楊雁嫦 林啟 袁晴 葉蕾 朱佩文 閔幼蘭 石文卿 黎彪 李清海 邵毅

干眼是目前常見的眼科疾病[1]，輕者可引起眼部癥狀，重者導(dǎo)致角膜上皮受到侵害并形成角膜新生血管等，更甚者可導(dǎo)致盲[2]。H2具有選擇性抗氧化作用，是目前公認(rèn)的沒有毒副作用的最優(yōu)抗氧化劑[3]，此外還具有抗炎癥[4]﹑抗過敏[5]、抗凋亡[6]等作用。近年來H2對(duì)眼科疾病的治療取得了新進(jìn)展，如對(duì)白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激角膜內(nèi)皮損傷的預(yù)防作用[7]，對(duì)角膜新生血管的抑制作用[8]等。那么H2對(duì)眼表會(huì)產(chǎn)生什么影響呢？本研究旨在探究H2滴眼液對(duì)小鼠眼表組織結(jié)構(gòu)的影響，為臨床治療干眼提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取6～8周齡SPF級(jí)體質(zhì)量(20±2)g的BALB/c雄性小鼠30只，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。在室溫25 ℃，濕度60%及12 h明暗周期中(早上800到晚上800)飼養(yǎng)小鼠[9]。本研究過程對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和喂養(yǎng)均符合動(dòng)物倫理學(xué)并遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2苯扎溴銨滴眼液和H2滴眼液的制備將苯扎溴銨稀釋于無菌PBS中，濃度為1 g·L-1，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。H2滴眼液：利用怡水科技水輕輕水素水杯，倒水50 mL并擰上機(jī)身后將其倒置，一鍵制氫，使氫氧完全分離，高速制氫。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图胺纸M將小鼠使用隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各12只，均以右眼作為實(shí)驗(yàn)眼，6只不作處理作為空白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)組先采取1 g·L-1苯扎溴銨滴眼液+H2滴眼液滴眼，對(duì)照組則采用1 g·L-1苯扎溴銨滴眼液與生理鹽水滴眼，中間均間隔10 min，每天重復(fù)4次。在干預(yù)前及干預(yù)后1 d、7 d、14 d分別觀察各組小鼠的淚膜破裂時(shí)間(tear break-up time，BUT)、基礎(chǔ)淚液分泌試驗(yàn)(schirmer Ⅰ test，SⅠt)及角膜熒光素染色(fluorescent test，F(xiàn)L)評(píng)分，并于干預(yù)14 d后取小鼠眼球備用。

1.3.2SⅠt檢測(cè)在小鼠右眼外眥中外1/3交點(diǎn)的地方放置酚紅棉線的一端，并計(jì)時(shí)1 min。利用儀器測(cè)出紅色部分的長(zhǎng)度，換算為淚液分泌量。實(shí)驗(yàn)應(yīng)該讓同一個(gè)技師在相同的條件下(時(shí)間、地點(diǎn)、照明亮度、濕度及溫度)進(jìn)行操作[10]。

1.3.3BUT檢測(cè)根據(jù)文獻(xiàn)[9]，使用1滴熒光素鈉滴眼液滴眼并瞬目，隨后記錄角膜染色區(qū)出現(xiàn)第一個(gè)破裂點(diǎn)的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)應(yīng)該讓同一技師在相同的條件下(時(shí)間、地點(diǎn)、照明亮度、濕度及溫度)進(jìn)行操作。

1.3.4FL評(píng)分FL評(píng)分參考文獻(xiàn)[11]，目的是觀察小鼠角膜上皮的缺損程度。實(shí)驗(yàn)由同一技師在相同的條件下進(jìn)行操作。

1.3.5電子顯微鏡下觀察角膜上皮細(xì)胞將兩組小鼠右眼球置于體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛內(nèi)2～4 h，10 g·L-1鋨酸固定1～2 h；梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂浸透、修塊，枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾雙染，并在電鏡下觀察角膜上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用χ2檢驗(yàn)計(jì)數(shù)資料；各組計(jì)量指標(biāo)比較采用t檢驗(yàn)及Dunnett檢驗(yàn)，α=0.05。

2結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組干預(yù)前后各指標(biāo)評(píng)定結(jié)果干預(yù)1 d后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組SⅠt與干預(yù)前相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)；兩組SⅠt相比，差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)7 d、14 d后，實(shí)驗(yàn)組SⅠt與干預(yù)前相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)，而對(duì)照組SⅠt與干預(yù)前相比明顯減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；兩組SⅠt相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組SⅠt均大于對(duì)照組。見表1。

表1干預(yù)前和干預(yù)后各時(shí)段兩組SⅠt比較

注：與實(shí)驗(yàn)組相比，*P<0.05；與干預(yù)前相比，#P< 0.05

干預(yù)1 d后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組BUT與干預(yù)前相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)；兩組BUT相比，差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)7 d、14 d后，實(shí)驗(yàn)組BUT與干預(yù)前相比無明顯變化，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)，而對(duì)照組與干預(yù)前相比明顯減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；兩組BUT相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組BUT均長(zhǎng)于對(duì)照組。見表2。

