李冰玲,劉艷華,李炎鑫,史喜菊,劉全國,徐立偉

(北京檢驗檢疫技術(shù)中心,北京 朝陽 100026)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)與水皰性口炎(Vesicular stomatitis,VS)在臨床癥狀上十分相似,無法通過臨床診斷進(jìn)行區(qū)分,因此用實驗室方法對兩種疾病進(jìn)行鑒別診斷和病毒分型就變得十分重要。此外,動物可能由于易感性較低或者獲得部分免疫導(dǎo)致無癥狀或癥狀不明顯,因此需要建立多種檢測方法以對臨床病例進(jìn)行確診,鑒別感染后康復(fù)動物以及無明顯臨床癥狀的病例。實驗室檢測亦可確保對疾病的及時介入和對疫情的有效防控,而通過病毒分型能夠確定傳播途徑以及選擇合適的疫苗株。實驗室檢測結(jié)果也是國家制定持續(xù)的監(jiān)測計劃以快速識別疫病的入侵、進(jìn)行運輸控制以及實施根除計劃以切斷傳播途徑的依據(jù)。本文主要介紹幾種國際上常用的實驗室檢測方法及研究進(jìn)展。

1 基于形態(tài)學(xué)的鑒別

可依據(jù)微核糖核酸屬的口蹄疫病毒和彈狀病毒屬的水皰性口炎病毒在形態(tài)學(xué)上的不同,通過電子顯微鏡對大量存在于水皰液和水皰上皮中的病毒粒子進(jìn)行鑒別。

2 病毒分離

FMD病毒首選的易感細(xì)胞為牛胸腺原始細(xì)胞,豬、綿羊或小牛腎原始細(xì)胞,其他的比較敏感的細(xì)胞系如BHK-21和IB-RS-2也可用來進(jìn)行病毒培養(yǎng),但是在檢測低劑量感染時其敏感性不如上述原始細(xì)胞。VS病毒可采用Vero、BHK-21和IB-RS-2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。待培養(yǎng)物上形成細(xì)胞病變后,收集培養(yǎng)液即可以進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗、補體結(jié)合試驗或者逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測?？蛇M(jìn)行病毒分離的樣品范圍很廣,包括水皰上皮,食道-咽部分泌液(OP液),奶和血清[1]。

VSV也可以通過接種雞胚進(jìn)行分離。將病毒接種到8～10日齡的雞胚尿囊膜中使其復(fù)制,再進(jìn)行病毒分離。除酶聯(lián)免疫吸附試驗、補體結(jié)合試驗和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法外,也可以采用病毒中和試驗對細(xì)胞培養(yǎng)物或接種雞胚進(jìn)行檢測,但該方法比較繁瑣且費時較長,且前提是可以獲得NJ型和IND型的陽性血清[2]。

3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)

ELISA檢測FMD抗原可檢測來自水皰的樣品,以及通過細(xì)胞或組織培養(yǎng)進(jìn)行擴增后的其他部位的樣品。常用于檢測FMDV抗體的阻斷ELISA和競爭ELISA,都是采用型特異性多克隆抗體或單克隆抗體,便捷快速,敏感性高,并且無需活病毒和細(xì)胞培養(yǎng)。感染FMDV后血清中會迅速產(chǎn)生抗體,ELISA方法可以通過對幾種抗體(IgM,結(jié)構(gòu)蛋白(Structural protein,SP)抗體,非結(jié)構(gòu)蛋白(Nonstructural protein,NSP)抗體的聯(lián)合檢測估計個體或群體的感染程度和感染時間。近幾年建立起的IgA檢測方法可檢測正在進(jìn)行的病毒復(fù)制,可分辨出康復(fù)期動物是否是病毒攜帶者,并且可以區(qū)分感染和疫苗接種。近年來關(guān)于ELISA方法檢測FMDV的研究很多,在抗原檢測方面,Morioka等(2014)報道了一種新型的直接 ELISA,其表現(xiàn)優(yōu)于傳統(tǒng)的間接ELISA[3]。在抗體檢測方面,有采用重組抗原代替病毒抗原的研究報道[4];Chen等(2013)建立了非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的化學(xué)發(fā)光試驗[5]。

