任曉亮,王冰霜,趙學(xué)濤,曹娜娜,王 坤,趙 亮

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院,河北 石家莊 050011)

原發(fā)性肝癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和致死率。目前，手術(shù)切除仍然是治療早期肝癌的首選，但總體預(yù)后欠佳，可能與抗腫瘤免疫缺陷及細(xì)胞免疫功能紊亂有關(guān)[1]。由于正常肝組織減少，肝臟合成凝血因子能力降低，導(dǎo)致凝血機(jī)制異常，故對于侵犯血管或腫瘤較大的肝癌患者，圍術(shù)期異體輸血(allogeneic blood transfusions, ABT)仍是常用的輔助治療手段。研究表明，異體血中殘留的白細(xì)胞及血清中的生物活性分子可能通過輸血相關(guān)免疫調(diào)節(jié) (transfusion-related immunomodulation, TRIM) 進(jìn)一步抑制腫瘤患者的細(xì)胞免疫功能，增加術(shù)后感染率及病死率[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過規(guī)定劑量的射線輻照，可使具有免疫活性的淋巴細(xì)胞失去植活、增殖的能力，輸注輻照血液制品可有效預(yù)防輸血相關(guān)性移植物抗宿主病(transfusion associated graft versus host disease , TA-GVHD)[3], 但對于腫瘤患者細(xì)胞免疫功能的影響報道較少。本研究旨在觀察輸注輻照紅細(xì)胞對肝癌患者CD4+T細(xì)胞亞群分化及相關(guān)因子的影響，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 臨床資料

1.1一般資料 本研究對象為2015年2月—2016年12月來我院接受根治手術(shù)的肝癌患者64例，術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)確診為肝癌，TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期，均無輸血史及自身免疫性疾病，術(shù)前未接受放、化療。根據(jù)患者術(shù)中是否輸注輻照懸浮紅細(xì)胞分為2組：輻照組38例，男17例，女21例；年齡40～69歲；TNM分期Ⅰ期15例，Ⅱ期23例。未輻照組26例，男15例，女11例；年齡43～71歲；TNM分期Ⅰ期10例，Ⅱ期16例。2組患者性別、年齡、TNM分期比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2輸血方法 輻照組輸入經(jīng)137Cs γ射線照射的異體懸浮紅細(xì)胞，輻照劑量為25 Gy；未輻照組輸入普通異體懸浮紅細(xì)胞。2組患者用血量均為2～4 IU，均為5 d以內(nèi)CPDA庫存懸浮紅細(xì)胞，未輸入血漿等其他血液成分。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1Thl、Th2細(xì)胞比率 分別于輸血前及輸血后14 d采集2組患者外周靜脈血5 mL，肝素鈉抗凝。取全血樣本0.5 mL，加入等量刺激劑(PMA、ionomycin、BFA和RPMI1640)，將細(xì)胞分別移至實驗管和對照管中，加入CD4-PerCP-Cy5.5 10 μL混勻，避光，孵育20 min；加入溶血素1 mL，混勻，避光，孵育10 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清；加入破膜劑200 μL，避光，4 ℃孵育20 min，PBS洗滌，離心，棄上清。實驗管加入IFN-γ-FITC和IL-4-PE各5 μL，對照管加同型對照抗體，避光，4 ℃孵育30 min。以4%多聚甲醛液固定，流式細(xì)胞儀檢測Thl、Th2細(xì)胞比率。

1.3.2Th17細(xì)胞比率 分別于輸血前及輸血后14 d采集2組患者外周靜脈血5 mL，EDTA抗凝，等量PBS緩沖液稀釋并混勻，加入Ficoll液分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，用含10%胎牛血清的RPMI1640(Gibco公司)重懸細(xì)胞。將細(xì)胞移至24孔板中，加入PMA、ionomycin、BFA，調(diào)整終濃度分別為50 ng/mL、1 μg/mL和10 μg/mL，在37 ℃、5% CO2條件下刺激培養(yǎng)4 h。將細(xì)胞移至試管中，分別加入FITC-Anti-Human CD4，同型對照管加入等量同型抗體，避光，4 ℃孵育30 min。用100 μL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，加入1 mL 固定劑，避光，4 ℃孵育30 min。加入2 mL破膜劑離心棄上清，測定管加入PE-Anti-Human IL-17A，同型對照管加入等量同型抗體，避光，4 ℃孵育30 min。再次洗滌后，以0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測Th17細(xì)胞比率。

1.3.3Treg細(xì)胞比率 血樣采集及細(xì)胞培養(yǎng)同1.3.2。將培養(yǎng)的細(xì)胞移至試管中，測定管分別加入FITC-Anti-Human CD4 和 APC-Anti-Human CD25，避光，4 ℃孵育30 min；PBS洗滌后重懸細(xì)胞，加入固定劑1 mL，避光，4 ℃孵育30 min；破膜劑2 mL洗2次，用正常大鼠血清封閉15 min，測定管加入PE-Anti-Human Foxp3，同型對照管為等量PE-rat IgG2a，避光，4 ℃孵育30 min；再次洗滌后，以0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測Treg細(xì)胞比率。流式細(xì)胞檢測所用抗體及相應(yīng)試劑購于eBioseience公司。