表2干預(yù)前和干預(yù)后各時(shí)段兩組BUT情況

注：與實(shí)驗(yàn)組相比，*P<0.05；與干預(yù)前相比，#P< 0.05

實(shí)驗(yàn)組干預(yù)1～14 d角膜變化不明顯(圖1A至D)，對(duì)照組干預(yù)1～14 d后角膜FL染色區(qū)域增加(圖1E至H)。采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析不同時(shí)間點(diǎn)間實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組干預(yù)前和干預(yù)1 d、7 d和14 d后FL評(píng)分有差異(P=0.025)；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組FL評(píng)分有差異(P=0.009)，對(duì)照組較實(shí)驗(yàn)組角膜上皮破壞明顯。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的FL評(píng)分變化趨勢(shì)也有明顯差異(F=8.552，P=0.007)。干預(yù)后 4 d 和 7 d，兩組FL評(píng)分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，對(duì)照組均高于實(shí)驗(yàn)組。見表3。

表3干預(yù)后各時(shí)段兩組FL評(píng)分情況

注：與實(shí)驗(yàn)組相比，*P< 0.05

圖1兩組小鼠干預(yù)1 d、7 d和14 d 后FL染色情況。A：實(shí)驗(yàn)組滴眼前，角膜熒光染色呈陰性；B：實(shí)驗(yàn)組滴眼1 d，角膜可見極少量點(diǎn)狀染色；C：實(shí)驗(yàn)組滴眼7 d，角膜可見少量點(diǎn)狀染色；D：實(shí)驗(yàn)組滴眼14 d，角膜仍可見少量點(diǎn)狀染色；E：對(duì)照組滴眼前，角膜熒光染色呈陰性；F：對(duì)照組滴眼1 d，角膜可見極少量點(diǎn)狀染色；G：對(duì)照組滴眼7 d，角膜可見較多的點(diǎn)狀染色；H：對(duì)照組滴眼14 d，角膜可見部分區(qū)域大片狀染色

2.2電鏡下角膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變?cè)诘捅峨婄R下觀察，實(shí)驗(yàn)組角膜上皮細(xì)胞為多角形，細(xì)胞邊緣較直，表面可見密集排列的微絨毛和微皺襞；而對(duì)照組角膜上皮細(xì)胞表面不規(guī)則，存在表層上皮細(xì)胞脫落的情況，表面微絨毛、微皺襞部分平坦或出現(xiàn)融合、缺失。見圖2。

3討論

干眼是較為常見的眼科疾病，是一種由于淚液的異常而引起的眼部不適癥狀。目前干眼的主要治療方法包括眼瞼清潔、淚液補(bǔ)充、抗炎治療及手術(shù)等[12]，對(duì)干眼的診治還沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。近年來，研究顯示，H2具有抗氧化性[3]、抗炎癥[4]、抗過敏[5]、抗凋亡[6]等作用。一方面與羥自由基(OH-)和過氧亞硝基陰離子(ONOO-)反應(yīng)發(fā)揮選擇性抗氧化作用；另一方面通過調(diào)控炎癥因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α等起到抗炎作用。在本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組采用 1 g·L-1苯扎溴銨滴眼液和H2滴眼液滴眼，對(duì)照組采用1 g·L-1苯扎溴銨滴眼液和生理鹽水滴眼，均間隔10 min，每天4次。連續(xù)給藥14 d；數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)，用H2滴眼液干預(yù)7 d、14 d后，對(duì)照組SⅠt、BUT、FL評(píng)分較干預(yù)前明顯惡化，而實(shí)驗(yàn)組無明顯變化。實(shí)驗(yàn)組干預(yù)1～14 d角膜變化不明顯且細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)無明顯變化；對(duì)照組整個(gè)FL染色區(qū)域明顯增加，呈點(diǎn)片狀著染，角膜上皮細(xì)胞表面可見表層細(xì)胞部分脫落。一項(xiàng)臨床調(diào)查顯示，使用含苯扎溴銨滴眼液的患者，干眼癥患病率高，且隨著滴眼劑用量的增加，患病率也增加[13]。

圖2兩組角膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)情況。A：實(shí)驗(yàn)組角膜上皮細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞邊緣較直；B：對(duì)照組角膜上皮細(xì)胞表面可見表層細(xì)胞部分脫落

此外它還會(huì)對(duì)眼表面組織和細(xì)胞有不同程度損傷[14]，這些實(shí)驗(yàn)均與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著很大的相似性。而在應(yīng)用H2后，實(shí)驗(yàn)組眼表的相關(guān)指標(biāo)有了明顯好轉(zhuǎn)，說明H2滴眼液能維持淚膜的穩(wěn)定性和小鼠角膜上皮的完整性，對(duì)干眼起到一定的預(yù)防作用。

對(duì)于干眼，長(zhǎng)期性的激素類藥物治療可導(dǎo)致眼壓升高、機(jī)會(huì)性感染、角膜穿孔等，同時(shí)還增加了罹患并發(fā)癥的幾率。而H2的獲取方便且價(jià)格低廉，對(duì)人體無明顯毒副作用，為干眼的治療提供了一種嶄新的策略。