌，表明TP5能夠激活免疫活性受抑制的TIDCs的抗原遞呈功能，在特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。