ELISA方法也可用于檢測動物血清中的VSV抗體。用印第安納血清型的3種亞型的代表毒株制備的兔或者豚鼠多價抗血清,可以鑒別出水皰性口炎病毒印第安納血清型的所有毒株。而對水皰性口炎新澤西血清型的鑒別則需要兔或者豚鼠的單克隆抗體[2]。用競爭ELISA方法檢測VSV抗體,單克隆抗體作為競爭抗體比多價抗血清具有更好的特異性,且檢測結(jié)果也更具有一致性[6]。

4 補體結(jié)合試驗(Complement fixation test,CFT)

CFT可用于檢測FMD和VS。但與CFT方法相比,ELISA方法更具有優(yōu)越性。在大多數(shù)實驗室,ELISA已經(jīng)替代CFT,因為ELISA更加敏感和特異,并且不受前補體因子和抗補體因子的影響。在不可獲得ELISA試驗所需試劑的時候,可以采用CFT。CFT也可被用來對早期產(chǎn)生的抗體進(jìn)行定量,主要是IgM抗體。CFT適用的檢測樣品包括水皰上皮懸液、水皰液或細(xì)胞培養(yǎng)物上清液,但其敏感性不適合于OP樣品或血清的直接檢測[1-2]。

5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)

RT-PCR方法是OIE推薦的用于FMD臨床病例確診的方法之一,也可用于VS臨床病例的確診。與普通RT-PCR相比,實時熒光RT-PCR更適合大批量的樣品檢測;而與病毒分離方法相比,該方法敏感性更高,但不能檢測出病毒是否具有感染性。

該方法可檢測的FMD樣品包括上皮、奶、血清和OP液中的病毒基因組片段[1]。Vangrysperre和De Clercq(1996)建立了用型特異性引物對FMDV進(jìn)行分型的RT-PCR方法[7]。目前在很多實驗室廣泛應(yīng)用的是更加便捷的一步法實時熒光PCR。

RT-PCR適用的VS樣品包括組織、水皰液和病毒培養(yǎng)物,該方法僅用于出現(xiàn)VS臨床癥狀的病例的診斷,并不是對VS進(jìn)行篩查的常規(guī)方法。該方法的陽性檢測結(jié)果有診斷意義,陰性結(jié)果并不代表動物未感染,而可能是由于感染階段、感染程度、樣品狀態(tài)等原因?qū)е碌臋z測結(jié)果陰性。

由于多重RT-PCR方法具有敏感、快速的特點,并且該方法可對不同的病毒、同種病毒的不同血清型進(jìn)行區(qū)分,目前已成為國內(nèi)外相關(guān)實驗室的研究熱點。William C.(2009)和Kate Hole(2010)分別建立了可以區(qū)分水皰性口炎NJ型和IND型病毒的多重實時熒光RT-PCR[8-9]。Jovita Fernandez(2007)建立了可以區(qū)別診斷口蹄疫、豬水皰病和水皰性口炎的三重實時熒光RT-PCR[10]。

6 試紙條方法(Lateral flow devices,LFDs)

試紙條方法適用的檢測樣品有水皰上皮懸液、水皰液或細(xì)胞培養(yǎng)物上清液,但是其敏感性不足以用于OP樣品或血清的直接檢測。

目前已經(jīng)有一些商品化的檢測FMDV病原的試紙條,也有可以檢測和區(qū)分FMDV的O型、A型和Asia-1型的試紙條。盡管試紙條方法尚未經(jīng)過OIE的方法確認(rèn)程序,但該方法簡便、快速,便于田間檢測,其應(yīng)用將使那些實驗室資源不足的國家受益匪淺。試紙條方法還可以將FMDV病原以一種干燥、無風(fēng)險的狀態(tài)運輸?shù)綄嶒炇?用于核酸擴增、測序和病毒復(fù)蘇等,以進(jìn)行進(jìn)一步的診斷。