1.3.4外周血細(xì)胞因子水平 分別于輸血前及輸血后14 d采集2組患者外周靜脈血5 mL，不加抗凝劑，離心后取血清2～3 mL，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測樣本中白細(xì)胞介素-2(IL-2)、干擾素-γ (IFN-γ)、IL-4、IL-6、IL-17和IL-10水平。ELISA試劑盒購于深圳晶美公司，實驗嚴(yán)格按說明書要求操作。

2 結(jié) 果

2.12組患者輸血前后外周血Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞比率比較 輸血后14 d,輻照組Th1細(xì)胞比率、Th2細(xì)胞比率、Th1/Th2比值、Th17細(xì)胞比率、Treg細(xì)胞比率、Th17/Treg比值與輸血前比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；未輻照組外周血Th1細(xì)胞比率、Th1/Th2比值、Th17/Treg比值均明顯低于輸血前及輻照組(P均<0.05)，Th2細(xì)胞比率、Treg細(xì)胞比率均明顯高于輸血前及輻照組(P均<0.05)，2組Th17細(xì)胞比率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組患者輸血前后外周血Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞比率比較

注：①與輸血前比較，P<0.05；②與輻照組比較，P<0.05。

2.22組患者輸血前后血清細(xì)胞因子水平比較 輸血后14 d,輻照組血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-17及IL-10水平與輸血前比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；未輻照組血清IL-2、IFN-γ水平均顯著低于輸血前及輻照組(P均<0.05)，IL-4、IL-6、IL-17、IL-10水平均顯著高于輸血前及輻照組(P均<0.05)。見表2。

3 討 論

表2 2組患者輸血前后血清細(xì)胞因子水平比較

注：①與輸血前比較，P<0.05；②與輻照組比較，P<0.05。

T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫功能的重要組成部分。活化CD4+T細(xì)胞可進(jìn)一步分化為Thl、Th2、Thl7和Treg4類亞群，組成Th1/Th2、Th17/Treg兩對動態(tài)平衡，在機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，對抗腫瘤免疫和耐受機(jī)制、腫瘤免疫微環(huán)境以及惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后至關(guān)重要[4]。Th1細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫，主要分泌IL-2、腫瘤壞死因子(TNF-α)及IFN-γ等，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制血管生成，具有激活抗腫瘤活性的作用；Th2細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫，主要分泌IL-4、IL-5及IL-6，可抑制細(xì)胞免疫，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。其中IL-2、IL-4及IFN-γ相互拮抗維持Th1/Th2平衡。Thl7細(xì)胞主要分泌IL-2及TNF-α等多種細(xì)胞因子；Treg細(xì)胞作為免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞可通過分泌IL-10等細(xì)胞因子下調(diào)機(jī)體腫瘤免疫應(yīng)答，抑制機(jī)體抗腫瘤免疫作用。二者的功能和分化過程相互拮抗維持Th17/Treg平衡。研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌[5]、非小細(xì)胞肺癌[6]、乳腺癌[7]及淋巴瘤[8]等惡性腫瘤中存在Th1細(xì)胞比例減少，相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)降低，Th2細(xì)胞因子呈優(yōu)勢表達(dá)的失衡現(xiàn)象，并且隨著腫瘤惡性程度增加偏移更加明顯。Ormandy 等[9]發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌患者存在Treg細(xì)胞的過量表達(dá)，而Treg細(xì)胞的增加及功能增強(qiáng)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移，影響預(yù)后[10]。目前，由于Th17細(xì)胞因子來源的多樣性，作用機(jī)制也較復(fù)雜，在腫瘤中的效應(yīng)功能至今尚存爭議[11]。

本研究中，輸血后14 d輻照組Th1細(xì)胞比率、Th2細(xì)胞比率、Th1/Th2比值、Th17細(xì)胞比率、Treg細(xì)胞比率、Th17/Treg比值及血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-17、IL-10水平與輸血前比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；未輻照組外周血Th1細(xì)胞比率、Th1/Th2比值、Th17/Treg比值和血清IL-2、IFN-γ水平均明顯低于輸血前及輻照組，Th2細(xì)胞比率、Treg細(xì)胞比率及血清IL-4、IL-6、IL-17、IL-10水平均明顯高于輸血前及輻照組。說明輸注輻照血對肝癌患者CD4+T細(xì)胞的免疫功能影響較小。本研究未能對IL-17細(xì)胞的詳細(xì)來源進(jìn)行流式分析，Th17細(xì)胞比例總體呈下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

既往研究顯示，同種異體輸血對腫瘤患者的特異性和非特異性免疫均有明顯抑制作用，可增加腫瘤的復(fù)發(fā)率[12]，縮短患者的術(shù)后生存期[13]。Bilgin等[14]認(rèn)為，血液中引起免疫抑制的主要成分是白細(xì)胞和血漿，輸去白細(xì)胞異體血的患者術(shù)后感染率及病死率均低于未去白組。本課題組之前研究中發(fā)現(xiàn)，輸全血及血漿的肝癌患者外周血中Treg 細(xì)胞比輸洗滌紅細(xì)胞的患者明顯增高，提示與輸注供者的白細(xì)胞和血漿成分有關(guān)[15]。

本研究結(jié)果顯示，輸輻照血液制品可避免上述風(fēng)險，并可降低輸注普通紅細(xì)胞對腫瘤患者免疫功能的抑制作用，值得推廣使用。