Ferris等(2012)采用單克隆抗體C1和F25VSVNJ-45分別建立了檢測水皰性口炎IND型和NJ型的試紙條方法,該試紙條可以檢出VSVIND-1亞型和 VSV-NJ亞型,但不與 VSV-IND-2和VSV-IND-3亞型反應(yīng),也不與口蹄疫病毒和豬水皰病病毒反應(yīng)[11]。

7 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Reverse transcriptionloop mediated isothermal amplification,RT-LAMP)

RT-LAMP方法的建立是分子診斷技術(shù)的重大進(jìn)展。RT-LAMP快速、簡便、經(jīng)濟,其敏感性和特異性與RT-PCR相當(dāng),且可在便攜式設(shè)備上進(jìn)行,方便田間快速診斷。目前已有多個實驗室建立了檢測FMDV單個或多個血清型的RT-LAMP方法。Fowler等(2016)建立了檢測VSV-NJ型病毒的RT-LAMP方法[12]。

8 其他方法

使用特異性引物,然后用擴增出的病毒RNA產(chǎn)物進(jìn)行測序,就可以得到該毒株的序列信息。測序方法不僅可以測出主要感染毒株的核酸序列,也可以測出樣品中少量變異株的核酸序列。對核酸序列的測定可以了解宿主內(nèi)病毒的進(jìn)化和選擇過程,從而進(jìn)一步了解FMDV在宿主體內(nèi)的動態(tài),并可以在疫病爆發(fā)時迅速找到匹配的疫苗。Logan等(2014)建立了一種對FMDV全基因組的實驗室大規(guī)模測序方法[13]。

使用適當(dāng)標(biāo)記的引物,RT-PCR和RT-LAMP的產(chǎn)物可以用試紙條方法來檢測。有研究表明,FMDV氣體樣品和上皮懸液樣品都可以用RT-LAMP/LFDs聯(lián)合方法檢出,該聯(lián)合方法靈敏度非常高,且不需要進(jìn)行前期的RNA提取,進(jìn)一步簡化了試紙條檢測方法的流程[3]。

紅外熱成像是利用口蹄疫的急性熱性的發(fā)病特點,篩選出可疑動物進(jìn)行實驗室診斷,適用于不同環(huán)境下的健康或患病動物群體的田間篩選。但該方法的結(jié)果是非特異性的,需要進(jìn)行進(jìn)一步的診斷。

酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)印(Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot,EITB)方法作為一種檢測FMD的血清學(xué)檢測方法在OIE診斷手冊中也有描述。該方法用重組非結(jié)構(gòu)蛋白3A,3B,2C,3D和3ABC來檢測待檢血清,在南美作為疫情監(jiān)測中的確診方法[1]。

9 展望

沒有有效的檢測方法就談不上對疫病的有效控制。應(yīng)根據(jù)不同目的選擇合適的檢測方法。同一方法在應(yīng)用于不同目的時,對結(jié)果的解釋也可能會不同。不同方法的結(jié)合使用可以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

口蹄疫和水皰性口炎的檢測技術(shù)還在不斷的進(jìn)步中,不斷發(fā)展的分子生物學(xué)方法和基因檢測技術(shù),以及新的分析方法都將有益于檢測技術(shù)的發(fā)展。目前一些檢測方法的費用、易操作性和生物安全方面的需求使一些實驗室無法開展更多的檢測技術(shù)。國內(nèi)由于缺乏水皰性口炎的血清學(xué)診斷試劑,免疫學(xué)診斷方法的建立和應(yīng)用也受到很大制約。因此,在資源不足的實驗室建立簡便經(jīng)濟的檢測方法應(yīng)該是目前的首要任務(wù)。對簡便有效的試紙條方法、敏感快速的RT-PCR方法和更加簡單經(jīng)濟的RT-LAMP方法的進(jìn)一步發(fā)展和完善,將是口蹄疫和水皰性口炎檢測方法研究的重要方向。